COVID-19: i medici dovrebbero aspettarsi una seconda ondata di infezioni da coronavirus da persone con risultati di test falsi negativi

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Man mano che i test COVID-19 diventano più ampiamente disponibili, è fondamentale che gli operatori sanitari e i funzionari della sanità pubblica ne comprendano i limiti e l’impatto che i risultati falsi possono avere sugli sforzi per frenare la pandemia.

Un articolo speciale pubblicato su  Mayo Clinic Proceedings  richiama l’attenzione sul rischio posto dall’eccessiva dipendenza dai test COVID-19 per prendere decisioni cliniche e di salute pubblica.

La sensibilità del test di reazione a catena della transcriptasi-polimerasi inversa (RT-PCR) e le caratteristiche generali delle prestazioni del test non sono state riportate in modo chiaro o coerente nella letteratura medica, dice l’articolo.

Di conseguenza, i funzionari sanitari dovrebbero aspettarsi una “seconda ondata di infezione meno visibile da parte di persone con risultati di test falsi negativi”, afferma Priya Sampathkumar, MD, specialista in malattie infettive presso la Mayo Clinic e co-autore di studi.

“Il test RT-PCR è molto utile quando è positivo”, afferma il dott. Sampathkumar.

“È meno utile per escludere COVID-19. Un test negativo spesso non significa che la persona non ha la malattia e i risultati del test devono essere considerati nel contesto delle caratteristiche e dell’esposizione del paziente. “

Anche con valori di sensibilità dei test fino al 90%, l’entità del rischio derivante dai risultati dei test falsi sarà sostanziale con l’aumentare del numero di persone testate.

“In California, le stime indicano che il tasso di infezione da COVID-19 potrebbe superare il 50% entro metà maggio 2020″, afferma.

“Con una popolazione di 40 milioni di persone, in California si prevedono 2 milioni di risultati falsi negativi con test approfonditi. Anche se fosse testato solo l’1% della popolazione, sarebbero attesi 20.000 risultati falsi negativi. “

Gli autori citano anche gli effetti sul personale sanitario. Se il tasso di infezione COVID-19 tra gli oltre 4 milioni di persone che forniscono assistenza diretta ai pazienti negli Stati Uniti fosse del 10% – molto al di sotto della maggior parte delle previsioni – sarebbero previsti più di 40.000 risultati falsi negativi se ogni fornitore fosse sottoposto a test.

Ciò comporta rischi per il sistema sanitario in un momento critico.

“Attualmente, le linee guida CDC (Centers for Disease Control and Prevention) per gli operatori sanitari asintomatici con test negativi potrebbero portare al loro immediato ritorno al lavoro nell’assistenza clinica di routine, che rischia di diffondere la malattia”, afferma Colin West, MD, Ph.D. , un medico della Mayo Clinic e il primo autore dello studio. Victor Montori, MD, endocrinologo della Mayo Clinic, è anche coautore.

Mentre si occupa dell’enormità della crescente pandemia di COVID-19 , è importante che i funzionari della sanità pubblica si attengano ai principi del ragionamento basato sull’evidenza riguardo ai risultati dei test diagnostici e ai falsi negativi.

Quattro raccomandazioni sono delineate nell’articolo della Mayo Clinic:

  1. Continuo rispetto rigoroso del distanziamento fisico, del lavaggio delle mani, della disinfezione delle superfici e di altre misure preventive, indipendentemente dal livello di rischio, dai sintomi o dai risultati dei test COVID-19. Potrebbe essere necessario un mascheramento universale sia degli operatori sanitari che dei pazienti.
  2. È necessario sviluppare urgentemente test altamente sensibili o combinazioni di test per ridurre al minimo il rischio di risultati falsi negativi. Sono necessari test RT-PCR e saggi sierologici migliori – esami del sangue che identificano gli anticorpi o le proteine ​​presenti quando il corpo risponde a infezioni come COVID-19 -.
  3. I livelli di rischio devono essere attentamente valutati prima del test e i risultati dei test negativi devono essere considerati con cautela, specialmente per le persone nei gruppi a rischio più elevato e nelle aree in cui è stata confermata la diffusa infezione da COVID-19.
    Sono necessari protocolli stratificati in base al rischio per gestire i risultati negativi dei test COVID-19, che devono evolversi man mano che diventano disponibili più statistiche.

“Per gli individui veramente a basso rischio, i risultati dei test negativi possono essere sufficientemente rassicuranti”, afferma il Dr. West. “Per gli individui ad alto rischio, anche quelli senza sintomi, il rischio di risultati di test falsi negativi richiede misure aggiuntive per proteggere dalla diffusione della malattia, come un autoisolamento prolungato”.

Alla Mayo Clinic, il test RT-PCR è “uno dei molti fattori che prendiamo in considerazione nel decidere se il paziente soddisfa i criteri per COVID-19”, afferma il dott. Sampathkumar.

Se il test RT-PCR è negativo ma i risultati della radiografia del torace o della TC sono anormali o se c’è stato uno stretto contatto con una persona che ha confermato COVID-19, la raccomandazione è di continuare a prendersi cura del paziente come se lui o lei ha COVID-19.

“Dobbiamo continuare a perfezionare i protocolli per i pazienti asintomatici e gli operatori sanitari esposti”, afferma il dott. Sampathkumar.


La diffusione del nuovo patogeno Sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha causato una pandemia in espansione di Corona Virus Disease-2019 (COVID-19) (1, 2, 3, 4).

Al 10 ° Mar 2020, il numero globale di casi confermati di COVID-19 aveva superato 118.000, con più di 4.292 morti a causa di insufficienza respiratoria acuta o di altre complicanze correlate (5).

La maggior parte dei casi (68,42%) si è verificata in Cina; al di fuori della Cina, un totale di 37.371 casi di COVID-19 è stato confermato in 114 paesi / territori / aree con 1130 morti (5). T

o consentire una rapida identificazione del paziente e il trattamento clinico, il governo cinese ha pubblicato sette edizioni successive di Linee guida per la diagnosi e il trattamento di COVID-19 dal 15 gennaio 2020.

I test di laboratorio sull’acido nucleico virale (NAT) sono stati raccomandati come gold standard per la diagnosi di COVID-19, insieme all’esame sierologico (6).

La NAT mostra prestazioni migliori rispetto ai test sugli anticorpi in quanto può identificare l’RNA virale nella fase iniziale dell’infezione, anche durante il periodo di incubazione.

Dal 1988, la tecnologia di reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata ampiamente utilizzata nell’esame clinico con i notevoli vantaggi di alta sensibilità, convenienza ed economia (7).

Attualmente, oltre 100 imprese in Cina hanno sviluppato kit di rilevamento in tempo reale di PCR (RT-PCR) per COVID-19 e nove di questi kit sono stati approvati dalla National Medical Products Administration (NMPA) della Cina (8).

Negli studi clinici sottoposti alla procedura di approvazione NMPA, tutti i kit hanno mostrato un’alta sensibilità di oltre il 90% con campioni di casi confermati.

Tuttavia, in contesti clinici reali, i tassi di diagnosi positivi dei pazienti sospetti non erano così alti come precedentemente valutati (9).

Molti pazienti sospetti hanno mostrato sintomi clinici tipici o studi di imaging coerenti con la polmonite, ma non sono stati trovati positivi nei test RT-PCR.

Ciò ha sollevato la questione di ciò che ha causato questi risultati positivi mancanti nella pratica clinica?

Data l’alta qualità dei kit approvati NMPA, i risultati dei test falsi negativi erano meno probabili dalle procedure di estrazione e rilevazione dell’acido nucleico.

I tipi di campioni raccolti clinicamente sembravano essere una delle principali cause delle prestazioni inferiori dei test RT-PCR del previsto (10), ma, altri fattori devono essere considerati, in particolare i pretrattamenti dei campioni prima del test.

Considerando che SARS-CoV-2 è un RNA a singolo filamento, l’isolamento del suo genoma richiede una gestione cauta dei campioni e buone pratiche di laboratorio.

A causa della contagiosità della SARS-CoV-2, molti laboratori cinesi hanno inattivato il virus a 56-60 ° C per 30-60 minuti prima dell’estrazione dell’RNA.

L’inattivazione termica a 56 ° C è stata inoltre raccomandata per garantire la sicurezza degli ispettori medici secondo il consenso dell’esperto cinese (11).

Il consenso solleva anche l’incertezza sul fatto che l’inattivazione del calore possa ridurre la sensibilità del NAT (11). Sebbene si sospetti che tale pretrattamento possa influire sul rilevamento di SARS-CoV-2 in campioni con basse cariche virali, i confronti quantitativi sul suo impatto non sono ancora chiari.

Qui, abbiamo studiato gli effetti dell’inattivazione termica sui risultati quantitativi di RT-PCR di SARS-CoV-2 e valutato i tassi di falsi negativi dovuti all’inattivazione termica.

Abbiamo ulteriormente studiato gli effetti di diversi tipi di campione, i tempi di conservazione dei campioni e l’approccio di inattivazione chimica sul NAT.

L’inattivazione termica ha ridotto la quantità rilevabile di SARS-CoV-2 nel rilevamento RT-PCR.

Per determinare l’impatto dell’inattivazione termica, è stato eseguito il NAT parallelo utilizzando campioni clinici di 4 pazienti confermati COVID-19. Ogni campione è stato diluito in serie di un fattore 10 -5 e quindi determinato mediante RT-PCR.

Il grafico a linee presentato contrasta i valori Ct di ciascun campione con o senza incubazione a 56 ° C per 30 minuti ( Fig. 1 ).

Abbiamo classificato la concentrazione originale e diluita di 10 -1 e 10 -2 come gruppo ad alta carica virale (HVL) e tutte le rimanenti diluizioni (da 10 -3 a 10 -5 ) come gruppo a bassa carica virale (LVL).

In generale, la maggior parte dei campioni inattivati ​​presentava valori Ct più alti (media 33,07 ± DS 5,00) rispetto a quelli con trattamento non inattivato (media 32,69 ± DS 4,92) con un aumento medio di 0,38 ( P = 0,017, Tabella supplementare online 1 ).

Abbiamo ulteriormente calcolato il ΔCt di ciascun campione con o senza inattivazione. Gli ΔC di campioni rilevabili nel gruppo LVL (mediana 1,37, intervallo da 0,81 a 2,17) erano molto più alti di quelli (mediana 0,14, intervallo da -0,38 a 1,57) nel gruppo HVL ( P = 0,02, Tabella supplementare online 1 ).

Questi dati hanno suggerito che nei campioni rilevabili del gruppo LVL, la tendenza all’aumento di Ct per inattivazione termica era più sostanziale di quella nel gruppo HVL. In particolare, alcuni campioni diluiti hanno mostrato risultati negativi dopo l’inattivazione.

Questi risultati hanno dimostrato che l’inattivazione termica potrebbe causare un aumento del valore Ct nei test RT-PCR di SARS-CoV-2 e potrebbe influenzare i risultati qualitativi di campioni che trasportano basse cariche virali.

Tabella 1 Valore Ct di RT-PCR per il rilevamento di SARS-CoV-2 in campioni di tampone di gola

Inactivation                                              Non-inactivation

 Ct 1Ct 2Ct 1Ct 2
Campione A35.6435.8434.6534.71
Campione B33.1233.4933.3433.39
Campione C34.4734.5034.5534.58
Campione D36.72NA36.5536.62
Sample ENANA36.7536.94
Campione F36.7036.3935.5135.42
Campione G36.6136.0635.4135.00
Campione HNA36.7436.0235.92
Campione I.NA36.6134.6934.67
Campione J34.8934.9833.3333.50
Campione K35.1434.9733.6433.41
Sample L36.5036.9334.9535.09
Campione MNANA36.8836.90
Campione NNANA36.8036.84
Campione ONANA35.8436.04

NA, non disponibile, rappresenta un valore non rilevabile di Ct> 37.

I campioni clinici positivi positivi erano più suscettibili all’inattivazione termica.

Per verificare ulteriormente gli effetti dell’inattivazione termica su campioni con basse cariche virali, 15 campioni con cariche virali vicino al limite di rilevazione sono stati raccolti da casi confermati e testati in parallelo.

I valori Ct dei campioni non inattivati ​​variavano da 33,37 a 36,89. Ancora una volta, il gruppo inattivato (media 36,48 ± DS 1,48) ha mostrato valori Ct medi più elevati rispetto al gruppo non inattivato (media 35,26 ± DS 1,24) con un aumento medio di 1,22 ( P <0,001, Fig. 2 ). Inoltre, in duplicati test RT-PCR, i risultati positivi in ​​7 su 15 campioni (46,7%) sono stati convertiti in valori non rilevabili (falsi negativi) in almeno un test parallelo dopo inattivazione termica ( Tabella 1 ). Il valore Ct medio dei 7 campioni con non inattivazione era di 36,25, fornendo una possibile soglia di suscettibilità termica nella NAT virale.

Effetti dell’inattivazione termica su diversi tipi di campioni

I campioni clinici per i test COVID-19 includevano tampone alla gola, espettorato, liquido di lavaggio broncoalveolare, feci, sangue, ecc. Per esplorare l’effetto dell’inattivazione termica in diversi tipi di campione, abbiamo distribuito 4 tamponi alla gola, 2 campioni di espettorato e 2 campioni di feci e diluito in serie ciascun campione di un fattore 10 -5 . Rispetto al gruppo non inattivato (media 33,64 ± DS 4,61), l’inattivazione termica ha aumentato i valori Ct della maggior parte dei campioni (media 34,08 ± DS 4,68) con un aumento medio di

0.44 ( P <0.001, Fig. 3 , Tabella supplementare online 2 ). Abbiamo quindi eseguito un’ulteriore analisi all’interno di diversi tipi di campioni. Mentre la suscettibilità all’inattivazione termica nei tamponi della gola è stata descritta sopra ( Fig. 1 , Tabella supplementare online 3 ), il

i valori medi di Ct dei campioni di feci inattivati ​​(media 36,29 ± DS 2,87) erano anche superiori a quelli del gruppo non inattivato (media 35,55 ± DS 3,24) di un aumento medio di 0,74 ( P = 0,014, Tabella supplementare online 3 ).

Tuttavia, la differenza nei valori medi di Ct nell’espettorato tra gruppi inattivati ​​(media 33,90 ± DS 5,06) e non inattivati ​​(media 33,62 ± DS 4,85) non è risultata significativa ( P = 0,308, Tabella supplementare online 3 ).

Una temperatura più elevata e un tempo più lungo di conservazione dei campioni hanno parzialmente contribuito a risultati falsi negativi in ​​campioni che trasportavano basse cariche virali.

Per esplorare gli effetti del tempo e della temperatura sul rilevamento di laboratorio, abbiamo diluito quattro campioni di tampone di gola con fattori di 10 -2 e 10 -4 . Tutti i campioni originali e diluiti sono stati conservati a 4 ° C o temperatura ambiente (RT) e raccolti in diversi punti temporali di 12, 24, 36 e 48 ore.

Il tempo e la temperatura di conservazione hanno mostrato solo un impatto visivo sull’aumento del valore Ct rilevato. Tuttavia, valori Ct più alti erano più importanti con un tempo di conservazione più lungo, specialmente nei campioni diluiti con cariche virali più basse. In particolare, due campioni positivi (campione 2 e 4) diluiti da un fattore di 10 -4 sono stati convertiti in campioni negativi con conservazione o conservazione più lunghe a temperatura ambiente ( Fig. 4 ).

Complessivamente, nonostante il fatto che l’influenza del tempo di conservazione e della temperatura sul NAT fosse lieve, un tempo prolungato e un’alta temperatura di conservazione sono stati in grado di causare risultati falsi negativi in ​​campioni a bassa carica virale.

L’inattivazione virale da parte della lisi a base di guanidinio ha mostrato meno effetti sulla quantità rilevabile di SARS-CoV-2 rispetto all’inattivazione termica.

Poiché l’RNA genomico di SARS-CoV-2 è instabile e facilmente degradabile dalla nucleasi ambientale, le soluzioni utilizzate per preservare i campioni sono di grande importanza per proteggere l’integrità genomica virale.

Tampone a base di guanidinio, una soluzione comune per la conservazione dei campioni ha dimostrato di avere la doppia funzione di inattivazione virale attraverso la distruzione chimica della proteina virale (13).

Pertanto, abbiamo raccolto 15 campioni di tampone di gola per studiare l’effetto dell’inattivazione chimica da parte di soluzioni a base di guanidinio sui test RT-PCR per SARS-CoV-2. Ogni campione è stato diviso in sottogruppi basati sull’inattivazione chimica mediante lisi a base di guanidinio (gruppo GL) e per inattivazione termica a 56 ° C per 30 minuti (gruppo VTM).

VTM è stato utilizzato per la conservazione dei campioni prima dell’inattivazione termica. I valori Ct della maggior parte dei campioni nel gruppo VTM (media 36,48 ± DS 1,48) erano superiori a quelli nel gruppo GL (media 35,40 ± DS 1,33) con un aumento medio di 1,08 ( P <0,001, Fig. 5A , Tabella supplementare online 4 ), dimostrando che GL ha fornito una migliore protezione dell’acido nucleico virale rispetto all’inattivazione termica.

Inoltre, il numero di campioni con risultati non rilevabili era 2 su 15 nel gruppo inattivato GL ma 7 su 15 nel gruppo inattivato termicamente. Abbiamo calcolato i valori di ΔCt dei gruppi inattivati ​​termicamente e chimicamente rispetto al gruppo non inattivato.

I valori di ΔCt dei campioni inattivati ​​termicamente erano molto più alti di quelli del gruppo inattivato GL ( P <0,001, Fig. 5B ). Questi risultati hanno suggerito che la conservazione del GL potrebbe attenuare il valore Ct aumentato rispetto all’inattivazione termica.

*-*-*-*-*-*-*

Legenda delle figure

Figura 1 . Effetti dell’inattivazione termica sui test RT-PCR di SARS-CoV-2 in campioni di tamponi alla gola. Ogni campione (n = 4) è stato rilevato in soluzione grezza o dopo una serie di diluizioni con mezzi di trasporto del virus da 10-1 a 10-5, seguito da un trattamento con o senza incubazione a 56 ° C per 30 minuti. Il punto nero rappresenta il valore Ct medio degli esperimenti quantitativi duplicati di RT-PCR. La linea tratteggiata rappresenta il valore Ct 37 e i valori Ct dei risultati non rilevabili sono stati determinati come 38.

Figura 2 . Effetti dell’inattivazione termica sui test RT-PCR di SARS-CoV-2 in tamponi clinici della gola che trasportano basse cariche virali. Ogni campione (n = 15) è stato rilevato con o senza incubazione a 56 ° C per 30 minuti. Ogni punto rappresenta il valore Ct medio degli esperimenti quantitativi duplicati di RT-PCR. La linea tratteggiata rappresenta il valore Ct 37 e i valori Ct dei risultati non rilevabili sono stati determinati come 38. Il confronto tra i gruppi di inattivazione e non inattivazione è stato testato dal test t di Student a due code accoppiato. *** rappresenta P <0,001.

Figura 3. Effetti dell’inattivazione termica sui test quantitativi RT-PCR di SARS-CoV-2 in diversi tipi di campione. Sono stati incorporati campioni di espettorato (n = 2), feci (n = 2) e tamponi della gola (n = 4). Ogni campione è stato rilevato due volte in soluzione grezza o diluizione con mezzi di trasporto del virus da 10-1 a 10-5. Ogni simbolo rappresenta il valore Ct da un test. La linea tratteggiata rappresenta lo stesso valore Ct tra il gruppo inattivato e non inattivo. Le aree ombreggiate rappresentano valori rilevabili in entrambi i due gruppi. I valori Ct dei risultati non rilevabili sono stati determinati come 38.

Figura 4. Effetti della temperatura e del tempo di conservazione dei campioni sui test RT-PCR di SARS-CoV-2 nei campioni di tamponi alla gola. Ogni campione (n = 4) è stato rilevato in soluzione grezza o diluito con mezzi di trasporto del virus da fattori di 10-2 e 10-4 e quindi conservato a 4 ° C o temperatura ambiente (RT). I campioni sono stati rilevati ogni 12 ore nei due giorni successivi. Ogni simbolo rappresenta la media Ct di esperimenti quantitativi duplicati di RT-PCR. La linea tratteggiata rappresenta il valore Ct 37 e i valori Ct dei risultati non rilevabili sono stati determinati come 38.

Figura 5. Effetti della lisi a base di guanidinio sui test quantitativi di RT-PCR di SARS-CoV-2. Tutti i campioni di tamponi della gola (n = 15) sono stati collocati in lisi a base di guanidinio (GL) o mezzi di trasporto del virus (VTM). Ogni campione nel gruppo VTM è stato diviso in sottogruppi con o senza incubazione a 56 ° C per 30 minuti. (A) Analisi comparativa dei valori di Ct nei campioni tra inattivazione chimica (conservata in GL) o inattivazione termica (conservata in VTM). Le aree ombreggiate rappresentano valori rilevabili in entrambi i metodi di inattivazione. (B) Analisi comparativa dei valori di ΔCt in campioni conservati in GL o VTM. Il valore ΔCt è stato calcolato dalla differenza dei valori Ct tra i campioni di inattivazione e di non inattivazione. Ogni simbolo o punto rappresenta la media Ct di esperimenti quantitativi duplicati di RT-PCR. I valori Ct dei risultati non rilevabili sono stati determinati come 38. Il confronto dei valori di ΔCt tra il gruppo GL e VTM è stato testato dal test t di Student a due code accoppiato. *** rappresenta P <0,001.

Figura 1
figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5

Fonte:
Mayo Clinic

Riferimenti:

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