La mutazione minima di SARS-CoV-2 da dicembre 2019 suggerisce che un vaccino globale è fattibile

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L’analisi genetica delle sequenze di oltre 27.000 individui infettati dal coronavirus che causa il COVID-19 rivela che il virus è mutato in minima parte da dicembre 2019, suggerendo che un vaccino sarebbe sufficiente per combattere le infezioni globali.

Lo studio è stato condotto da un team di scienziati del Walter Reed Army Institute of Research guidato da Morgane Rolland, capo della genetica virale e sierologia dei sistemi per il programma di ricerca sull’HIV militare di WRAIR e dal dott.Kayvon Modjarrad, direttore del programma di malattie infettive emergenti dell’istituto .

Un manoscritto che dettaglia i risultati è stato pubblicato in  Proceedings of the National Academy of Sciences.

Per caratterizzare la diversificazione del coronavirus SARS-CoV-2 dall’inizio della pandemia, hanno allineato 18.514 sequenze genomiche di virus indipendenti campionate da individui in 84 paesi e le hanno scansionate per le variazioni.

Le analisi rivelano stime basse della differenziazione genetica dopo l’epidemia iniziale e indicano che, finora, il genoma di SARS-CoV-2 si è evoluto attraverso un processo per lo più casuale piuttosto che attraverso l’adattamento agli ospiti umani che incontra.

“Come altri rapporti, abbiamo notato che la mutazione D614G nello Spike è rapidamente aumentata in frequenza dall’inizio dell’epidemia, ma non siamo riusciti a collegare questa mutazione a specifiche forze di adattamento”, ha detto Rolland.

“Quando i virus si replicano e si diffondono nella popolazione, ci aspettiamo di vedere alcune mutazioni e alcune possono essere risolte molto rapidamente in un’epidemia solo per caso”.

Rolland ha osservato che il collegamento dei genotipi ai fenotipi è complicato e sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno le conseguenze funzionali della mutazione D614G in SARS-CoV-2.

Dato il basso livello di variazione genetica, un promettente candidato vaccino sarebbe probabilmente ugualmente efficace contro tutti i ceppi attualmente in circolazione del coronavirus COVID-19.

“La diversità virale ha sfidato gli sforzi di sviluppo di vaccini per altri virus come l’HIV, l’influenza e la dengue, ma i campioni globali mostrano che SARS-CoV-2 è meno diversificato di questi virus”, ha detto Rolland.

“Possiamo quindi essere cautamente ottimisti sul fatto che la diversità virale non dovrebbe essere un ostacolo per lo sviluppo di un vaccino ampiamente protettivo contro l’infezione da COVID-19″.

Modjarrad co-guida gli sforzi di risposta al COVID-19 dell’istituto, compreso lo sviluppo di un vaccino contro COVID-19.

Il principale candidato vaccino di WRAIR è costruito su una piattaforma di nanoparticelle di ferritina Spike e dovrebbe entrare nei test umani prima del 2021.

Il vaccino è abbinato a un adiuvante brevettato che è stato sviluppato anche da WRAIR, la formulazione dei liposomi dell’esercito, per aumentare ulteriormente la risposta immunitaria.

“Gli scienziati stanno lavorando duramente per accelerare lo sviluppo di un vaccino COVID-19 che sia sicuro ed efficace per il mondo intero, ora e negli anni a venire.

Questi dati sono fondamentali per informare gli sforzi collettivi del campo nell’ottenere un vaccino che sia rapidamente scalabile e universalmente applicabile a tutte le popolazioni “, ha affermato Modjarrad.

Ha aggiunto: “Sulla base della lunga esperienza di WRAIR nello sviluppo di vaccini per altri virus e del recente lavoro sui coronavirus, siamo stati in grado di muoverci rapidamente per accelerare gli sforzi di ricerca per combattere questa pandemia che ha minacciato la salute globale e la prontezza militare”.

WRAIR è stata fondata 127 anni fa per combattere questi tipi di minacce per la salute e ha svolto un ruolo nello sviluppo di quasi la metà dei vaccini oggi di uso pubblico.

Rolland, la cui ricerca si concentra solitamente sulla genetica virale dell’HIV, ha spostato la sua attenzione su COVID-19 durante l’attuale emergenza sanitaria globale. “È fondamentale che persone in vari campi si uniscano mentre ci concentriamo sull’apprendimento di tutto ciò che possiamo su questo virus”, ha detto.

“Il lavoro di squadra sarà di vitale importanza per arginare la marea di questa pandemia.” Rolland è impiegato dalla Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. e conduce ricerche presso WRAIR dal 2010.


L’emerging Infectious Diseases Branch (EIDB) di WRAIR sta conducendo gli sforzi per sviluppare un vaccino sicuro ed efficace per prevenire l’infezione da COVID-19. WRAIR ha inizialmente sviluppato più di due dozzine di prototipi, somministrati a quasi mille topi, per studiare la risposta anticorpale legante e neutralizzante più promettente negli studi preclinici.

A giugno, i ricercatori hanno identificato il prototipo di vaccino più promettente, insieme a due copie di backup, per futuri test negli studi clinici sull’uomo entro la fine dell’anno. Il vaccino WRAIR, chiamato sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus-2 Spike Ferritin Nanoparticle (SpFN), è uno dei tanti attualmente in fase di sviluppo.

I ricercatori sperano che la piattaforma di vaccini contro la ferritina di WRAIR possa anche aprire la strada a un vaccino universale per proteggere non solo dal virus attuale, ma anche da altri coronavirus attualmente noti e da specie sconosciute che potrebbero sorgere in futuro. 

Gli scienziati dell’EIDB stanno anche lavorando a stretto contatto con altre istituzioni attraverso l’operazione Warp Speed ​​per far avanzare altri candidati vaccini. 

“Sulla base della lunga esperienza di WRAIR nello sviluppo di vaccini per altri virus e del recente lavoro sui coronavirus, siamo stati in grado di muoverci rapidamente nella promozione di un candidato vaccino”, ha affermato il dott. Kayvon Modjarrad, direttore di EIDB. Modjarrad ha recentemente pubblicato i risultati della prima sperimentazione umana su un candidato vaccino contro la sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS). Il MERS, un altro coronavirus della stessa famiglia del coronavirus che causa COVID-19, è una preoccupazione per la diffusione e la salute globale a causa del suo alto tasso di mortalità di quasi il 40%. 

L’obiettivo della proteina Spike

SARS-CoV-2 entra nella cellula ospite legandosi attraverso la sua proteina spike all’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE), il recettore della cellula ospite. La proteina spike esiste come trimero, con due subunità, S1 e S2, che svolgono un ruolo rispettivamente nell’attacco virale e nella fusione.

La subunità S1 ha un dominio di legame del recettore (RBD) che subisce il ripiegamento funzionale quando viene separato dal resto della subunità.

I pazienti COVID-19 recuperati mostrano titoli elevati di anticorpi neutralizzanti diretti contro questa proteina, indicando che potrebbe essere utilizzata per produrre un vaccino protettivo. In effetti, il picco glicoproteico è stato al centro di intensi sforzi di sviluppo di vaccini.

Progetto di costruzione per nanoparticelle di ferritina funzionalizzate con spike SARS-CoV-2.  Tutti i costrutti sono basati sulla sequenza dell'amminoacido Wuhan-Hu-1 (GenBank MN9089473) del picco di SARS-CoV-2.  I costrutti di ferritina funzionalizzati con spike sono stati realizzati fondendo l'ectodominio spike (residui 1-1213) o spikeΔC (residui 1-1143) alla subunità ferritina H. pylori separata da un linker SGG.  Una rappresentazione strutturale basata sulla struttura crio-EM con trimero spike (PDB 6VXX) e sulla struttura cristallina ferritina H. pylori (PDB 3BVE) raffigura la particella a 24 subunità che mostra spike o spikeΔC sulla superficie.  La dimensione stimata delle particelle di ferritina funzionalizzate con spike sulla base di dati strutturali è ~ 300 Å.  I costrutti trimeri S-GCN4 e SΔC-GCN4 sono stati realizzati fondendo i residui di spike a tutta lunghezza (1-1213) o spikeΔC (1-1137) in un dominio di trimerizzazione GCN4 modificato seguito da un tag esaistidina.  Una rappresentazione strutturale dei trimeri spike basata sulla struttura cryo-EM (PDB 6VXX) è mostrata con una lunghezza stimata di ~ 100 Å.  L'RBD copre i residui 319-541 della proteina spike ed è preceduto dal peptide segnale nativo (non mostrato) e seguito da un'etichetta esaistidina.

Progetto di costruzione per nanoparticelle di ferritina funzionalizzate con spike SARS-CoV-2. Tutti i costrutti sono basati sulla sequenza dell’amminoacido Wuhan-Hu-1 (GenBank MN9089473) del picco di SARS-CoV-2. I costrutti di ferritina funzionalizzati con spike sono stati realizzati fondendo l’ectodominio spike (residui 1-1213) o spikeΔC (residui 1-1143) alla subunità ferritina H. pylori separata da un linker SGG. Una rappresentazione strutturale basata sulla struttura crio-EM con trimero spike (PDB 6VXX) e sulla struttura cristallina ferritina H. pylori (PDB 3BVE) raffigura la particella a 24 subunità che mostra spike o spikeΔC sulla superficie. La dimensione stimata delle particelle di ferritina funzionalizzate con spike sulla base di dati strutturali è ~ 300 Å. I costrutti trimeri S-GCN4 e SΔC-GCN4 sono stati realizzati fondendo i residui di spike a tutta lunghezza (1-1213) o spikeΔC (1-1137) in un dominio di trimerizzazione GCN4 modificato seguito da un tag esaistidina. Una rappresentazione strutturale dei trimeri spike basata sulla struttura cryo-EM (PDB 6VXX) è mostrata con una lunghezza stimata di ~ 100 Å. L’RBD copre i residui 319-541 della proteina spike ed è preceduto dal peptide segnale nativo (non mostrato) e seguito da un’etichetta esaistidina.

Vantaggi di un vaccino a subunità

L’attuale studio si concentra sulla produzione di un vaccino a subunità, piuttosto che un vaccino a base di virus. Le ragioni di questa scelta includono una migliore stabilità alla conservazione, che include una maggiore gamma di distribuzione, facilità di produzione, sicurezza e maggiore coerenza nella qualità del vaccino. Tuttavia, il fattore limitante è la risposta immunitaria più debole ad essi associata.

Vaccino a base di ferritina

Per ovviare a questo problema, gli adiuvanti vengono tipicamente aggiunti per aumentare la loro immunogenicità. Tuttavia, presentare l’antigene in un formato multivalente è anche un modo efficace per ottenere questo risultato e l’uso di nanoparticelle è uno di questi approcci. L’attuale studio utilizza la   ferritina Helicobacter pylori , che è stata impiegata per visualizzare gli antigeni del virus dell’influenza, dell’HIV e del virus Epstein-Barr.

La   ferritina H. pylori è una proteina che mostra la proprietà di autoassemblaggio, formando particelle contenenti 24 subunità, con otto simmetrie triplici. Ciò gli consente di fondersi con un protomero spike per subunità, consentendo la visualizzazione di otto subunità di antigeni spike trimerici sulla superficie della particella assemblata. Inoltre, ricerche precedenti mostrano che gli antigeni montati sulla ferritina inducono una maggiore immunità rispetto all’immunizzazione con il solo antigene.

Due vaccini che utilizzano proteine ​​del virus dell’influenza su una piattaforma di ferritina hanno dimostrato di essere clinicamente vitali negli studi clinici. Sono inoltre pronte le strutture per la produzione su larga scala di vaccini contro la ferritina.

Diversi modelli di vaccini basati su punte

Nello studio attuale, i ricercatori hanno utilizzato due modelli per costruire vaccini con ferritina. Uno, hanno usato l’ectodominio del picco a tutta lunghezza, mentre nel secondo caso lo hanno usato dopo aver eliminato i 70 residui all’estremità C-terminale dell’ectodominio. La ragione di questa delezione era la possibile flessibilità conformazionale in questa regione e la presenza di un epitopo lineare, che ha suscitato una robusta risposta immunitaria.

Questi sono stati attaccati alla ferritina per formare rispettivamente S-Fer e SΔC-Fer. Entrambi sono stati stabilizzati nella conformazione di prefusione, che porta a una migliore espressione e una maggiore immunogenicità. Come controlli, hanno usato anche altri tre antigeni, vale a dire un trimero spike con un dominio di trimerizzazione in forma intera o SΔC e un RBD monomerico.

La ferritina funzionalizzata non mostra svantaggi

Hanno scoperto che nanoparticelle di ferritina spike possono essere prodotte all’interno di cellule di mammifero in coltura e purificate per ottenere un risultato omogeneo. La fusione della ferritina con la proteina spike non ha avuto un impatto negativo sull’espressione della proteina; infatti, SΔC-Fer ha effettivamente mostrato una migliore espressione. La funzionalizzazione della  ferritina H. pylori  con il picco non ha nemmeno interrotto l’autoassemblaggio delle nanoparticelle.

Dopo aver verificato la stabilità e l’omogeneità dei costrutti di ferritina, hanno esaminato il ripiegamento utilizzando vari test per le proprietà biofisiche, strutturali e leganti. Per valutare queste caratteristiche, hanno impiegato cromatografia ad esclusione dimensionale multi-angolo di diffusione della luce (SEC-MALS), microscopia crioelettronica (cryo-EM) e interferometria biostrato (BLI).

Hanno scoperto che le nanoparticelle funzionalizzate mostravano un ripiegamento stabile e gli epitopi di interesse sono stati dimostrati correttamente. Hanno anche scoperto che le particelle funzionalizzate con spike erano legate sia dal virus che da ACE2 nella stessa misura delle proteine ​​spike trimeriche e dal RBD.

Risposta immunitaria efficace dopo dose singola

I ricercatori hanno quindi immunizzato i topi con una singola dose di questi vaccini per studiare la risposta immunitaria in vivo. Utilizzando virus pseudotipati per evitare problemi di biosicurezza, hanno confermato che SΔC-Fer ha suscitato una risposta anticorpale neutralizzante notevolmente più alta rispetto a tutti i vaccini non ferritinici. Entrambi i vaccini S-Fer e SΔC-Fer hanno indotto anticorpi neutralizzanti al doppio del titolo a seguito di infezione naturale.

I ricercatori commentano: ” Questi risultati dimostrano che le nanoparticelle di ferritina funzionalizzate con spike provocano una risposta anticorpale migliorata rispetto ai trimeri spike o RBD da soli “.

La seconda dose migliora l’efficacia per altri candidati al vaccino

Una seconda dose dei cinque antigeni il giorno 21 ha mostrato che la risposta immunitaria è stata potenziata per tutti i gruppi a un blocco quasi completo di ACE2 a una diluizione sierica di 1:50. Un’altra osservazione è stata che il blocco ACE2 non è sempre correlato alla tendenza dell’attività neutralizzante. 

Ciò potrebbe essere dovuto alla presenza di altri epitopi neutralizzanti sulla glicoproteina spike. Tuttavia, i topi immunizzati con SΔC-Fer hanno continuato a mostrare i titoli neutralizzanti più elevati, dimostrando che una presentazione di spike multivalenti è necessaria per una risposta immunitaria migliore e più affidabile.

Implicazioni

La conclusione è che queste nanoparticelle di ferritina spike sono candidate superiori per lo sviluppo di vaccini a spike trimer o RBD da sole e che, nelle loro parole, ” SΔC-Fer è l’antigene con le migliori prestazioni tra quelli che abbiamo testato qui “.

L’elevata efficacia di un candidato vaccino nell’ottenere una risposta anticorpale neutralizzante dopo una singola dose potrebbe essere il punto di svolta per ottenere una copertura mondiale e fermare la pandemia. Pertanto, questo studio acquista maggiore importanza nel dimostrare il profilo favorevole di questo costrutto nello sviluppo di un vaccino efficace e ampiamente dispiegabile contro COVID-19.


Maggiori informazioni:  Bethany Dearlove et al, Un candidato vaccino contro la SARS-CoV-2 probabilmente corrisponderebbe a tutte le varianti attualmente in circolazione,  Atti della National Academy of Sciences  (2020). DOI: 10.1073 / pnas.2008281117

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