ATP: le iniezioni di adenosina trifosfato possono favorire la crescita del tessuto cartilagineo

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I risultati dello studio ruotano attorno all’idea consolidata che i meccanismi all’interno delle cellule animali e umane trasformano gli zuccheri, i grassi e le proteine ​​che mangiamo in energia utilizzata dai milioni di cellule del corpo.

La molecola più utilizzata per immagazzinare quell’energia è chiamata adenosina trifosfato, o ATP.

Insieme a questo ruolo centrale nel metabolismo, l’adenosina aiuta anche a segnalare altre cellule e funge da elemento costitutivo del materiale genetico, quindi è fondamentale per la crescita del tessuto umano.

Ricerche precedenti avevano dimostrato che il mantenimento delle scorte di adenosina , nota per nutrire le cellule condrocitiche che producono la cartilagine, previene anche l’artrosi in modelli animali simili della malattia.

Nel nuovo studio condotto dalla NYU Grossman School of Medicine, i ricercatori hanno iniettato adenosina nelle articolazioni di roditori i cui arti erano stati danneggiati dall’infiammazione derivante da lesioni traumatiche, come un legamento lacerato, o da un massiccio aumento di peso che esercitava pressione sulle articolazioni.

Il danno biologico in questi casi è simile, dicono i ricercatori, a quello subito nell’osteoartrite umana.

Pubblicando online sulla rivista Scientific Reports il 10 agosto, i roditori dello studio hanno ricevuto otto iniezioni settimanali di adenosina, che hanno indotto tassi di ricrescita del tessuto cartilagineo tra il 50% e il 35%, misurati dai punteggi di laboratorio standard.

“Il nostro ultimo studio mostra che il reintegro delle riserve di adenosina mediante iniezione funziona bene come trattamento per l’artrosi nei modelli animali della malattia e senza effetti collaterali apparenti”, afferma l’autore principale dello studio Carmen Corciulo, Ph.D., borsista post-dottorato presso la NYU Langone.

Corciulo dice che è troppo presto per usare questo modello sperimentale come terapia nelle persone.

Gli studi clinici devono attendere un farmaco di prova che possa essere conservato in sicurezza per giorni se non settimane e gli esperimenti su mammiferi più grandi.

Il ricercatore senior dello studio Bruce Cronstein, MD, il Dr. Paul R. Esserman Professore di Medicina presso la NYU Langone Health, afferma che la ricerca del team è importante perché le poche terapie farmacologiche esistenti per l’osteoartrite, come il paracetamolo e i farmaci inibitori della COX-2, incluso il naprossene e ibuprofene, solo dolori articolari intorpiditi, o come l’acido ialuronico, solo lubrificare i suoi tessuti.

Nessuno blocca la progressione della malattia o inverte il danno. Gli antidolorifici, come gli oppioidi, sono spesso prescritti, ma creano anche una forte dipendenza, avverte.

“Le persone con osteoartrite hanno un disperato bisogno di più opzioni di trattamento con meno effetti collaterali, e la nostra ricerca porta avanti questo sforzo”, afferma Cronstein, che è anche direttore del Clinical and Translational Science Institute (CTSI).

Ha notato che altri farmaci sperimentali sono in fase di sviluppo altrove, tra cui l’ormone paratiroideo per stimolare la crescita ossea, farmaci inibitori WNT per bloccare l’osso e la degradazione della cartilagine e sostanze chimiche del fattore di crescita per promuovere la crescita della cartilagine.

Cronstein, Corciulo e NYU Grossman School of Medicine hanno una domanda di brevetto in corso di registrazione per l’uso di adenosina e altri agenti che aiutano con il suo legame ai condrociti, chiamati agonisti del recettore A2A, per il trattamento dell’osteoartrite.

Tra le altre scoperte chiave dello studio c’era che un percorso di segnalazione cellulare, noto come fattore di crescita trasformante beta (TGF-beta) e coinvolto in molte forme di crescita, morte e differenziazione dei tessuti, era altamente attivo anche nel tessuto cartilagineo danneggiato dall’osteoartrite. come nel tessuto cartilagineo in riparazione dopo essere stato trattato con adenosina.

Ulteriori test su condrociti coltivati ​​in laboratorio da persone con osteoartrite hanno mostrato diversi profili chimici della segnalazione del TGF-beta durante la degradazione rispetto alla crescita, fornendo la prima prova che il percorso cambiava la funzione in presenza di adenosina (dall’assistenza nella rottura della cartilagine all’incoraggiamento alla sua riparazione .)

Lo sviluppo di trattamenti per arrestare o rallentare la malattia è importante, afferma Cronstein, perché si stima che oltre 100 milioni di persone in tutto il mondo soffrano di artrosi, che è legata all’invecchiamento, soprattutto nelle donne.

Questa cifra, dice, dovrebbe crescere solo quando più persone vivono più a lungo e i tassi di obesità aumentano.

“Al momento, l’unico modo per fermare l’artrosi è sostituire chirurgicamente le articolazioni colpite, il che non solo comporta dolore e rischio di infezione, ma è anche piuttosto costoso”, afferma Cronstein.

“Se nuove terapie possono ritardare o prevenire l’insorgenza e la progressione della malattia, un minor numero di sostituzioni articolari salverà le persone da molti dolori e spese”.


Le proprietà della cartilagine articolare consentono un movimento quasi privo di attrito nelle articolazioni e la capacità di assorbire grandi carichi.1

Sfortunatamente, quando la cartilagine è danneggiata, non può ripararsi adeguatamente per recuperare la sua funzione precedente.1

L’ingegneria tissutale, un approccio promettente per riparare la cartilagine danneggiata, attualmente non riesce a creare tessuto funzionale.2 In genere, i costrutti di ingegneria tissutale mostrano proprietà meccaniche inferiori rispetto alla cartilagine articolare nativa principalmente a causa dell’accumulo insufficiente di componenti della matrice extracellulare (ECM). 3-6

La cartilagine dipende dalle forze meccaniche per lo sviluppo e il mantenimento dell’ECM con un rapporto specifico tra collagene e proteoglicani (tipicamente tra 2: 1 e 3: 1), il che contribuisce alle sue proprietà meccaniche uniche.1,5

Tuttavia, non è né semplice né efficiente stimolare meccanicamente i tessuti in coltura a causa delle limitazioni sulle dimensioni e sulla forma dei costrutti che possono essere coltivati.

Mirare alle vie sottostanti della meccanotrasduzione responsabili come mezzo per creare tessuto funzionale è una strategia alternativa per l’ingegneria dei tessuti che è stata esplorata di recente dal nostro gruppo.7

Una molecola che sembra essere parte integrante di una particolare via di meccanotrasduzione dei condrociti è l’adenosina trifosfato (ATP), chiamata via del recettore purinergico.

La segnalazione di ATP è stata implicata nelle vie di meccanotrasduzione in molti diversi tipi di cellule tra cui cellule epiteliali, astrociti, osteoblasti e condrociti.8

Nei condrociti articolari, l’ATP è la prima molecola nota ad essere rilasciata a seguito di stimolazione meccanica e agisce come una molecola di segnalazione autocrina / paracrina.9

L’ATP agisce sui recettori P2 sulla membrana plasmatica per promuovere la sintesi dell’ECM.10 Mentre altri nucleotidi hanno anche un’affinità simile per i recettori P2, come l’uridina trifosfato (UTP) e gli analoghi dell’ATP 10, è stato dimostrato che l’integrazione con ATP esogeno o UTP induce effetti simili sulla sintesi di ECM in colture di pellet di condrociti bovini 11

In precedenza, abbiamo anche osservato che l’aggiunta di ATP esogeno a colture cartilaginee ingegnerizzate in vitro stimolava la sintesi di collagene e proteoglicano e migliorava significativamente le proprietà meccaniche del tessuto sviluppato.7

Tuttavia, sembrava esserci un effetto dose di ATP sulle colture cartilaginee che giustificava ulteriori indagini. Alte dosi di ATP (250 µM), pur provocando una maggiore sintesi della matrice, non hanno determinato un aumento dell’accumulo di ECM.7

Inoltre, l’espressione genica della metalloproteinasi 13 della matrice (MMP-13 o collagenasi 3) era 2 volte maggiore a dosi elevate di ATP. 

Allo stesso modo, in altri studi, è noto che alte dosi di ATP esogeno evocano il rilascio di mediatori infiammatori, 12,13 avviano il turnover della matrice, 14,15 e inducono la mineralizzazione.16

Effetti indesiderati, come la mineralizzazione della cartilagine articolare, sono stati associati ad un accumulo di pirofosfato inorganico extracellulare (ePPi), che è un sottoprodotto della degradazione dell’ATP.17

In mezzi fisiologici, basse concentrazioni di ePPi agiscono per inibire la mineralizzazione, mentre un eccesso di ePPi è stato implicato nella formazione di cristalli di calcio pirofosfato diidrato (CPPD).

Sebbene la formazione di cristalli di CPPD sia scarsamente compresa, questi cristalli possono essere un segno di mineralizzazione patologica nell’articolazione (condrocalcinosi) e sono associati a dolore articolare e conseguente degradazione della cartilagine.18,19

Esistono prove di 2 potenziali vie di segnalazione che collegano la presenza di cristalli CPPD a un aumento del turnover della matrice. 

I cristalli CPPD si legano ai recettori toll-like (TLR) sulla membrana plasmatica attraverso un percorso dipendente dalla fosfatidilinositolo 3chinasi (PI3K) o possono essere potenzialmente endocitizzati e suscitare cambiamenti attraverso un percorso dipendente dalla proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK). 22

Pertanto, lo scopo di questo studio era identificare il meccanismo del catabolismo mediato da ATP e determinare un intervallo di dose terapeutica di ATP per la cartilagine ingegnerizzata per massimizzare la risposta anabolica rispetto a quella catabolica.

Discussione

L’applicazione del carico meccanico ai costrutti cartilaginei ingegnerizzati è un metodo ampiamente utilizzato per migliorare la crescita dei tessuti e le proprietà meccaniche.3-6

Sebbene questo approccio abbia avuto molto successo, esistono limitazioni nell’applicare stimoli meccanici a costrutti di forma anatomica con geometria irregolare e / o raggi di curvatura elevati.

In alternativa, sfruttando le note vie di meccanotrasduzione responsabili, può essere possibile ottenere lo stesso effetto in assenza di forze applicate esternamente. In un recente studio, abbiamo dimostrato che la stimolazione diretta del percorso del recettore ATP-purinergico attraverso l’integrazione esogena di ATP può suscitare una risposta anabolica comparabile ed essere utilizzata per migliorare sia la crescita dei tessuti che le proprietà meccaniche del tessuto sviluppato.7

Tuttavia, dosi elevate di ATP (250 µM) hanno prodotto una risposta catabolica simultanea caratterizzata da un aumento dell’espressione di MMP-13, potenzialmente dovuto all’accumulo di ePPi.7

Nel presente studio, abbiamo determinato un intervallo di dose terapeutica di ATP esogeno per massimizzare la risposta anabolica e accertato che il turnover della matrice mediato da ATP era molto probabilmente il risultato della formazione e dell’endocitosi di cristalli contenenti calcio da ePPi accumulati nei terreni di coltura .

L’ATP può essere catabolizzato da enzimi di degradazione dei nucleotidi solubili (p. Es., Fosfatasi alcalina aspecifica tissutale, transglutaminasi tissutale) e / o legati alla membrana (p. Es., Pirofosfatasi nucleotidica / fosfodiesterasi, ecto-5′-nucleotidasi) che degradano i nucleotidi dopo il legame del recettore P2 (purinergico), entrambi portando alla formazione di ePPi.

La PPi, misurata dal terreno di coltura condizionato dopo 4 settimane di esposizione ai nucleotidi, è risultata significativamente aumentata in risposta alla stimolazione di ATP. Ciò è coerente con studi precedenti che hanno anche rilevato un aumento di ePPi da terreni di coltura condizionati sia di espianti suini che di condrociti in colture monostrato come risultato della segnalazione del recettore P2.30

Esiste un intervallo molto ristretto per la concentrazione fisiologica di ePPi nella cartilagine articolare umana normale, con liquido sinoviale nel ginocchio contenente 10 ± 0,5 µM PPi (determinato su 50 individui) .31

Il livello basale medio di PPi rilevato nei terreni condizionati che circondano le colture 3-D nella presente indagine era simile a questi valori, a circa 10 µM. Poiché l’integrazione di 250 µM di ATP ha aumentato l’attività di MMP-13 insieme all’aumentata presenza di ePPi, l’ePPi accumulato potrebbe aver contribuito agli effetti catabolici osservati con dosi elevate di ATP esogeno.

Anche i livelli di PPi, determinati dai digeriti dei costrutti coltivati ​​in 3-D, sono stati studiati per ottenere una migliore comprensione dell’omeostasi di PPi in prossimità delle cellule.

Non sono state osservate differenze significative nella quantità di PPi presente nella digestione dei tessuti, suggerendo che molto probabilmente veniva utilizzato un eccesso di ePPi e ha spinto la nostra indagine meccanicistica su come PPi stava contribuendo al catabolismo mediato da ATP.

Al fine di determinare una dose ottimale di ATP esogeno per i costrutti coltivati ​​3-D, sono state studiate dosi aggiuntive che fiancheggiano 62,5 µM (31,25 e 125 µM). L’attività di MMP-13 è stata scelta come misura del catabolismo perché era l’unico enzima di degradazione della matrice che è stato osservato per essere stimolato come risultato della stimolazione dell’ATP.7

Tuttavia, il limite di questo approccio è che l’attività di MMP-13 potrebbe non riflettere necessariamente tutti i processi catabolici in atto. Allo stesso modo, la sintesi dell’ECM determinata alla fine del periodo di coltura (4 settimane) riflette solo la risposta anabolica nell’ultimo periodo di 24 ore dopo l’esposizione a lungo termine all’ATP.

Per questo motivo, le conclusioni sono state tratte confrontando i modelli di attività di MMP-13 e sintesi di ECM con la formazione e le proprietà dei tessuti a lungo termine osservate in precedenza.7 I modelli sia per la sintesi di ECM che per l’attività di MMP-13 come risultato della stimolazione di ATP erano sorprendentemente simile.

La sintesi dell’ECM e l’attività di MMP-13 sono aumentate con l’aumentare della dose di ATP e sono rimaste relativamente stazionarie tra 62,5 e 125 µM. In precedenza, è stato osservato che colture stimolate con ATP (62,5 e 250 µM) producevano tessuto con proprietà più indicative della cartilagine nativa, con moduli di indentazione da 5 a 6,5 ​​volte più grandi dei controlli non stimolati.7

Sebbene l’accumulo a lungo termine di collagene e proteoglicani non sia stato studiato a 125 µM, le proprietà meccaniche risultanti da 62,5 e 250 µM non differivano significativamente l’una dall’altra, portando a supporre che 125 µM ATP avrebbe provocato un effetto simile su proprietà meccaniche.

Pertanto, l’intervallo di dose di ATP tra 62,5 e 125 µM è stato determinato come ottimale per massimizzare l’effetto anabolico e ridurre al minimo l’effetto catabolico dell’ATP esogeno per costrutti cartilaginei ingegnerizzati nei nostri esperimenti particolari.

Va ricordato che a causa dell’interferenza con il test di attività MMP-13, le concentrazioni sieriche dovevano essere ridotte in questi studi. 

Sebbene ciò possa influire sul confronto dei risultati, le concentrazioni sieriche sono state ridotte solo durante il cambio di terreno finale (48 ore) del periodo di coltura di 4 settimane, suggerendo che qualsiasi effetto potenziale sarebbe minimo.

È stato dimostrato che un eccesso di ePPi induce un aumento dell’espressione genica di MMP-13 nella coltura monostrato di condrociti articolari bovini.20

Nel presente studio, l’attività di MMP-13 era aumentata in risposta a 10 µM PPi, ma non 1 µM PPi, attraverso un Percorso dipendente da MAPK.

Ciò fornisce la prova che cambiamenti relativamente piccoli nella concentrazione di ePPi possono portare ad aumenti significativi nell’attività dei condrociti di MMP-13. Sebbene PPi possa sembrare un potenziale candidato per suscitare il catabolismo, il suo metodo di azione non è chiaro.

Non esiste una via di ingresso diretta nota per ePPi nella cellula, 17 e l’accumulo di PPi intracellulare come risultato di molteplici reazioni intracellulari32 viene eliminato dal citosol nello spazio extracellulare solo dal canale transmembrana a 1 via, proteina anchilosi progressiva ( ANK) .17,33

Inoltre, attualmente non esiste alcun canale o recettore noto che trasporta o lega attivamente ePPi per indurre vie di segnalazione intracellulari.

Quando colture monostrato sono state esposte a ePPi in terreni privi di calcio, gli aumenti mediati da PPi osservati in precedenza nell’attività di MMP-13 non si sono manifestati. Questo risultato implica calcio e pirofosfato come fattori chiave coinvolti nella risposta catabolica mediata da PPi. La mineralizzazione PPi potrebbe potenzialmente spiegare questo fenomeno.

È stato dimostrato che i cristalli di CPPD si formano spontaneamente a concentrazioni relativamente basse di PPi (> 10 µM) in presenza di calcio (oltre ad essere influenzati dal pH e dalle concentrazioni di sodio e magnesio) .34

I cristalli di CPPD possono legarsi ai TLR, in particolare TLR2, sulla membrana plasmatica e stimola l’espressione genica di MMP-13 attraverso un percorso dipendente da PI3K20,21 o, in alternativa, potenzialmente endocitato e provoca cambiamenti attraverso un percorso dipendente da MAPK.22

L’attivazione del percorso TLR è stata associata a infiammazione, caratterizzato da un aumento del rilascio di ossido nitrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2)

Nel nostro studio precedente, il rilascio di PGE2 e NO non era influenzato dalla stimolazione di ATP a tutte le dosi studiate (fino a 250 µM) .7 Allo stesso modo, l’inibizione della via dipendente da PI3K da parte di LY294002 non ha abolito l’induzione relativa dell’attività di MMP-13 da esogeni ppi.

In alternativa, l’inibizione della via dipendente da MAPK (in particolare MEK1 / 2) da parte di U0126 ha abrogato l’attività di MMP-13 indotta da PPi, suggerendo che l’endocitosi cristallina e l’attivazione di MEK1 / 2 (a monte di MAPK) potrebbero essere il meccanismo d’azione predominante del catabolismo come risultato della stimolazione ATP.

Un risultato potenzialmente confondente è stata la mancanza di identificazione diretta dei cristalli CPPD nei costrutti coltivati ​​3-D da TEM. Tuttavia, è possibile che i cristalli di CPPD siano stati prima endocitati e successivamente degradati, il che è stato dimostrato per l’attività metalloproteinasi indotta da cristalli di idrossiapatite.35

Anche la rilevazione dei cristalli di CPPD è spesso irta di difficoltà18,36 perché i cristalli possono essere piccoli e sparsi, richiedendo metodi di analisi più sofisticati.36 Forme amorfe di pirofosfato di calcio (sono state identificate più di 30 tipi) indotte da PPi in eccesso potrebbero anche potenzialmente suscitare risposte cataboliche dai condrociti attraverso un meccanismo simile. 37

Gli studi che hanno identificato positivamente i cristalli di CPPD nella cartilagine articolare come risultato dell’ATP esogeno hanno utilizzato concentrazioni significativamente maggiori rispetto a quelle utilizzate nel presente studio (> 1 mM ATP) 16,38,39 e specificamente si proponevano di indurre uno stato di mineralizzazione patologica o condrocalcinosi (presenza patologica di cristalli di CPPD nello spazio articolare) .19

È necessario un lavoro futuro per confermare la presenza di cristalli CPPD nei costrutti coltivati ​​3-D. Inoltre, va notato che LY294002, in assenza di PPi esogeno, sembrava sovraregolare l’attività della MMP-13.

Sebbene la ragione esatta di ciò sia attualmente sconosciuta, la via di segnalazione PI3K è un importante regolatore della funzione cellulare e del rimodellamento dell’ECM e può influenzare altre vie di segnalazione a valle coinvolte nell’infiammazione e nel turnover della matrice.40

Sebbene sia necessario un lavoro futuro per ottenere una migliore comprensione degli effetti di LY294002, l’inibizione della via di segnalazione PI3K non ha avuto alcun effetto apparente sull’induzione dell’attività di MMP-13 in risposta a PPi esogeno.

Questi risultati suggeriscono che i cristalli contenenti calcio, potenzialmente formati da un eccesso di ePPi in presenza di Ca2 +, possono sovraregolare l’MMP-13 attraverso un meccanismo che coinvolge l’endocitosi dei cristalli, e possibilmente la successiva dissoluzione, e la via MAPK.

Se effettivamente i cristalli di CPPD stanno causando un aumento dell’attività dell’MMP-13 come risultato della stimolazione dell’ATP, gli inibitori della mineralizzazione, ad esempio il fosfocitrato41, potrebbero essere potenzialmente utilizzati insieme all’ATP per estendere ulteriormente il range terapeutico.

Il fosfocitrato è un inibitore naturale della mineralizzazione che è stato utilizzato in diversi studi in vitro per inibire sia la CPPD che la formazione di cristalli di idrossiapatite.41

Il fosfocitrato agisce limitando la nucleazione, la crescita e l’aggregazione dei sali di calcio41 e ha anche dimostrato di bloccare la sintesi di MMP indotta dai cristalli.42

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Provided by NYU Langone Health

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