I ricercatori hanno sviluppato un farmaco rivoluzionario che protegge dagli attacchi di cuore

I ricercatori di Monash hanno sviluppato un farmaco che può essere potenzialmente somministrato come preventivo contro l’infarto.

Il farmaco – che è stato studiato nelle cellule umane e nei modelli animali – blocca letteralmente i piccoli cambiamenti nel flusso sanguigno che prevengono un infarto e agiscono sulle piastrine prevenendo il coagulo innescato dalle piastrine prima che possa uccidere o causare danni.

È importante sottolineare che il farmaco può avere un ruolo nel prevenire la coagulazione che è il segno distintivo di COVID-19.

Un terzo di tutti i decessi a livello globale – 18 milioni all’anno – sono causati da malattie cardiovascolari, in gran parte infarto o ictus, entrambi provocati da coaguli che bloccano i vasi cerebrali o cardiaci.

Mentre i farmaci come l’aspirina, somministrati al momento dell’attacco, possono prevenire la formazione di ulteriori coaguli, funzionano solo nel 25% dei casi e questi farmaci possono causare gravi effetti collaterali da sanguinamento.

Secondo il principale scienziato del documento, pubblicato sulla prestigiosa rivista Science Translational Medicine, il professore associato Justin Hamilton, del Centro australiano di malattie del sangue della Monash University, “non ci sono stati nuovi farmaci da trattare, per non parlare della prevenzione, infarto o ictus in più di 15 anni “, ha detto.

Il professore associato Hamilton ha detto che i ricercatori hanno inciampato per caso sul potenziale farmaco. Stavano osservando i cambiamenti all’interno delle piastrine che si verificano nel periodo di quella che viene chiamata impostazione patologica, cioè un infarto o un ictus.

Hanno trovato un enzima di interesse, hanno isolato il gene responsabile e hanno sviluppato un topo che mancava proprio quel gene.

I topi – con loro sorpresa – erano completamente protetti contro l’infarto. Ma perché questo enzima fornisse protezione rimase un mistero per due anni. “Ci ha fatto impazzire”, ha detto il professore associato Hamilton.

I ricercatori hanno utilizzato la microscopia elettronica per tagliare “fette” ultrasottili delle piastrine da questi topi per vedere cosa stava succedendo. Ciò che videro fu una membrana leggermente modificata, che sembra impedire a queste piastrine di attaccarsi tra loro o alle pareti dei vasi sanguigni, nel momento in cui si verifica un cambiamento nel flusso sanguigno.

“È questa perturbazione del flusso sanguigno che è un segno distintivo e predittore di un attacco di cuore”, ha detto il professore associato Hamilton.

“Questo enzima consente alle piastrine di rispondere a questo cambiamento di flusso sanguigno e di” potenziare “la loro capacità di coagulazione, causando un attacco.”

Una volta che i ricercatori sono stati consapevoli dell’importanza dell’enzima, hanno sviluppato un farmaco che potrebbe arrestare questo processo, in modelli animali e in modelli di laboratorio usando sangue umano.

Questo farmaco ha il potenziale per essere somministrato a pazienti a rischio di infarto e ictus, per prevenire la formazione di coaguli di sangue in caso di rischio di attacco.

Il prossimo passo è quello di sviluppare un candidato farmacologico più adatto che possa essere portato in una sperimentazione clinica, secondo il professore associato Hamilton. Inizialmente spera di testare il farmaco su pazienti che hanno un rischio maggiore di malattie cardiovascolari, come quelli con diabete.

Questi stessi coaguli – presi di mira dal farmaco Monash – sono stati recentemente collegati a COVID-19 come causa principale di morte per malattia.

Il professore associato Hamilton ha affermato che, già ai primi tempi, “la possibilità di utilizzare il nostro anti-trombotico di recente sviluppo per migliorare il trattamento dei pazienti con COVID-19 è un’idea interessante che vorremmo esplorare”.

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Le 3-chinasi fosfoinositidiche (PI3K) sono una famiglia di chinasi lipidiche che catalizzano la fosforilazione del gruppo idrossilico 3 ′ dell’anello inositolo dei fosfoinositidi per produrre i fosfoinositidi 3-fosforilati – importanti secondi messaggeri per una vasta gamma di processi nelle cellule [ 1, 2].

Esistono otto isoforme di mammifero PI3K, suddivise in tre classi basate su somiglianze strutturali e funzionali: quattro di classe I, tre di classe II e una di classe III PI3K. I PI3K di classe I sono comodamente i più ampiamente studiati e hanno ruoli ben definiti nell’intervallo di cellule, comprese le piastrine [3].

Più recentemente, sono stati usati modelli genetici di topo per scoprire l’importanza della sola PI3K di classe III, Vps34 [4, 5] e una delle PI3K di classe II, PI3KC2α [6-8], nella funzione piastrinica.

PI3KC2α in particolare regola la funzione trombotica delle piastrine di topo mediante un meccanismo unico e non ancora definito che può coinvolgere la struttura della membrana cellulare.

In particolare, abbiamo usato un approccio inducibile basato su shRNA per impoverire la proteina PI3KC2α nelle piastrine dei topi adulti per mostrare che PI3KC2α regola la struttura del sistema di membrana interna piastrinica (il sistema canalicolare aperto; OCS) [6, 7].

Qui, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha rivelato che le piastrine carenti di PI3KC2α presentano dilatazioni dei canali dell’OCS. Forse sorprendentemente, le piastrine di topi carenti di PI3KC2α hanno mostrato la normale funzione in tutti i test di funzionalità in vitro eseguiti (aggregazione, secrezione di granuli, attivazione di integrina, adesione e diffusione su superfici attivanti), ma hanno una funzione trombotica piastrinica compromessa sia in vitro che in vivo modelli [6, 7].

Uno studio successivo ha confermato questo ruolo per PI3KC2α nella struttura piastrinica e la funzione in un modello murino distinto che comporta eterozigosi di una mutazione del punto inattivante la chinasi nel sito attivo PI3KC2α [8]. Questi risultati interessanti suggeriscono che PI3KC2α collega la regolazione della struttura della membrana interna piastrinica alla funzione protrombotica della cellula. Tuttavia, il meccanismo con cui ciò si verifica rimane sconosciuto.

Un potenziale meccanismo attraverso il quale alterazioni nella struttura della membrana piastrinica potrebbero compromettere la funzione piastrinica è fornito dall’osservazione che le piastrine carenti di PI3KC2α presentano una ridotta localizzazione citoscheletrica di proteine ​​chiave che collegano la membrana cellulare con il citoscheletro, in particolare la spettrina e la miosina [8 ].

Se la riduzione di queste proteine ​​è sufficiente a compromettere la comunicazione tra la membrana e il citoscheletro, una previsione è che ciò può portare a una ridotta formazione di filopodia nelle piastrine attivate.

Tuttavia, rimane il modo in cui un tale impatto comporterebbe la compromissione selettiva osservata della funzione piastrinica nel contesto della trombosi – e non una compromissione globale della funzione piastrinica, ad esempio nei saggi standard di aggregazione, secrezione di granuli o diffusione piastrinica [6], rimane poco chiaro.

Data questa incertezza riguardo al meccanismo con cui PI3KC2α regola la struttura e la funzione della membrana piastrinica, abbiamo ulteriormente esaminato i cambiamenti strutturali alla membrana piastrinica indotti dalla carenza di PI3KC2α e abbiamo studiato come questi cambiamenti strutturali influenzano la funzione della membrana piastrinica.

Qui, utilizziamo la microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzata (FIB ‐ SEM) [9], così come la SEM tradizionale, per eseguire un’analisi ultrastrutturale dettagliata tridimensionale delle piastrine da topi carenti di PI3KC2α.

Questa analisi indica che le piastrine carenti di PI3KC2α presentano cambiamenti specifici alla struttura dell’OCS. Questi cambiamenti si verificano senza grandi alterazioni nella composizione lipidica di queste piastrine. Sorprendentemente, i cambiamenti strutturali alla membrana piastrinica di OCS non hanno alcun impatto sulla formazione di filopodia da parte di piastrine attivate in sospensione, ma incidono notevolmente sulla capacità di queste piastrine di formare trombi in un ambiente di flusso sanguigno che coinvolge un gradiente di taglio prominente che produce il legame con la membrana formazione [10-12].

Insieme, questi risultati indicano che PI3KC2α modula la struttura della membrana piastrinica interna (OCS) indipendentemente dalle modifiche alla composizione della membrana. Questi cambiamenti strutturali all’OCS sembrano compromettere la funzione della membrana piastrinica specificamente nella regolazione della formazione di trombi. Se questa regolazione della struttura della membrana da parte di PI3KC2α è acuta, questi studi rivelano il potenziale per un nuovo approccio alla terapia piastrinica specifica per la trombosi.

Risultati
PI3KC2α regola la struttura della membrana piastrinica
In precedenza abbiamo usato l’imaging TEM bidimensionale per dimostrare che la carenza di PI3KC2α provoca una dilatazione dei canali dell’OCS all’interno delle piastrine del topo [6].

Al fine di esaminare questo e altri potenziali cambiamenti ultrastrutturali causati dalla carenza di PI3KC2α in modo più dettagliato, abbiamo usato FIB-SEM per creare ricostruzioni tridimensionali a cellule intere di piastrine di topo carenti di PI3KC2α.

Queste ricostruzioni consentono la visualizzazione e la quantificazione di vari compartimenti intracellulari, che in questo caso comprendevano l’OCS e la membrana plasmatica, nonché alfa e granuli densi.

In accordo con i nostri precedenti risultati bidimensionali, abbiamo osservato la dilatazione dell’OCS nelle piastrine da topi carenti di PI3KC2α rispetto alle piastrine dei controlli dei compagni di figliata (Fig. 1A).

Le aree di dilatazione dell’OCS nelle piastrine carenti di PI3KC2α erano più evidenti in alcuni punti in una data cellula (Fig. 1A, frecce rosse) e il volume totale di OCS nelle piastrine isolate dai topi carenti di PI3KC2α era del 48% maggiore rispetto alle piastrine di cucciolata topi di controllo (3,6 ± 0,5 vs 5,4 ± 0,6% del volume totale delle cellule per controllo e cellule carenti di PI3KC2α, rispettivamente; Fig. 1B).

Nonostante questa dilatazione dell’OCS, non sono state osservate differenze evidenti nella distribuzione spaziale dell’OCS in tutta la cellula (Fig. 1A). Contrariamente all’OCS, il volume totale di alfa o granuli densi non era diverso tra controllo e piastrine carenti di PI3KC2α (Fig. 1C).

Data la dilatazione dell’OCS osservata qui e precedentemente [6, 7], abbiamo successivamente esaminato l’aspetto esterno dell’OCS – le sue aperture sulla membrana plasmatica – tramite SEM (Fig. 2A). C’erano numeri simili di aperture OCS nella membrana plasmatica visibile delle cellule esaminate in questi studi (Fig. 2B).

Tuttavia, in una constatazione quasi identica alle misurazioni OCS all’interno delle piastrine, il diametro delle aperture OCS sulla membrana plasmatica è stato significativamente aumentato del 46% nelle piastrine da topi carenti di PI3KC2α rispetto ai controlli dei compagni di figliata (37 ± 4 vs 54 ± 3 nm, rispettivamente; Fig. 2C).

PI3KC2α non regola la composizione lipidica della membrana piastrinica
Uno dei principali fattori che contribuiscono alla struttura della membrana è il contenuto lipidico della membrana. Pertanto, abbiamo successivamente esaminato se i cambiamenti strutturali osservati nell’OCS fossero causati o associati ad alterazioni del profilo lipidico della piastrina.

Abbiamo eseguito un’analisi dettagliata di 294 lipidi attraverso le 22 classi e sottoclassi lipidiche più abbondanti, utilizzando la spettrometria di massa in tandem ionizzazione elettrospray cromatografia liquida.

Questa analisi ha rivelato un profilo lipidico invariato nel deficit di PI3KC2α rispetto alle piastrine di controllo della figliata (Fig. 3), senza differenze significative nell’abbondanza molare osservate in nessuna delle classi lipidiche analizzate.

PI3KC2α non regola la formazione di filopodia nelle piastrine
Abbiamo poi esaminato se l’alterazione strutturale nella membrana interna piastrinica influisce sulla funzione della membrana piastrinica mediante l’imaging della formazione di filopodia nelle piastrine attivate in sospensione o in presenza di forze di taglio.

Innanzitutto, le piastrine isolate sono state stimolate con ADP (in presenza di eptifibatide per prevenire l’aggregazione), quindi fissate e fotografate con SEM (Fig. 4A). Non sono state rilevate differenze nel numero o nella lunghezza della filopodia tra piastrine isolate da topi di controllo carenti di PI3KC2α o di lettiera (Fig. 4B, C).

Inoltre, sono stati esaminati anche filopodi formati da piastrine che scorrevano su un monostrato di piastrine attivate. Ancora una volta, non sono state osservate differenze nella lunghezza o nella stabilità del cavo (tempo totale di attacco) (Fig. 4D, E).

PI3KC2α regola l’adesione piastrinica e la formazione di trombi
Data la ridotta formazione di trombi arteriosi precedentemente osservata in topi con carenza di PI3KC2α, abbiamo esaminato la funzione piastrinica in un test di flusso di sangue intero microfluidico noto per essere dipendente dalla formazione di legami di membrana [10-12]. Il sangue di topo è stato perfuso attraverso un canale microfluidico rivestito con fattore di von Willebrand che incorporava una stenosi che induce il gradiente di forza di taglio [10-12]. L’aggregazione piastrinica si è verificata a valle della stenosi e la dimensione di questi aggregati piastrinici è stata quantificata, usando il segnale epifluorescente delle piastrine GFP-positive (Fig. 5). L’entità della deposizione piastrinica era significativamente più bassa nel sangue da topi con deficit di PI3KC2α (838 ± 314 μm2) rispetto a quella nel sangue da topi di controllo (2194 ± 485 μm2) – una riduzione del 62% (Fig. 5).

Insieme, questi risultati suggeriscono che la perdita di PI3KC2α porta a un cambiamento strutturale specifico nella membrana piastrinica che si verifica indipendentemente dalla composizione lipidica della membrana. Questa modifica della membrana è sufficiente per influire selettivamente sulla funzione piastrinica nella regolazione delle trombosi formate a valle di una stenosi che induce il gradiente di taglio e dipendente dal tethering della membrana.

Discussione
Abbiamo effettuato un’analisi delle conseguenze strutturali e funzionali della perdita di PI3KC2α nelle piastrine di topo al fine di ottenere approfondimenti sul meccanismo mediante il quale la carenza di PI3KC2α porta al fenotipo anti-trombotico precedentemente osservato.

Abbiamo dimostrato che la carenza di PI3KC2α porta a un cambiamento ultrastrutturale delle piastrine limitato alla membrana interna (OCS) di queste cellule. In particolare, l’OCS nelle piastrine di topi con carenza di PI3KC2α è stato dilatato in tutta la cellula, anche alla membrana plasmatica.

Questo cambiamento strutturale nella membrana piastrinica si è verificato indipendentemente dalla composizione lipidica della cellula. Tuttavia, l’ispezione della funzione della membrana piastrinica ha rivelato che la carenza di PI3KC2α ha avuto effetti selettivi in ​​condizioni protrombotiche: la formazione di filopodi non è stata influenzata, ma la deposizione e l’aggregazione piastrinica sono state significativamente compromesse in un modello di trombosi del flusso sanguigno intero ex vivo.

Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le piastrine di topi carenti di PI3KC2α mostrano una maggiore superficie occupata dai canali dell’OCS nelle immagini TEM [6, 8]. Qui, aggiungiamo a questi risultati per dimostrare che gli ingrandimenti precedentemente riportati nelle immagini TEM 2D sono riflettenti di una dilatazione diffusa e in gran parte uniforme dei canali di membrana in tutta la cellula, anche alla membrana del plasma.

La nostra dettagliata analisi tridimensionale delle piastrine carenti di PI3KC2α ha rivelato che questo cambiamento strutturale era specifico dell’OCS: il suo volume era significativamente aumentato nelle piastrine carenti di PI3KC2α mentre i volumi di alfa e granuli densi non erano interessati, nonostante il cambiamento occasionale nel numero di granuli o forma tra le singole cellule.

Inoltre, la dimensione delle aperture dell’OCS sulla membrana plasmatica era significativamente maggiore nelle piastrine carenti di PI3KC2α. Nonostante questa dilatazione dell’OCS in tutta la cellula, non è stata osservata alcuna variazione grossolana nella distribuzione spaziale dell’OCS attraverso la cellula.

Nonostante questi ovvi cambiamenti nella struttura della membrana cellulare, non è chiaro come la carenza di PI3KC2α porti a tali cambiamenti. In precedenza è stato dimostrato che il deficit di PI3KC2α riduce i livelli basali di PI (3) P nelle piastrine [8].

Tuttavia, questo piccolo cambiamento in un lipide a bassa abbondanza sembra improbabile che causi direttamente i cambiamenti strutturali nella membrana piastrinica osservati qui. Dato che il più grande predittore di qualsiasi struttura di membrana è la sua composizione lipidica, qui abbiamo ampliato questi studi precedenti eseguendo un’analisi completa del lipidoma sia delle piastrine carenti di PI3KC2α che di quelle selvatiche.

Questa analisi più ampia ha incluso tutte le specie lipidiche di membrana più abbondanti e ha rivelato che il profilo lipidico grossolano delle piastrine carenti di PI3KC2α era indistinguibile da quello delle piastrine di tipo selvaggio. Questi studi indicano che è improbabile che la dilatazione della membrana interna osservata sia guidata da cambiamenti nella composizione della membrana.

Questa è, per quanto ne sappiamo, l’analisi lipidomica più completa della piastrina del topo. Su questo, è interessante notare alcune potenziali differenze nell’abbondanza relativa di alcuni lipidi tra piastrine di topo e analisi lipidomiche simili di piastrine umane [15].

Ad esempio, mentre i fosfolipidi sono il componente predominante nelle membrane piastriniche del topo e umano, vi è un’abbondanza notevolmente maggiore di lipidi sterolici e una relativa scarsità di glicerolipidi nelle piastrine del topo rispetto all’uomo [15]. Resta da stabilire se queste differenze siano importanti in termini di funzione della membrana.

Precedenti studi hanno dimostrato un fenotipo antitrombotico in vivo conferito dalla perdita di PI3KC2α [6, 8]. Dato che le piastrine di questi topi carenti di PI3KC2α presentano un difetto strutturale specifico dell’OCS – una riserva di membrana che si ritiene venga utilizzata per il cambiamento e la diffusione della forma piastrinica durante l’attivazione e l’aggregazione [16] – abbiamo esaminato la funzione della membrana piastrinica sia in modo statico e ambienti di flusso sanguigno.

Abbiamo scoperto che la funzione della membrana piastrinica è influenzata specificamente nella regolazione della formazione di trombi. Qui, la produzione di filopodia nelle piastrine attivate dalla sospensione o sotto flusso non è stata influenzata dalla perdita di PI3KC2α, ma in un test microfluidico che incorporava una stenosi che induce un gradiente di taglio elevato, la carenza di PI3KC2α ha portato a una marcata riduzione della deposizione piastrinica.

Abbiamo utilizzato questo test di flusso sanguigno microfluidico a causa della sua incorporazione di una stenosi pronunciata che ha dimostrato di causare un gradiente di taglio sostanziale (da molto alto nel punto di restringimento stenotico, a molto basso immediatamente a valle della stenosi) [10-12] .

È importante sottolineare che studi in vivo sul comportamento piastrinico in seguito all’esposizione a un tale ambiente con gradiente di taglio (attraverso una stenosi vascolare) hanno dimostrato che la deposizione piastrinica iniziale si verifica in gran parte indipendentemente dall’attivazione cellulare da parte di agonisti solubili [12].

In effetti, tali gradienti di taglio sembrano guidare la deposizione piastrinica iniziale attraverso la formazione di attacchi a membrana [10-12]. Di conseguenza, la significativa riduzione della deposizione piastrinica in questo sistema usando sangue da topi PI3KC2α può suggerire che PI3KC2α è importante per le prime fasi di adesione piastrinica, dove i leganti di membrana, presumibilmente derivati ​​dall’OCS, vengono estratti dalle piastrine senza attivazione cellulare rilevabile tramite un’interazione tra il fattore di von Willebrand e il recettore dell’adesione piastrinica GPIbα [17].

Questa ipotesi si adatta alle nostre precedenti osservazioni in cui l’adesione piastrinica e la formazione di trombi carenti di PI3KC2α sono influenzate in modo differenziato in condizioni in cui l’attivazione piastrinica è sostanziale, cioè su una superficie rivestita di collagene su cui si verifica un’attivazione piastrinica marcata [6].

In alternativa, PI3KC2α può essere coinvolto nella successiva propagazione di aggregati piastrinici, poiché le piastrine in arrivo che si legano alla superficie della formazione di trombi sono discoide e mostrano bassi livelli di marcatori di attivazione e flusso minimo di calcio, in netto contrasto con il nucleo iniziale del trombo dove le piastrine sono generalmente completamente attivate [12, 18].

La mancanza di effetto della carenza di PI3KC2α sulla produzione di filopodia piastrinica in risposta all’attivazione cellulare può suggerire che il coinvolgimento di PI3KC2α è maggiormente prevalente laddove i cambiamenti nello stress da taglio sostengono e guidano la propagazione del trombo, potenzialmente in assenza di una cospicua attivazione indotta da agonisti. La sorprendente mancanza di effetto della carenza di PI3KC2α nei saggi standard della funzione piastrinica in vitro indotta dall’agonista [6, 8] supporta questa ipotesi.

Il legame intrigante tra la modulazione dipendente dalla PI3KC2α della struttura della membrana interna piastrinica e la funzione piastrinica compromessa in particolare nella regolazione del flusso sanguigno suggerisce che il targeting PI3KC2α e / o il sistema di membrana interna piastrinica possa avere utilità come strategia anti-trombotica. Tuttavia, non è noto se questa funzione di PI3KC2α si traduca in piastrine umane.

Inoltre, la rilevanza dei cambiamenti nella struttura della membrana piastrinica per la funzione piastrinica umana è completamente inesplorata. Esistono numerose sindromi cliniche in cui si osservano anomalie nell’OCS, comprese alcune con sanguinamento o conseguenze trombotiche [19-21].

Tuttavia, le piastrine di pazienti con queste condizioni dimostrano una serie di anomalie strutturali oltre ai cambiamenti di OCS, rendendo difficile determinare quanto, eventualmente, il contributo del difetto di OCS al fenotipo clinico.

Lo sviluppo di inibitori PI3KC2α sarebbe un utile passo avanti nel determinare il ruolo di questo enzima nelle piastrine umane e nell’affrontare qualsiasi validità di questo target come approccio antitrombotico.

Se la funzione PI3KC2α viene conservata nelle piastrine umane e l’inibizione acuta di questo enzima è in grado di riprodurre il fenotipo osservato nelle piastrine di topo, ciò apre la possibilità di manipolare la struttura della membrana piastrinica tramite PI3KC2α come una nuova strategia antipiastrinica specifica per la trombosi.

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