COVID-19: La mutazione D614G aumenta l’infettività virale e diminuisce la sensibilità di neutralizzazione

SARS-CoV-2 è un nuovo coronavirus riportato nel 2019 che ha causato il recente scoppio della malattia di coronavirus-2019 (COVID-19) 1.

Il 17 giugno 2020, l’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha riferito che 8,06 milioni di persone in tutto il mondo erano state infettate con SARS-CoV-2 e 440.290 persone sono morte di COVID-19.

Questa pandemia ha avuto un impatto negativo significativo sulle attività sociali ed economiche internazionali. Il genoma dell’RNA di SARS-CoV-2 è stato rapidamente sequenziato per facilitare i test diagnostici , il monitoraggio delle fonti epidemiologiche molecolari e lo sviluppo di vaccini e strategie terapeutiche2.

I coronavirus sono virus RNA avvolti e a filamento positivo che contengono i più grandi genomi di RNA conosciuti fino ad oggi.

Il tasso di mutazione per i virus dell’RNA è estremamente elevato, il che può contribuire alla sua trasmissione e virulenza.

L’unica variazione significativa nella proteina spike (S) SARS-CoV-2 è una mutazione non sinonimo D614G (Aspartate (D) in glicina (G) )3.

I dati primari hanno mostrato che S-G614 è un ceppo più patogeno di SARS-CoV-2 con un’elevata efficienza di trasmissione 3, tuttavia non è chiaro se la conversione D614G nella proteina S influisca sull’ingresso virale e l’infettività nel modello cellulare.

La proteina S del coronavirus, il principale determinante del tropismo dell’ospite e dei tessuti, è un bersaglio importante per vaccini, anticorpi neutralizzanti e inibitori dell’ingresso virale 4,5.

Simile a SARS-CoV, il recettore cellulare di SARS-CoV-2 è l’enzima 2 di conversione dell’angiotensina (ACE2); tuttavia, la proteina SARS-CoV-2 S ha un’affinità da 10 a 20 volte superiore per ACE2 rispetto alla corrispondente proteina S di SARS-CoV 6,7.

I coronavirus utilizzano due percorsi distinti per l’ingresso delle cellule: il percorso della superficie cellulare mediato dalla proteasi e il percorso endosomiale 8. Le proteine ​​S di diversi coronavirus sono suddivise dalle proteasi dell’ospite nella subunità S1 per il legame del recettore e nella subunità S2 per la fusione della membrana nella fase di ingresso dell’infezione .

Diverse proteasi cellulari, tra cui furina, transmembrane proteasi serina 2 (TMPRSS2) e cathepsin (Cat) B / L, sono fondamentali per innescare la proteina SARS-CoV-2 S per migliorare l’entrata virale mediata da ACE2 4.

Recentemente, Chandrika Bhattacharyya et al. Hanno riferito che è stato introdotto un nuovo sito di scissione della serina proteasi (elastasi-2) nella proteina S-G614 della variante SARS-CoV-2 9. Tuttavia, non è noto se la proteina S-G614 possa essere elaborata e attivata dall’elastase-2 nel modello cellulare.

La proteina S svolge un ruolo chiave nell’evoluzione del coronavirus per sfuggire al sistema immunitario ospite. Non è ancora chiaro se la mutazione D614G influenzi le proprietà antigeniche della proteina S.

Non è chiaro se gli inibitori dell’elastasi-2 e i campioni di siero convalescente di COVID-19 possano bloccare l’infezione della variante SARS-CoV-2 D614G.

In questo studio, abbiamo analizzato le sequenze del gene S di SARS-CoV-2 presentate al database GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data). Abbiamo mostrato l’espressione e la scissione della proteina S-D614 e S-G614 nelle linee cellulari.

Usando un sistema pseudotipo lentivirale che esprime la luciferasi (Luc), abbiamo stabilito un dosaggio quantitativo basato su pseudovirus per la valutazione della voce cellulare SARS-CoV-2 mediata dalle varianti della proteina S virale.

Abbiamo anche confrontato la sensibilità neutralizzante dello pseudovirus della proteina S-D614 e S-G614 ai sieri convalescenti di pazienti COVID-19. Il nostro studio fornisce ulteriori informazioni sulla trasmissione e sugli interventi immunitari di questo virus appena emerso.

Metodi

Plasmidi. Il gene ottimizzato al codone che codifica per la proteina SARS-CoV-2 S (GenBank: QHD43416) con la delezione di amminoacidi del terminale C 19 è stato sintetizzato da Sino Biological Inc. (Pechino, Cina) e clonato nei siti di restrizione Kpn I e Xba I di vettore pCMV3 (pCMV3-SARS-CoV-2-S-C19del, indicato come pS-D614).

Il plasmide S6 mutante D614G che esprime il plasmide (indicato come pS-G614) è stato costruito mediante mutagenesi sito-diretta, con plasmide pS-D614 come modello. Il vettore reporter luciferasi ΔEnv Vpr HIV-1 NL4-3 (pNL4-3.Luc.RE-) costruito da N. Landau 10, è stato fornito dal Prof. Cheguo Cai dell’Università di Wuhan (Wuhan, Cina).

Il plasmide espressivo pMD2.G del virus della stomatite vescicolare G (VSV-G) è stato fornito dal Prof. Ding Xue dell’Università Tsinghua (Pechino, Cina). L’espressione plasmide per ACE2 umano ed ELANE (elastase-2) sono state ottenute da Genecopoeia (Guangzhou, Cina).

Linee cellulari. Le cellule HEK293T sono state acquistate dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Le cellule sono state mantenute nel Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Hyclone, Waltham, MA, USA) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS; Gibco, Rockville, MD, USA), 100 mg / mL di streptomicina e 100 unità / mL di penicillina a 37 ° C in 5% di CO2. Le cellule HEK293T trasfettate con ACE2 umano (293T-ACE2) sono state coltivate nelle stesse condizioni con l’aggiunta di G418 (0,5 mg / mL) al terreno.

Anticorpi e inibitori. L’anticorpo monoclonale anti-RBD (dominio del recettore) contro la proteina SARS-CoV-2 S è stato gentilmente fornito dal Prof. Aishun Jin della Chongqing Medical University. ACE2 umano ricombinante collegato al dominio Fc delle IgG1 umane (ACE2-Ig, Sino Biological Inc.).

Il mesostatato di Camostat (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Giappone) e l’aloxistatina (E-64d; MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA) sono stati sciolti in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione di 50 mM.

Campioni di siero Un totale di 41 sieri di pazienti COVID-19 convalescenti (a 2-4 settimane dopo l’insorgenza dei sintomi) sono stati raccolti da tre ospedali designati a Chongqing nel periodo dal 5 febbraio al 10 febbraio 2020 (Tabella supplementare 1).

Tutti i sieri sono stati testati positivamente utilizzando i kit MCLIA forniti da Bioscience Co. (Tianjin, Cina) 11. I sieri dei pazienti sono stati incubati a 56 ° C per 30 minuti per inattivare il complemento prima degli esperimenti.

Analisi del genoma SARS-CoV-2 Lo strumento di analisi Nextstrain online (https://nextstrain.org/ncov) è stato utilizzato per tracciare la mutazione D614G nei genomi SARS-CoV-2.

Globali di 2834 genomi campionati tra il 20 dicembre 2019 e il 12 giugno 2020 sono stati visualizzati utilizzando il layout ‘rettangolare’. Le mutazioni sono state etichettate in ramo.

Tutte le sequenze di geni SARS-CoV-2 S complete sono state scaricate dal sito Web dell’NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/) il 1 ° giugno 2020.

Abbiamo ottenuto 4701 sequenze di codifica S da NCBI, dopo l’esclusione di sequenze parziali e di frame-shift, 4649 sequenze S completate sono state utilizzate per ulteriori analisi. Tutte le sequenze di nucleotidi S sono state tradotte in sequenze di aminoacidi.

Le sequenze nucleotidiche e amminoacidiche di S sono state allineate separatamente con il software di allineamento a più sequenze MUSCLE. Il ceppo ‘Wuhan-Hu-1’ (NC_045512) è stato usato come sequenza di riferimento e le mutazioni sono state estratte usando script PERL privati.

Analisi Western blot dell’espressione della proteina SARS-CoV-2 S. Per analizzare l’espressione della proteina S nelle cellule, S-D614 e S-G614 che esprimono plasmidi sono stati trasfettati rispettivamente nelle cellule HEK293T.

Le proteine ​​totali sono state estratte dalle cellule usando il tampone di lisi RIPA (CWbiotech, Pechino, Cina) contenente 1 mM fenil metil solfonil fluoruro (PMSF; Beyotime, Shanghai, Cina). 

Pari quantità di campioni di proteine ​​sono state separate elettroforeticamente mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato al 10% (SDS-PAGE), e quindi trasferite sulla membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Gli immunoblot sono stati analizzati con gli anticorpi indicati. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando i kit di substrato chemiluminescente SuperSignal ™ West Pico (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e quantificate mediante densitometria utilizzando il software ImageJ (National Center for Biotechnology Information [NCBI], Bethesda, MD, USA).

Produzione e titolazione di pseudovirus S SARS-CoV-2. Sono stati prodotti virus pseudotipati SARS-CoV-2 come precedentemente descritto con alcune modifiche12. In breve, 5 × 106 cellule HEK293T sono state co-trasfettate con 6 μg di pNL4-3.Luc.RE- e 6 μg di plasmidi ricombinanti SARS-CoV-2 S (pS-D614 o pS-G614) usando il reagente di trasfezione Lipofectamina 3000 ( Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore.

Le cellule sono state trasferite in DMEM fresco 12 ore dopo. I virus pseudotipati della proteina S-D614 e S-G614 nei supernatanti sono stati raccolti 48 ore dopo la trasfezione, centrifugati, filtrati attraverso un filtro da 0,45 μm e conservati a -80 ° C. Il pMD2.G è stato co-trasfettato con il plasmide pNL4-3.Luc.RE per impacchettare lo pseudovirus VSV-G.

I titoli degli pseudovirus sono stati calcolati determinando il numero di genomi dell’RNA virale per millilitro di soluzione madre virale utilizzando real-time (RT) -qPCR con primer e una sonda che prendono di mira LTR13. Primer di senso:

5′-TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT-3 ′ 3 ‘, primer anti-senso:
5′-GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC-3 ′, sonda:
5′-FAM-CAGTGGCGCCCGAACAGGGA- BHQ1-3 ′.

In breve, gli RNA virali sono stati estratti con Trizol (Invitrogen, Rockville, MD) e trattati con DNasi privo di RNasi (Promega, Madison, WI, USA) e ri-purificati usando mini colonne. Quindi l’RNA è stato amplificato utilizzando i reagenti della miscela master TaqMan One-Step RT-PCR (Applied Biosystems, ThermoFisher).

La quantità nota di vettore pNL4-3.Luc.RE è stata utilizzata per generare curve standard. I virus pseudotipati della proteina S-D614 e S-G614 sono stati adeguati allo stesso titolo (copie / ml) per i seguenti esperimenti.

Saggio di ingresso pseudovirus mediato da picco SARS-CoV-2. Per rilevare l’ingresso virale mediato dalle varianti S, le cellule 293T-ACE2 (2 × 104) coltivate in piastre da 96 pozzetti sono state rispettivamente infettate con la stessa quantità di pseudovirus S-D614 o S-G614 (3,8 × 104 copie in 50 μL). 

Le cellule sono state trasferite su terreno DMEM fresco 8 ore dopo l’infezione e le relative unità di luminescenza (RLU) sono state misurate 24-72 ore dopo l’infezione dal reagente di dosaggio Luciferase (Promega, Madison, WI, USA) secondo il protocollo del produttore14.

Saggi di neutralizzazione e inibizione . Le cellule 293T-ACE2 (2 × 104 cellule / pozzetto) sono state seminate in piastre da 96 pozzetti. Per il test di neutralizzazione, 50 μL di pseudovirus, equivalenti a genomi vettoriali 3,8 × 104, sono stati incubati con diluizioni seriali del campione di siero di pazienti e siero normale umano come controllo negativo per 1 ora a 37 ° C, quindi aggiunti ai 96 -bene 293T-ACE2 cellule con 3 replicati.

Per il test di inibizione, le cellule sono state pretrattate con gli inibitori della proteasi (camostat mesilato o E-64d) 2 ore prima dell’infezione. Dopo 12 ore di incubazione, il terreno è stato sostituito con terreno di coltura cellulare fresco.

L’attività della luciferasi è stata misurata 72 ore dopo l’infezione e la neutralizzazione percentuale è stata calcolata utilizzando il software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). 

Le percentuali di riduzione della RLU (tasso di inibizione) sono state calcolate come: 1- (RLU dei sieri del campione – pozzetti di controllo) / (RLU dai sieri di controllo falsi – pozzetti di controllo)) X100%. I titoli degli anticorpi neutralizzanti sono stati calcolati come dose inibitoria del 50% (ID50).

Analisi statistiche. Le analisi statistiche dei dati sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism versione 6.0. Il significato statistico è stato determinato usando ANOVA per confronti multipli. I test t di Student sono stati applicati per confrontare i due gruppi. Le differenze con valori di P <0,05 sono state ritenute statisticamente significative.

Approvazione etica. Lo studio è stato approvato dalla Commissione Etica della Chongqing Medical University (rif. N. 2020003). Il consenso informato scritto è stato revocato dalla Commissione Etica dell’ospedale designato per le malattie infettive emergenti.

Risultati

La mutazione D614G della proteina di picco SARS-CoV-2 è stata distribuita a livello globale

La proteina spike (S) di SARS-CoV-2, contenente 1273 aminoacidi, forma un picco trimerico sulla superficie del virione che svolge ruoli essenziali nell’ingresso virale. Abbiamo analizzato la sequenza di aminoacidi proteici SARS-CoV-2 S da sequenze genomiche virali nel database GISAID. In linea con i precedenti rapporti, abbiamo trovato una mutazione della proteina S distribuita a livello globale, da D614 a G614, che rappresentava nel 64,6% di tutte le sequenze analizzate (Fig.1 e Tabella 1).

Tra le prime 10 mutazioni non sinonime più abbondanti osservate nella proteina S, l’abbondanza relativa del mutante D614G (il clade G) era la più alta del mondo, indicando che il ceppo G614 potrebbe essere selettivamente vantaggioso. Poiché la proteina S è fondamentale per l’infezione da coronavirus, abbiamo cercato di esplorare l’impatto della mutazione D614G più diffusa sull’espressione e sulla funzione della proteina S.

La mutazione D614G ha migliorato la scissione della variante della proteina S da parte delle proteasi.

Abbiamo previsto potenziali siti di scissione delle proteasi nelle varianti di proteine ​​S da PROSPER15 e abbiamo trovato un nuovo sito di scissione della serina proteasi (elastasi-2) a 615-616 residui sulla regione di giunzione S1-S2 di Proteina S-G614 (Fig. 2a, Tabella supplementare 2).

Per valutare l’espressione e la scissione della proteina S SARS-CoV-2 nella linea cellulare umana, i plasmidi che esprimono S ottimizzati per codone (pS-D614 e pS-G614) sono stati trasfettati rispettivamente nelle cellule HEK293T.

L’analisi dell’immunoblot dei lisati di cellule intere ha rivelato che entrambe le proteine ​​S-D614 e S-G614 hanno mostrato due principali bande proteiche (S non trasformata e subunità S1 scissa), quando hanno reagito con l’anticorpo monoclonale mirando all’RBD sul picco SARS-CoV-2 (Fig 2b).

Tuttavia, le cellule trasfettate da pS-G614 hanno mostrato un segnale S1 più forte rispetto alle cellule trasfettate da pS-D614, indicando che la mutazione D614G ha alterato la scissione della proteina S dalla proteasi cellulare. Inoltre, l’inibitore di elastasi-2 sivelestat sodico ha ridotto significativamente il segnale S1 della proteina S-D614 (Fig. 2b).

Questi dati hanno indicato che la mutazione D614G di SARS-CoV-2 S facilita la sua scissione da parte della serina proteasi elastasi-2 ospite. La proteina S del coronavirus deve essere scissa dalle proteasi dell’ospite per consentire la fusione della membrana, che è fondamentale per l’ingresso virale. Successivamente, abbiamo cercato di esplorare l’impatto della mutazione D614G sull’ingresso del virus.

Valutazione dell’efficacia dell’ingresso virale tra particelle lentivirali pseudotipate S-D614 e S-G614

I vettori lentivirali possono essere pseudotipati con varie glicoproteine ​​virali eterologhe che modulano il tropismo cellulare e le proprietà di ingresso cellulare16. A causa della natura altamente patogena della SARS-CoV-2, la SARS-CoV-2 infettiva deve essere gestita in una struttura di livello 3 di sicurezza biologica (BSL-3).

Abbiamo generato uno SARS-CoV-2 pseudotipato basato sulla proteina S virale utilizzando un sistema lentivirale, che ha introdotto un gene reporter Luc per la quantificazione della voce mediata dal coronavirus S. pNL4-3.Luc.RE- è stato co-trasfettato con pS-D614, pS-G614, rispettivamente per impacchettare il virus Luc single-round pseudotipato SARS-CoV-2 S nelle cellule HEK293T.

I titoli dei virus pseudotipati della proteina S-D614 e S-G614 sono stati determinati da RT-qPCR espresso come numero di genomi dell’RNA virale per millilitro, quindi adattati alla stessa concentrazione (3,8 × 104 copie in 50 μL) per i seguenti esperimenti .

L’infettività del virus è stata determinata da un test Luc espresso in RLU. Le cellule HEK293T che esprimono ACE2 umano (293T-ACE2) sono state utilizzate per testare la correlazione tra espressione ACE2 e suscettibilità agli pseudovirus.

Lo pseudovirus VSV-G è stato usato come controllo. Come mostrato in Fig. 3a, entrambe le cellule HEK293T e 293T-ACE2 potrebbero essere effettivamente trasdotte dallo pseudovirus VSV-G. Tuttavia, l’ingresso dello pseudovirus S-D614 e S-G614 è fortemente dipendente dalla sua espressione ACE2 del recettore cellulare.

Le cellule 293T-ACE2 hanno mostrato un aumento di circa 250 volte e 530 volte dell’attività di Luc rispetto alle cellule HEK293T, quando trasdotte rispettivamente da pseudovirus S-D614 e S-G614 (Fig. 3a). Successivamente abbiamo rilevato la capacità inibitoria di ACE2-Ig, una proteina di fusione consistente nel dominio extracellulare (Met 1-Ser 740) di ACE2 umano collegato alla regione Fc di IgG1 umana al C-terminus17.

Entrambi gli pseudovirus S-D614 e S-G614 erano potentemente inibiti dall’ACE2-Ig e l’IC50 (la concentrazione che causava l’inibizione del 50% dell’infezione da pseudovirus) era rispettivamente di 0,13 e 0,15 μg / mL (Fig. 3b).

Per confrontare ulteriormente l’efficienza dell’ingresso virale meditata dalle varianti S, abbiamo rilevato l’attività di Luc in tempi diversi dopo l’infezione. Con la variante G614 Spike, l’aumento della trasduzione virale rispetto alla variante D614 era 2,2 volte a 48 ore dopo l’infezione.

La massima efficienza di trasduzione (circa 2,5 × 104 RLU) è stata osservata 72 ore dopo l’infezione con pseudovirus S-G614, che era circa 2,4 volte superiore allo pseudovirus S-D614 (Fig. 3c).

Questi dati hanno suggerito che la mutazione D614G nella proteina S promuove in modo significativo l’ingresso del virus nelle cellule che esprimono ACE2 e ACE2-Ig blocca efficacemente l’infezione da virus pseudotipo S sia di tipo selvaggio che mutante. Successivamente abbiamo esplorato il meccanismo con cui l’S-G614 ha aumentato l’infettività dello pseudovirus.

Gli inibitori della proteasi hanno bloccato l’infezione dello pseudovirus S-G614 L’attivazione proteolitica della proteina S è necessaria per l’infettività del coronavirus e la via della superficie cellulare mediata dalla proteasi è fondamentale per SARS-CoV-2 entry4.

 Poiché abbiamo osservato che l’S-G614 potrebbe essere suddiviso in modo più efficiente dalla proteasi dell’ospite se espresso in modo esogeno in cellule 293T, abbiamo ipotizzato che le proteasi dell’ospite possano essere coinvolte nel potenziamento dell’ingresso del virus S-G614.

Due inibitori della proteasi clinicamente testati, camostat mesilato ed E-64d, che bloccano rispettivamente l’host TMPRSS2 e CatB / L, sono stati testati su particelle lentivirali pseudotipate con proteina S-D614 e S-G614.

Come mostrato in Fig. 3a, nelle cellule 293T-ACE2 prive di TMPRSS2, l’inibito dello pseudovirus S-D614 o S-G614 inibitore della serina inibitore della camostatina mesilato. Mentre l’inibitore delle proteasi della cisteina E-64d ha bloccato significativamente questi due pseudovirus e l’IC50 era 0,37 μM per lo pseudovirus S-D614 e 0,24 μM per lo pseudovirus S-G614 (Fig. 3b).

Come previsto, questi inibitori della proteasi non hanno avuto alcun impatto sull’infezione da pseudovirus VSV-G. Insieme, questi risultati hanno suggerito che l’ingresso virale S-meditato nelle cellule 293T-ACE2 carenti di TMPRSS2 è protosina endosomiale proteasi CatB / L dipendente, quindi lo pseudovirus S-D614 e S-G614 mostrano una sensibilità simile all’inibitore CatB / L E-64d in 293T -CelluleACE2.

Effetto di neutralizzazione dei sieri di pazienti convalescenti COVID-19 contro pseudovirus S-D614 e S-G614

Gli anticorpi neutralizzanti sono importanti per la prevenzione e possibilmente il recupero da infezioni virali, tuttavia, poiché i virus mutano durante la replicazione e la diffusione, gli anticorpi neutralizzanti dell’ospite generati nella prima fase dell’infezione potrebbero non essere così efficaci in seguito18,19.

Per verificare se le mutazioni del D614G potrebbero influenzare la sensibilità alla neutralizzazione del virus, sono state valutate le attività di neutralizzazione dei campioni di siero di pazienti convalescenti con COVID-19 contro gli pseudovirus SARS-CoV-2 S-D614 e S-G614.

Per eseguire il test di neutralizzazione, 50 μl di pseudovirus (3,8 × 104 copie) sono stati incubati con siero diluito seriale. Come mostrato in Fig. 4a, il tasso di inibizione del siero da pazienti COVID-19 convalescenti è stato analizzato con una singola diluizione di 1: 1000.

Tra i 41 sieri testati, 38 hanno mostrato attività neutralizzanti contro pseudovirus S-D614 e S-G614 con efficienza comparabile. In particolare, 3 campioni di siero (pazienti 1 #, 7 #, 40 #) hanno ridotto il tasso di inibizione contro lo pseudovirus S-G614.

Il siero del paziente 1 # non è riuscito a neutralizzare lo pseudovirus S-G614 sebbene neutralizzasse circa il 30% dello pseudovirus S-D614 alla diluizione 1: 1000. Quindi sono state analizzate le curve di inibizione e ID50 per i campioni di siero di 5 pazienti convalescenti e un donatore di salute.

I sieri dei pazienti 17 # e 39 #, che erano in grado di neutralizzare entrambi i due pseudotipi in misura simile, hanno mostrato valori ID50 simili (Fig. 4b). Tuttavia, i sieri dei pazienti 1 #, 7 # e 40 # hanno mostrato un’elevata attività neutralizzante contro lo pseudovirus S-D614 con ID50 compreso tra 894 e 1337, ma hanno ridotto l’attività neutralizzante contro lo pseudovirus S-G614 con ID50 compreso tra 216 e 367, indicando da 3,6 a Riduzione di 4,7 volte dei titoli neutralizzanti (Fig. 4b). 

Questi dati hanno indicato che la mutazione D614G modifica l’antigenicità della proteina S, diminuendo in tal modo la sensibilità di neutralizzazione ai singoli sieri convalescenti.

Discussione
I saggi basati sullo pseudovirus sono stati ampiamente utilizzati per lo studio del tropismo cellulare, il riconoscimento dei recettori, gli inibitori virali e la valutazione degli anticorpi neutralizzanti senza la necessità dei laboratori BSL-3.

Il presente studio ha generato uno SARS-CoV-2 pseudotipato basato sulla proteina S virale utilizzando un sistema lentivirale, che incorporava un gene reporter Luc per la facile quantificazione dell’ingresso mediato da S coronavirus.

Studiamo la principale mutazione della proteina S nella posizione 614 e abbiamo scoperto che la serina proteasi elastasi-2 partecipa all’attivazione proteolitica della proteina S-G614, migliorando in tal modo l’ingresso virale nelle cellule 293T-ACE2. Inoltre, abbiamo scoperto che lo pseudovirus S-G614 era più resistente agli antisieri neutralizzanti dello pseudovirus S-G614.

In questo studio, abbiamo scoperto che l’efficienza di entrata del virus pseudotipato S-G614 era circa 2,4 volte superiore a quella dello pseudovirus S-D614 quando dosi di virus di input sono normalizzate, suggerendo che la mutazione D614G promuove l’infettività di SARS-CoV-2 e migliora trasmissibilità virale.

Poiché lo pseudovirus era svolto in un singolo ciclo di analisi dell’infezione, questo aumento apparentemente piccolo dell’attività di ingresso potrebbe causare una grande differenza nell’infettività virale in vivo. Hangping Yao et al.

Hanno riferito che un isolato virale ZJU-1 derivato dal paziente, che ospita la mutazione D614G, ha una carica virale 19 volte superiore rispetto all’isolato ZJU-8 (che ospita l’S-D614) quando si infettano le cellule Vero-E620.

Tuttavia, l’isolato ZJU-1 contiene altre due mutazioni non sinonime del gene ORF1a e dell’inviluppo (E). I nostri risultati forniscono anche alcune spiegazioni per l’associazione della mutazione D614G nella proteina S della SARS-CoV-2 con una maggiore efficienza di ingresso. La proteina S-G614 contiene un nuovo sito di scissione della proteasi serinica, quindi potrebbe essere scissa dall’elastasi-2 ospite in modo più efficiente.

Precedentemente studi su SARS-CoV hanno dimostrato che l’ingresso della superficie cellulare mediata da proteasi ha facilitato un’infezione efficiente da 100 a 1.000 volte superiore rispetto alla via endosomiale in assenza di proteasi 21.

L’elastasi-2, nota anche come elastasi neutrofila, svolge un ruolo importante nelle malattie degenerative e infiammatorie.

Sivelestat, approvato per il trattamento della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) in Giappone e Corea del Sud, ha un effetto benefico sulla funzione polmonare dei pazienti con ARDS con sindrome da risposta infiammatoria sistemica 22.

Circa il 10-15% dei pazienti con COVID-19 progredisce verso ARDS23. Poiché sivelestat può non solo mitigare il danno dell’elastasi neutrofila al tessuto connettivo polmonare, ma anche limitare le capacità di diffusione del virus inibendo l’elaborazione della proteina S, Mahmoud MA Mohamed et al. -19 pazienti 24.

I nostri risultati hanno mostrato che la proteina S-G614 potrebbe essere suddivisa in modo più efficiente, il che potrebbe essere dovuto a un nuovo sito di scissione di elastasi-2 sulla regione di giunzione S1-S2 della proteina S-G614, quindi potrebbe essere un’opzione efficace per il trattamento di COVID-19 causato da SARS-CoV-2 che ospita la mutazione D614G.

Takahiko Koyama et al. Hanno riferito che D614G si trova in uno degli epitopi previsti delle cellule B della proteina SARS-CoV-2 S, e questa è una regione altamente immunodominante e può influire sull’efficacia del vaccino con la proteina S di tipo selvaggio18. D614 è conservato nella proteina S della SARS-CoV nel 2003.

Precedenti studi su SARS-CoV hanno suggerito che il peptide S597–625 è un peptide immunodominante principale nell’uomo e provoca una risposta della memoria delle cellule B a lungo termine dopo un’infezione naturale con SARS-CoV25.

Regioni tra aminoacidi 614 e 621 della proteina SARS-CoV-2 S sono state identificate anche come epitopo di cellule B con metodi diversi e il cambiamento di D614G può influenzare l’antigenicità di questa regione26.

Qui, abbiamo osservato che i sieri convalescenti al 7% (3/41) mostravano marcatamente diverse attività di neutralizzazione tra i virus pseudotipati della proteina S-G614 e S-G61, indicando che la mutazione D614G riduce la sensibilità anticorpale neutralizzante.

Se questi pazienti fossero ad alto rischio di reinfezione della variante S-G614 dovrebbe essere esplorato in ulteriori studi. Sarà anche importante determinare l’ampiezza della capacità di neutralizzazione degli anticorpi neutralizzanti indotti dal vaccino.

Molto recentemente, diversi gruppi hanno anche riferito che l’S-G614 migliora l’infettività virale sulla base di analisi pseudovirus27–29, ma a causa delle piccole dimensioni del campione, non hanno trovato alcun effetto sulla sensibilità alla neutralizzazione del virus27,28.

Data la natura in evoluzione del genoma dell’RNA SARS-CoV-2, il trattamento con anticorpi e la progettazione del vaccino potrebbero richiedere ulteriori considerazioni per accogliere il D614G e altre mutazioni che possono influenzare l’immunogenicità del virus.

Il nostro studio ha alcune limitazioni.

In primo luogo , mancavano gli amminoacidi C-terminali 19 della proteina S al fine di migliorare l’efficienza di confezionamento del virus pseudotipato della proteina SARS-CoV-2 S, e questo pseudovirus ricapitola solo gli eventi virali di ingresso; pertanto, sono necessari ulteriori test con SARS-CoV-2 autentico.

In secondo luogo , abbiamo testato solo anticorpi neutralizzanti contro la proteina S.

Tuttavia, studi precedenti su SARS-CoV hanno indicato che solo una piccola parte delle cellule di memoria B specifiche per gli antigeni SARS-CoV è diretta contro gli epitopi neutralizzanti presenti sulla proteina S30.

In terzo luogo , oltre al D614G, sono necessari ulteriori studi su altre mutazioni della proteina S per valutare il loro impatto sull’infezione, sulla patogenicità e sull’immunogenicità della SARS-CoV-2. Sono necessari ulteriori studi per determinare l’impatto di queste mutazioni sulla gravità di COVID-19.

In sintesi, abbiamo stabilito un test di ingresso pseudovirus mediato da picchi SARS-CoV-2 e studiato l’ingresso cellulare di virus pseudotipati S-D614 e S-G614. Il nostro studio ha dimostrato che la mutazione D614G introduce un ulteriore sito di taglio di elastasi-2 nella proteina S, promuovendo così la sua scissione e l’ingresso delle cellule virali, con conseguente SARS-CoV-2 più trasmissibile.

È importante sottolineare che la mutazione D614G ha ridotto la sensibilità del virus all’anticorpo neutralizzante siero in singoli pazienti convalescenti COVID-19. Il nostro studio aiuterà a comprendere la trasmissione di SARS-CoV-2 e la progettazione di vaccini e interventi terapeutici contro COVID-19.

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