Poiché il COVID-19 continua a diffondersi, i colli di bottiglia nelle forniture e nel personale di laboratorio hanno portato a lunghi tempi di attesa per i risultati in alcune aree.
In un nuovo studio, dell’Università dell’Illinois, i ricercatori di Urbana-Champaign hanno dimostrato un prototipo di un test molecolare COVID-19 rapido e uno strumento portatile semplice da usare per leggere i risultati con uno smartphone in 30 minuti, che potrebbe abilitare il punto -diagnosi di cura senza la necessità di inviare campioni a un laboratorio.
“Se un tale dispositivo e test fossero disponibili, potremmo testare il COVID-19 in occasione di eventi pubblici, auditorium, grandi raduni e potenzialmente anche a casa per l’auto-test.
I risultati potrebbero essere rinviati al sistema sanitario pubblico appropriato per il coordinamento “, ha affermato Rashid Bashir, professore di bioingegneria e decano del Grainger College of Engineering dell’Illinois.
Bashir ha co-condotto lo studio con il professore di ingegneria elettrica e informatica Brian Cunningham e il professore di scienze meccaniche e ingegneria Bill King.
I test tipici per SARS-CoV-2, il virus che causa COVID-19, prelevano un campione da un paziente con un lungo tampone nasofaringeo, inseriscono quel tampone in una sostanza chiamata mezzo di trasporto virale e lo inviano a un laboratorio per un processo a più fasi per estrarre, isolare e moltiplicare l’RNA rivelatore all’interno del virus.
Questo processo di moltiplicazione dell’RNA, chiamato RT-PCR, richiede diversi cicli di fluttuazione della temperatura, attrezzature specializzate e personale addestrato, ha detto Cunningham.
Come riportato negli Atti della National Academy of Sciences , il team dell’Illinois ha utilizzato un processo più semplice per analizzare il mezzo di trasporto virale, chiamato LAMP, che bypassa le fasi di estrazione e purificazione dell’RNA.
“LAMP necessita solo di una temperatura – 65 C – quindi è molto più facile da controllare”, ha detto il dottorando Anurup Ganguli, il primo autore dello studio.
“Inoltre, LAMP funziona in modo più robusto della PCR, soprattutto quando ci sono contaminanti nel campione di prova. Possiamo solo riscaldare brevemente il campione, rompere il virus e rilevare la sequenza genetica che identifica specificamente SARS-CoV-2 “.
I ricercatori hanno confrontato il dosaggio LAMP con la PCR, utilizzando prima un fluido nasale sintetico addizionato di virus e poi con campioni clinici. Hanno scoperto che i risultati erano in accordo con i risultati della PCR e hanno documentato la sensibilità e la specificità del test LAMP.
Quindi, i ricercatori hanno incorporato il test LAMP su una piccola cartuccia microfluidica stampata in 3-D che ha due slot di ingresso per le siringhe: uno per il mezzo di trasporto virale contenente il campione, uno per i prodotti chimici LAMP. Una volta che i due vengono iniettati, reagiscono all’interno della cartuccia.
“Usiamo una moderna produzione additiva ad alta velocità per realizzare queste cartucce. L’intera cosa può essere rapidamente scalata fino a centinaia di migliaia di test “, ha detto King.
“L’incremento della produzione è in genere il più grande ostacolo per le applicazioni commerciali delle cartucce microfluidiche e possiamo superare tale ostacolo utilizzando questo nuovo approccio. La moderna produzione additiva è elastica e scalabile e può essere accelerata molto rapidamente rispetto alle tecnologie di produzione legacy “.
Il team sta lavorando con Fast Radius Inc. , una società tecnologica con sede a Chicago, cofondata da King, per produrre le cartucce microfluidiche.
La cartuccia può essere inserita in uno strumento portatile palmare con una camera di riscaldamento, che riscalda la cartuccia a 65 gradi Celsius per la durata della reazione, e una base per smartphone per la lettura dei risultati. In circa 30 minuti, un risultato positivo emetterà luce fluorescente.
“Il lettore illumina gli scomparti dei liquidi con la luce dei LED blu, mentre la fotocamera posteriore del telefono registra un filmato della luce fluorescente verde generata”, ha detto Cunningham.
I ricercatori hanno dimostrato il dispositivo portatile con campioni clinici aggiuntivi e hanno scoperto che i risultati corrispondevano a quelli della procedura standard di laboratorio PCR.
I ricercatori stanno esplorando se il test funzionerebbe con campioni di saliva per eliminare la necessità di tamponi nasofaringei e raccogliendo più dati sui pazienti mentre considerano i passaggi successivi per le approvazioni normative, ha detto Bashir.
Due preprint pubblicati nell’ultima settimana suggeriscono che la scienza è già qui per rendere possibile un test COVID-19 semplice e di facile lettura.
Uno studio proviene da un gruppo di ricercatori della Weill Cornell Medical School di New York, l’epicentro dell’epidemia negli Stati Uniti. L’altro proviene da un gruppo del Technion – Israel Institute of Technology di Haifa, Israele.
Il cuore della tecnica riportata in entrambi gli articoli è l’amplificazione isotermica mediata dal loop, o LAMP. Sviluppato da un gruppo giapponese di ricercatori presso la Osaka University Medical School in Giappone due decenni fa, LAMP viene eseguito in un unico tubo, a una temperatura costante per un costo molto basso, per rilevare il DNA. La tecnica amplifica rapidamente il DNA, con alta specificità ed efficienza.
LAMP si basa sulla DNA polimerasi e un set da quattro a sei primer, progettati per riconoscere un totale di sei sequenze distinte sul DNA bersaglio.
Uno dei primer interni avvia lo spostamento e l’amplificazione del filo. Un filamento che sposta la DNA polimerasi sposta i due filamenti di DNA originali mentre crea un nuovo filamento. Un primer separato sposta quindi il filo appena creato e si forma un anello a causa di sequenze complementari sui primer.
Il processo di spostamento, amplificazione e formazione di anelli continua fino a quando il DNA non forma una struttura a manubrio. È l’accumulo di questi sottoprodotti di amplificazione che può essere facilmente rilevato. (Per una spiegazione visiva su come funziona LAMP, guarda il video alla fine di questo articolo.)
Aggiungere al protocollo di cui sopra una fase di trascrittasi inversa e il rilevamento dell’RNA può essere eseguito in modo simile, utilizzando RT-LAMP.
Il lavoro di Isreal è pubblicato come preprint in MedRxiv . Il titolo della prestampa (un documento che non è stato ancora sottoposto al processo di revisione tra pari) è ” Rilevazione di virus sul posto SARS-CoV-2 direttamente dai pazienti. “
Gli autori hanno sviluppato RT-LAMP per il rilevamento dell’RNA di SARS-CoV-2 direttamente da tamponi diagnostici clinici di pazienti umani, senza passaggi di purificazione dell’RNA. Hanno passato del tempo ad aggiustare il protocollo, modificandolo specificamente per SARS-CoV-2. Dopo il primo ciclo di test, non c’erano falsi positivi, ma il tasso di veri positivi era molto basso. Hanno continuato a regolare le condizioni, per trovare le condizioni ottimali. Una volta convalidato il protocollo sui tamponi nasali, si è passati ai campioni di saliva. Usando un set molto piccolo di campioni auto-raccolti – da tre diversi pazienti confermati e un soggetto sospettato negativo – i pazienti confermati sono stati trovati positivi sia in RT-LAMP che in RTqPCR dalla saliva, e il soggetto sospetto negativo è stato confermato negativo.
“La semplicità di rilevare SARS-CoV-2 senza un’elaborata fase di estrazione e purificazione dell’RNA e il fatto che questo metodo può ridurre significativamente il numero di professionisti richiesti per i test di rilevamento SARS-CoV-2” sono ciò che Naama Geva-Zatorsky, PhD, il professore di nanobiotecnologia e nanomedicina presso il Technion – Israel Institute of Technology e autore senior dell’articolo, trova la cosa più eccitante.
Geva-Zatorsky ha aggiunto che immaginano il test RT-LAMP utilizzato come test di sorveglianza per un gran numero di persone nella comunità. “Il rilevamento è fondamentale”, hanno scritto gli autori. “Riteniamo”, hanno continuato, “che un metodo di rilevamento semplice e facile, preferibilmente uno che può essere eseguito e interpretato sul posto, potrebbe alleviare alcune delle limitazioni attuali e aiutare a eseguire una strategia di uscita efficiente e sicura dai blocchi. “
LAMP rintraccia SARS-CoV-2 in giro per New York
Il laboratorio Mason di Weill Cornell ha segnalato la scorsa settimana lo sviluppo di un simile test colorimetrico basato su LAMP in grado di identificare la presenza di SARS-CoV-2 da campioni sia orali che nasofaringei.
Questa pandemia COVID-19, hanno scritto, ha evidenziato una pressante necessità di “diagnostica rapida e scalabile in grado di rilevare l’infezione da SARS-CoV-2, interrogare l’evoluzione del ceppo e mappare la risposta dell’ospite nei pazienti”.
Il loro lavoro è stato pubblicato in un preprint la scorsa settimana su bioRxiv intitolato ” Profili trascrittomi host, virali e ambientali della sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)”.
Il team ha progettato e ottimizzato il dosaggio rapido LAMP per rilevare l’infezione da SARS-CoV-2 da campioni di tamponi nasofaringei e lisati di tamponi orofaringei. Quando è stato testato per l’efficacia su 201 campioni clinicamente annotati, il test aveva una specificità del 99% e una sensibilità del 95%.
Il team ha quindi sviluppato una piattaforma metatranscriptomica per fucili a pompa su larga scala per profilare in modo completo i campioni di tamponi nasofaringei raccolti da pazienti con RNA-seq.
Entrambe le tecnologie sono state utilizzate per profilare 338 campioni clinici testati per SARS-CoV-2 e 86 campioni ambientali raccolti da aree ad alto transito nella metropolitana di New York all’inizio di marzo 2020.
In questo modo, hanno creato un quadro molecolare ampio dell’epidemia di COVID-19 a New York.
L’utilizzo di LAMP per i test COVID-19 è “una grande idea che deve solo essere ottimizzata e ottimizzata”, ha osservato Chris Mason, PhD, professore associato al Weill Cornell Medical College e autore senior dell’articolo. Entrambi gli studi, ha osservato Mason, dimostrano che ha “un reale potenziale per un uso ampio e facile”.
Gli autori del documento medRxiv hanno scritto che i passi successivi necessari per portare questo alla clinica sono “ulteriori aggiustamenti del protocollo su campioni di saliva, testati su un’ampia coorte e confrontati con il metodo standard”.
La sua semplicità e il basso costo, hanno aggiunto, aumenteranno la facilità di monitorare continuamente i soggetti sospetti. Con un ulteriore sviluppo, hanno affermato, questo metodo può essere applicato a cliniche mediche, punti di ingresso, case di cura, luoghi di lavoro e altro, e può anche essere facilmente adattato anche ad altri patogeni emergenti.
Ulteriori informazioni: Anurup Ganguli et al, Rapid isothermal amplification and portable detection system for SARS-CoV-2, Proceedings of the National Academy of Sciences (2020). DOI: 10.1073 / pnas.2014739117
