COVID-19 sopprime il dolore

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Secondo un nuovo studio condotto dai ricercatori dell’Università dell’Arizona , il SARS-CoV-2, il virus che causa il COVID-19 , può alleviare il dolore.

La scoperta potrebbe spiegare perché quasi la metà delle persone che contraggono il COVID-19 manifesta pochi o nessun sintomo, anche se sono in grado di diffondere la malattia, secondo l’autore corrispondente dello studio Rajesh Khanna, Ph.D., professore presso il College of Medicina — Dipartimento di Farmacologia di Tucson.

“Per me aveva molto senso che forse la ragione per la diffusione inesorabile di COVID-19 è che nelle prime fasi, stai andando in giro tutto bene come se nulla fosse sbagliato perché il tuo dolore è stato soppresso”, ha detto il dott. Khanna.

“Hai il virus, ma non ti senti male perché il dolore è sparito. Se possiamo dimostrare che questo sollievo dal dolore è ciò che sta causando l’ulteriore diffusione di COVID-19, è di enorme valore “.

I centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie hanno rilasciato dati aggiornati il ​​10 settembre secondo cui il 50% della trasmissione di COVID-19 si verifica prima della comparsa dei sintomi e il 40% delle infezioni da COVID-19 sono asintomatiche.

“Questa ricerca solleva la possibilità che il dolore, come un sintomo precoce di COVID-19, possa essere ridotto dalla proteina spike SARS-CoV-2 in quanto silenzia le vie di segnalazione del dolore del corpo”, ha detto il vicepresidente senior di UArizona Health Sciences Michael D. Dake, MD.

“I ricercatori dell’Università dell’Arizona di Scienze della salute presso il Comprehensive Pain and Addiction Center stanno sfruttando questa scoperta unica per esplorare una nuova classe di terapie per il dolore mentre continuiamo a cercare nuovi modi per affrontare l’epidemia di oppioidi”.

I virus infettano le cellule ospiti attraverso i recettori proteici sulle membrane cellulari.

All’inizio della pandemia, gli scienziati hanno stabilito che la proteina spike SARS-CoV-2 utilizza il recettore dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) per entrare nel corpo.

Ma a giugno, due documenti pubblicati sul server di preprint bioRxiv hanno indicato la neuropilina-1 come secondo recettore per SARS-CoV-2.

“Questo ha attirato la nostra attenzione perché negli ultimi 15 anni il mio laboratorio ha studiato un complesso di proteine ​​e percorsi che si riferiscono all’elaborazione del dolore che sono a valle della neuropilina”, ha detto il dottor Khanna, affiliato alla UArizona Health Sciences Comprehensive Pain and Addiction Center ed è membro dell’UArizona BIO5 Institute.

“Così abbiamo fatto un passo indietro e ci siamo resi conto che questo potrebbe significare che forse la proteina spike è coinvolta in una sorta di elaborazione del dolore”.

Molti percorsi biologici segnalano al corpo di provare dolore. Uno è attraverso una proteina denominata fattore di crescita endoteliale vascolare-A (VEGF-A), che svolge un ruolo essenziale nella crescita dei vasi sanguigni ma è stata anche collegata a malattie come il cancro, l’artrite reumatoide e, più recentemente, COVID-19.

Come una chiave in una serratura, quando il VEGF-A si lega al recettore della neuropilina, dà inizio a una cascata di eventi con conseguente ipereccitabilità dei neuroni, che porta al dolore. Il dottor Khanna e il suo gruppo di ricerca hanno scoperto che la proteina spike SARS-CoV-2 si lega alla neuropilina esattamente nella stessa posizione del VEGF-A.

Con queste conoscenze, hanno eseguito una serie di esperimenti in laboratorio e su modelli di roditori per testare la loro ipotesi che la proteina spike SARS-CoV-2 agisca sulla via del dolore VEGF-A / neuropilina.

Hanno usato il VEGF-A come trigger per indurre l’eccitabilità dei neuroni, che crea dolore, quindi hanno aggiunto la proteina spike SARS-CoV-2.

“La proteina spike ha completamente invertito la segnalazione del dolore indotta da VEGF”, ha detto il dottor Khanna. “Non importava se usavamo dosi molto alte di picco o dosi estremamente basse: ha invertito completamente il dolore.”

Il dottor Khanna sta collaborando con immunologi e virologi di UArizona Health Sciences per continuare la ricerca sul ruolo della neuropilina nella diffusione del COVID-19.

Nel suo laboratorio, esaminerà la neuropilina come nuovo obiettivo per il sollievo dal dolore non oppioide. Durante lo studio, il dottor Khanna ha testato gli inibitori della neuropilina a piccole molecole esistenti sviluppati per sopprimere la crescita del tumore in alcuni tipi di cancro e ha scoperto che fornivano lo stesso sollievo dal dolore della proteina spike SARS-CoV-2 quando si legava alla neuropilina.

“Stiamo andando avanti con la progettazione di piccole molecole contro la neuropilina, in particolare composti naturali, che potrebbero essere importanti per alleviare il dolore”, ha detto il dottor Khanna. “Abbiamo una pandemia e un’epidemia di oppioidi. Si stanno scontrando. I nostri risultati hanno enormi implicazioni per entrambi. SARS-CoV-2 ci sta insegnando la diffusione virale, ma COVID-19 ci fa anche considerare la neuropilina come un nuovo metodo non oppioide per combattere l’epidemia di oppioidi “.


La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è l’agente eziologico del COVID-19, una malattia da coronavirus che, al 24 agosto, ha infettato più di 23,5 milioni di persone e ha causato quasi 810.000 decessi in tutto il mondo [15].

La maggior parte dei pazienti infettati da SARS-CoV-2 riporta una malattia respiratoria da lieve a grave con sintomi quali febbre, tosse e mancanza di respiro [30]. D’altra parte, un sottogruppo di pazienti a cui viene diagnosticato un test positivo per i nuclei acidi ma che sono asintomatici o minimamente sintomatici [30].

Prove crescenti dimostrano che gli individui asintomatici possono diffondere il virus in modo efficiente, e l’emergere di questi diffusori silenziosi di SARS-CoV-2 ha un controllo limitato della pandemia [14; 41].

Il dolore è una preoccupazione crescente nei pazienti sintomatici, probabilmente derivante da un attacco diretto di SARS-CoV-2 sulle cellule e dalla “tempesta di citochine” scatenata dalle cellule colpite [51; 68]. Non è noto se gli individui asintomatici o minimamente sintomatici abbiano soglie del dolore ridotte o se il loro dolore sia tacitato, ma entrambi potrebbero contribuire ad aumentare le dinamiche di trasmissione della malattia.

L’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) espresso in superficie è stato considerato il principale recettore per l’assorbimento di SARS-CoV-2 [22; 60; 64]. Evidenze emergenti indicano un sottoinsieme di neuroni sensoriali che esprimono ACE2 [48] che sinapsi con i neuroni del SNC spinali e del tronco cerebrale per produrre effetti neurologici, tra cui mal di testa e dolore ai nervi [32; 34].

Curiosamente, l’ACE2 non è presente nella maggior parte dei neuroni [48], nonostante l’aumento delle segnalazioni di sintomi neurologici comuni nei pazienti COVID-19 [32]. Paradossalmente, sebbene i livelli di espressione di ACE2 diminuiscano con l’invecchiamento [49], è stata osservata una maggiore gravità del COVID-19 nelle popolazioni di pazienti più anziane, come quella italiana [2], a sostegno della tesi secondo cui l’ACE2 non è l’unica porta d’ingresso della SARS -CoV-2 [1].

Due rapporti recenti hanno dimostrato che la proteina SARS-CoV-2 Spike può legarsi al dominio b1b2 del recettore della neuropilina-1 (NRP-1). Questa interazione avviene attraverso una sequenza di amminoacidi polibasici ( 682 RRAR 685 ), non conservata in SARS e MERS, chiamata motivo della “regola C-end” (CendR), che potenzia significativamente il suo ingresso nelle cellule [6; 11].

È importante sottolineare che le analisi “omiche” hanno rivelato una significativa sovraregolazione di  NRP-1  nei campioni biologici di pazienti COVID-19 rispetto ai controlli sani [6]. Usando il fattore di crescita endoteliale vascolare-A (VEGF-A), un ligando fisiologico per la tasca b1b2 in NRP-1, abbiamo interrogato se la proteina Spike, il principale antigene di superficie di SARS-CoV-2, potesse bloccare VEGF-A / NRP -1 segnalazione per influenzare i comportamenti del dolore.

Dati i parallelismi tra gli effetti pro-nocicettivi del VEGF-A nei roditori [4; 58] e gli esseri umani [23; 58] e risultati clinici che dimostrano un aumento dei livelli di VEGF-A nel liquido di lavaggio alveolare bronchiale da pazienti COVID-19 [47] accoppiato con livelli sostanzialmente più bassi nel siero di individui asintomatici rispetto ai pazienti sintomatici [30], una domanda secondaria era verificare se La proteina Spike potrebbe conferire analgesia. Abbiamo scoperto che il VEGF-A sensibilizza l’attività dei nocicettori, un segno distintivo del dolore neuropatico [59], che è stato bloccato dalla proteina Spike e dall’inibitore NRP-1 EG00229 [26]. Inoltre, identifichiamo un nuovo ruolo analgesico per la proteina Spike, che è rispecchiato dall’inibizione di NRP-1.

Risultati

L’impegno specifico del ligando della segnalazione NRP-1 induce attività e dolore nocicettori

Inizialmente, abbiamo valutato il coinvolgimento di Spike e NRP-1 nel percorso VEGF-A / NRP-1. Un’interazione tra Spike (dominio S1 aa 16-685, contenente il motivo CendR  682 RRAR 685 ) e la porzione extracellulare di NRP-1 è stata confermata dal saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) (Fig. 1A).

Abbiamo calcolato che una costante di dissociazione di equilibrio (Kd) per questa interazione sia ∼166,2 nM (Fig. 1A). Successivamente, abbiamo placcato i neuroni sensoriali su array di microelettrodi multipozzetto (MEA), un approccio che consente misurazioni multiplex di potenziali d’azione extracellulari spontanei e stimolati da grandi popolazioni di cellule [9].

VEGF-A ha aumentato l’attivazione spontanea dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG), che è stata bloccata dal dominio S1 della proteina Spike e dall’inibitore NRP-1 EG00229 (Fig. 1A). Al contrario, ligandi VEGF-B (ligando per VEGFR1 – un co-recettore per NRP-1 [31]) e semaforina 3A (Sema3A, ligando per recettore plexina – anche un co-recettore per NRP-1) [13; 53]) non ha influenzato l’attivazione spontanea dei nocicettori (Fig. 1B, C).

La mancanza di effetto di VEGF-B e Sema3A esclude un ruolo per VEGF-R1 e plexina, rispettivamente, implicando così un nuovo ligando, VEGF-A e recettore, NRP-1, percorso specifico che guida l’attivazione dei nocicettori (Fig. 1D).

Figura 1. L’impegno specifico del ligando della segnalazione NRP-1 induce attività nocicettiva, promuovendo un fenotipo simile al dolore. (A) Grafico che mostra il legame NRP-1 normalizzato a concentrazioni crescenti di proteina Spike ricombinante (n = 8 repliche per concentrazione). I dati sono stati normalizzati in pozzetti senza anticorpi e sfondo sottratto. I dati erano adatti assumendo un sito di modalità di legame e hanno prodotto un Kd di ∼166,2 nM. ( B) Percentuali di attivazione del potenziale d’azione medio (Hz, evento al secondo) di neuroni sensoriali DRG coltivati ​​incubati per 30 min con VEGF-B (3 nM), Sema3A (100 ng), VEGF-A (1 nM), VEGF-A più Spike (100 nM) o VEGF-A più inibitore NRP-1 EG00229 (30 μM) [26]. Dei ligandi testati, solo il VEGF-A, che agisce su VEGFR2, è un ligando per NRP-1 che innesca un aumento dell’attivazione spontanea dei nocicettori. I dati sono mostrati come media ± sem e sono stati analizzati mediante analisi della varianza a due vie non parametrica (post hoc: Sidak). Sono indicati i valori P, rispetto al controllo (PBS) o VEGF-A. EG00229 è un inibitore di NRP-1 (PDB 3i97). ( C) In alto a sinistra: dominio di legame dell’eparina VEGF-A (fumetto grigio con R323 nei bastoncini) in complesso con il dominio NRP-1 b1 (superficie bianca con sito di legame in rosso; PDB 4deq [43]). In alto a destra: peptide dal C-terminale della proteina SARS-CoV-2 Spike tagliata con furina 681-PRRAR-685 (bastoncini blu) ancorata al dominio NRP1-b1 (superficie bianca con sito di legame in rosso; PDB 6fmc [46]) usando Glide (Schrödinger). Residui Spike aggiuntivi 678-TNS-680 modellati solo a scopo illustrativo (fumetto blu). In basso: Composto EG00229 (bastoncini ciano) nel complesso con dominio NRP-1 b1 ((superficie bianca con sito di legame in rosso; PDB 3i97 [26]). ( D) Illustrazione schematica dell’ipotesi che il legame della proteina SARS-CoV-2 Spike al dominio NRP-1 b1b2 inneschi una cascata intracellulare che aumenta l’attività dei canali del sodio e del calcio per aumentare l’attività dei nocicettori culminando in un aumento del dolore.

Poiché sia ​​il VEGF-A che la proteina Spike condividono una sacca di legame comune su NRP-1 (Fig. 1C) [6; 11; 43], abbiamo chiesto se la proteina Spike potesse bloccare la segnalazione di VEGF-A / NRP-1 per influenzare i comportamenti del dolore. Coerentemente con le relazioni precedenti [4; 58], abbiamo confermato che VEGF-A è pro-nocicettivo in quanto l’iniezione intra-plantare di VEGF-A ha ridotto sia le soglie di ritiro della zampa (Fig. 2A, B e Tabella S1) che le latenze a uno stimolo termico (Fig. Tabella S1) nei ratti maschi.

Risultati simili sono stati ottenuti anche nelle femmine di ratto (Fig. 2E-H e Tabella S1). Impedendo al VEGF-A di legarsi a NRP-1 con l’inibitore NRP-1 EG00229 o Spike di attivare la segnalazione VEGF-A / NRP-1, attenuato l’allodinia meccanica e l’iperalgesia termica indotte dal solo VEGF-A (Fig.2 e Tabella S1 ). Né Spike né EG00229 da soli hanno avuto alcun effetto su questi comportamenti (Fig. 2 e Tabella S1) in entrambi i sessi. Insieme, questi dati forniscono prove funzionali che la segnalazione di VEGF-A / NRP-1 promuove un fenotipo simile al dolore sensibilizzando l’attività dei nocicettori (Fig. 1D).

Figura 2.
VEGF-A promuove un fenotipo simile al dolore che è bloccato dalla proteina Spike o dall’inibizione di NRP-1 nei ratti maschi e femmine.
Soglie di ritiro della zampa (A, B – maschio ed E, F – femmina) o latenze (C, D – maschio e G, H – femmina) per ratti naïve maschi e femmine a cui è stato iniettato VEGF-A (10 nM), Spike (100 nM), EG00229 (30 µM) o PBS (veicolo), da solo o in combinazione (50 µl / ratto; = 6-12). Per chiarezza, la significatività statistica non è presentata nei grafici dell’andamento temporale, ma è invece presentata nella Tabella S1. I pannelli B, F, D e H sono l’area sotto la curva per 0-24 ore. I dati sono mostrati come media ± sem e sono stati analizzati mediante analisi della varianza a due vie non parametrica in cui il tempo era il fattore entro il soggetto e il trattamento era il fattore tra i soggetti (post hoc: Sidak), * p <0,05. Le aree sotto la curva sono state confrontate mediante un’analisi della varianza unidirezionale con il test post-hoc di Kruskal-Wallis. Gli esperimenti sono stati analizzati da un investigatore cieco al trattamento.

Gli aumenti mediati da VEGF-A nelle correnti del canale ionico DRG sono normalizzati dalla rottura della segnalazione VEGF-A / NRP-1
Per ottenere informazioni sul meccanismo con cui il VEGF-A ha contribuito all’aumento dell’attività dei nocicettori, abbiamo postulato che i canali ionici nei DRG possono essere colpite, poiché contribuiscono alla plasticità nocicettiva [61].

Famiglie tipiche di correnti Na + da neuroni DRG di piccolo diametro sono mostrate nella Figura 3A. Il VEGF-A ha facilitato un aumento di 1,9 volte delle correnti totali di Na + rispetto ai DRG trattati con il veicolo (PBS), che erano completamente bloccati dalla proteina Spike (Fig. 3B, C). La proteina Spike da sola non ha influenzato le correnti di Na + (Fig. 3B, C e Tabella S1).

Poiché questa corrente diminuita potrebbe derivare da cambiamenti nel gate del canale, abbiamo determinato se la cinetica di attivazione e inattivazione delle correnti DRG Na + fosse influenzata. L’attivazione e l’inattivazione semimassimale (V1 / 2), così come i valori di pendenza (k) per l’attivazione e l’inattivazione, non erano diversi tra le condizioni testate (Fig. 3D, E e Tabelle S1, S2), ad eccezione di un ∼8 Spostamento iperpolarizzante del mV nell’inattivazione del canale del sodio indotta dal co-trattamento di VEGF-A e EG00229 (Tabella S2).

Risultati simili sono stati ottenuti per l’inibitore NRP-1 EG00229, che ha anche inibito l’aumento mediato da VEGF-A delle correnti totali di Na + (Fig. 3F-H e Tabella S1) ma non ha avuto effetto sulle proprietà biofisiche (Fig. 3I, J e Tabelle S1, S2).

L’aumento delle correnti di sodio mediato da VEGF-A è normalizzato dalla proteina Spike o dall’inibizione di NRP-1 nei neuroni DRG. Tracce rappresentative di corrente di sodio ( A, F ) registrate da neuroni DRG di piccole dimensioni, incubate per 30 min con i trattamenti indicati, in risposta a passi di depolarizzazione da –70 a +60 mV da un potenziale di mantenimento di –60 mV. Riepilogo delle curve corrente-tensione ( B, G ) e delle correnti di picco normalizzate ( C, H ) (pA / pF) dai neuroni DRG come indicato. Boltzmann si adatta alla conduttanza normalizzata  rapporto di tensione max G / G per attivazione dipendente dalla tensione ( D, I ) e inattivazione ( E, J) dei neuroni sensoriali come indicato. Le barre di errore indicano la media ± sem Attivazione e inattivazione metà massimale (V 1/2 ) e i valori di pendenza ( k ) per l’attivazione e l’inattivazione non erano diversi tra nessuna delle condizioni (p> 0,9999, test di Kruskal-Wallis con il post hoc di Dunn) ; valori presentati nella tabella S2. I valori P dei confronti tra i trattamenti sono quelli indicati; per le analisi statistiche complete vedere la Tabella S1.

Poiché i canali del calcio svolgono molteplici ruoli critici nella trasmissione e nell’elaborazione delle informazioni relative al dolore all’interno della via del dolore afferente primario [61], abbiamo valutato se fossero colpiti. Ci siamo concentrati sui canali di tipo N (CaV2.2) in quanto questi mediano il rilascio di neurotrasmettitori nelle sinapsi delle fibre afferenti nel corno dorsale e sono fondamentali nella matrice del dolore [50].

Il VEGF-A ha facilitato un aumento di 1,8 volte delle correnti totali di Ca2 + rispetto ai DRG trattati con il veicolo (PBS), che erano completamente bloccati dalla proteina Spike (Fig. 4A-C e Tabella S1). La sola proteina Spike non ha influenzato le correnti di Ca2 + (Fig. 4A-C). Inoltre, non abbiamo osservato alcun cambiamento nella cinetica di attivazione e inattivazione tra le condizioni testate (Fig. 4D, E e Tabelle S1, S2).

Risultati simili sono stati ottenuti per l’inibitore NRP-1 EG00229, che ha inibito l’aumento mediato da VEGF-A delle correnti di Ca2 + di tipo N (Fig. 4F-H e Tabella S1) ma non ha avuto effetto sulle proprietà biofisiche (Fig. 4I, J e tabelle S1, S2). Questi dati implicano la proteina Spike e NRP-1 nei canali Na + e Ca2 + (CaV2.2) nella segnalazione VEGF-A / NRP-1.

L’aumento delle correnti di calcio mediato da VEGF-A è normalizzato dalla proteina Spike o dall’inibizione di NRP-1 nei neuroni DRG. Tracce rappresentative della corrente di calcio (tramite canali di tipo N) ( A, F ) registrate da neuroni DRG di piccole dimensioni, incubate per 30 min con i trattamenti indicati, in risposta alla tensione di mantenimento di –60 mV con gradini di tensione di 200 ms applicati ad intervalli di 5 s con incrementi di +10 mV da –70 a +60 mV. L’isolamento farmacologico della corrente di tipo N (CaV2.2) è stato ottenuto con un cocktail di tossine / piccole molecole. Riepilogo delle curve corrente-tensione ( B, G ) e delle correnti di picco normalizzate ( C, H ) (pA / pF) dai neuroni DRG come indicato. Boltzmann si adatta alle relazioni di tensione G / Gmax della conduttanza normalizzata per l’attivazione dipendente dalla tensione ( D, I.) e inattivazione ( E, J ) dei neuroni sensoriali come indicato. Le barre di errore indicano la media ± sem Attivazione e inattivazione metà massimale (V 1/2 ) e i valori di pendenza ( k ) per l’attivazione e l’inattivazione non erano diversi tra nessuna delle condizioni (p> 0,9999, test di Kruskal-Wallis con il post hoc di Dunn) ; valori presentati nella tabella S2. I valori P dei confronti tra i trattamenti sono quelli indicati; per le analisi statistiche complete vedere la Tabella S1.

Il VEGF-A potenzia l’attività sinaptica nel corno dorsale lombare che è normalizzato dall’inibizione del segnale NRP-1 e della proteina Spike.
Il midollo spinale è un integratore della trasmissione sensoriale in cui i segnali nocicettivi in ​​arrivo subiscono convergenza e modulazione [57]. La neurotrasmissione presinaptica spinale si basa sull’attivazione del potenziale d’azione dei neuroni DRG e sul rilascio dei neurotrasmettitori.

Da questi principi fisiologici fondamentali, oltre che dai risultati sopra descritti, siamo stati spinti a valutare se l’attività sinaptica fosse influenzata nel corno dorsale lombare.

Le ampiezze delle correnti spontanee eccitatorie postsinaptiche (sEPSC) dei neuroni nella regione della substantia gelatinosa del corno dorsale lombare non sono state influenzate dal VEGF-A (Fig. 5A, B e Tabella S1). Al contrario, l’applicazione di VEGF-A ha aumentato la frequenza di sEPSC di ∼3,6 volte, che è stata ridotta del ∼57% dall’inibizione di NRP-1 con EG00229 e ∼50% dalla proteina Spike (Fig. 5A, C e Tabella S1).

Le curve di distribuzione cumulativa dell’ampiezza e dell’intervallo tra eventi per le sEPSC sono mostrate nella Figura 5D, E. Rispetto ai controlli del veicolo, il VEGF-A, con o senza inibitore NRP-1 o proteina Spike, non ha avuto effetto sulla distribuzione dell’ampiezza cumulativa del EPSC spontanei (Fig. 5D e Tabella S1) ma ha cambiato la distribuzione della frequenza cumulativa di EPSC spontanei con intervalli tra eventi significativamente più lunghi (Fig. 5E e Tabella S1). Insieme, questi dati suggeriscono un meccanismo d’azione presinaptico della proteina Spike e NRP-1.

La frequenza di sEPSC è ridotta dall’antagonismo farmacologico di NRP-1 da EG00229.
(A) Tracce rappresentative di correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee (sEPSC) dai neuroni della substantia gelatinosa nel corno dorsale superficiale (lamina I / II) trattate per almeno 30 minuti con le condizioni indicate. Viene mostrato il riepilogo delle ampiezze (B) e delle frequenze (C) delle sEPSC per tutti i gruppi. Distribuzione cumulativa dell’ampiezza delle sEPSC (D) e dell’intervallo tra eventi (E) registrato dalle celle come indicato. La perfusione di 30 μM EG00229 ha ridotto la trasmissione sinaptica eccitatoria spontanea (AE) nei neuroni del corno dorsale lombare. I valori P dei confronti tra i trattamenti sono quelli indicati; per le analisi statistiche complete vedere la Tabella S1.

La proteina spike e l’inibizione di NRP-1 conferiscono anti-nocicezione nel modello di lesione del nervo risparmiato (SNI) del dolore neuropatico cronico
Abbiamo utilizzato il modello di lesione del nervo risparmiato (SNI) del dolore neuropatico, scelto perché produce un aumento affidabile e consistente della sensibilità al dolore [12], per valutare il potenziale di interruzione del percorso VEGF-A / NRP-1 per invertire la nocicezione. VEGF-A innesca l’autofosforilazione di VEGFR2 a Y1175 [54], servendo così come proxy per l’attivazione della segnalazione di VEGF-A. Nei ratti con SNI, l’applicazione intratecale di Spike, ha ridotto la fosforilazione di VEGFR2 (Y1175) sia sul lato controlaterale (non ferito) che omolaterale (ferito) (Fig. 6A, B). Ciò dimostra che Spike può inibire la segnalazione di VEGF-A in un modello di ratto di dolore neuropatico cronico. La lesione da SNI ha ridotto efficacemente le soglie di ritiro della zampa (PWT) (allodinia meccanica, Fig. 6C e Tabella S1) 10 giorni dopo l’infortunio. La somministrazione spinale della proteina Spike ha aumentato significativamente le PWT (Fig. 6C e Tabella S1), in modo dose-dipendente, per 5 ore. L’analisi dell’area sotto la curva (AUC) ha confermato l’inversione dose-dipendente dell’allodinia meccanica (Fig. 6D e Tabella S1) rispetto agli animali feriti trattati con veicolo. Risultati simili sono stati osservati con ratti femmina a cui è stato iniettato Spike (Fig. 6E, F). Infine, l’inibizione della segnalazione NRP-1 con EG00229 ha anche invertito le soglie di ritiro della zampa (Fig. 6G, H e Tabella S1).

La proteina Spike di SARS-CoV-2 e l’antagonismo NRP-1 invertono l’allodinia meccanica indotta da SNI.La lesione del nervo parziale (SNI) ha provocato l’allodinia meccanica 10 giorni dopo l’intervento chirurgico. ( A ) Immunoblot rappresentativi dei livelli di NRP-1, totale e pY1175 VEGF-R2 nei siti pre-sinaptici nel corno dorsale spinale del ratto dopo SNI. I tessuti sono stati raccolti 3 ore (cioè, al picco di anti-allodinia) dopo l’iniezione intratecale del dominio di legame del recettore della proteina Spike (2,14 μg / 5μl). ( B ) Grafico a barre con grafici a dispersione che mostrano la quantificazione di n = 4 campioni come in  A (* p <0,05, test di Kruskal-Wallis). Soglie di ritiro della zampa per ratti SNI (maschi) a cui è stata somministrata soluzione salina (veicolo) o quattro dosi del dominio di legame del recettore della proteina Spike (da 0,00214 a 2,14 μg / 5μl) per via intratecale (it); n = 6-12) ( C ), dose di 2,14 μg / 5μl di Spike nelle femmine di ratto, o l’inibitore NRP-1 EG00229 nei ratti maschi (2 μg / 5μl; n = 6) ( E ). ( D, F, H ) Riepilogo dei dati mostrati nei pannelli  C, E e  G tracciata come area sotto la curva (AUC) per 0-5 ore. Sono indicati i valori di P rispetto al controllo. I dati sono mostrati come media ± sem e sono stati analizzati mediante analisi della varianza a due vie non parametrica in cui il tempo era il fattore entro soggetto e il trattamento era il fattore tra soggetti (post hoc: Sidak). Le AUC sono state confrontate con il test di Mann-Whitney. Gli esperimenti sono stati analizzati da un investigatore cieco al trattamento. I valori P dei confronti tra i trattamenti sono quelli indicati; per le analisi statistiche complete vedere la Tabella S1.

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Source: University of Arizona

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