Vaccino COVID-19: imitando la struttura e convertendo l’RBD in una nanoparticella genererebbe livelli più elevati di anticorpi neutralizzanti

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Un team di ricerca guidato dall’università di Buffalo ha scoperto una tecnica che potrebbe aiutare ad aumentare l’efficacia dei vaccini contro il nuovo coronavirus, il virus che causa COVID-19.

Jonathan F. Lovell, Ph.D., professore associato presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica presso l’UB, è il principale ricercatore della ricerca, intitolata “SARS-CoV-2 RBD Neutralizing Antibody Induction is Enhanced by Particulate Vaccination”, che è stata pubblicata online in Advanced Materials oggi, 28 ottobre.

COVID-19 ha causato una pandemia globale dirompente, infettando almeno 40 milioni di persone in tutto il mondo e provocando più di 220.000 decessi solo negli Stati Uniti. Da quando ha iniziato a diffondersi all’inizio del 2020, i ricercatori biomedici sono stati alla ricerca attiva di un vaccino efficace.

Secondo Lovell, una risposta potrebbe risiedere nella progettazione di vaccini che imitano parzialmente la struttura del virus. Una delle proteine ​​del virus – situata sul caratteristico picco COVID – ha un componente chiamato dominio di legame del recettore, o RBD, che è il suo “tallone d’Achille”.

Cioè, ha detto, gli anticorpi contro questa parte del virus hanno il potenziale per neutralizzare il virus.

Sarebbe “interessante se un vaccino potesse indurre alti livelli di anticorpi contro il RBD”, ha detto Lovell. “Un modo per raggiungere questo obiettivo è utilizzare la proteina RBD stessa come antigene, ovvero il componente del vaccino contro il quale sarà diretta la risposta immunitaria”.

Il team ha ipotizzato che convertendo il RBD in una nanoparticella (di dimensioni simili al virus stesso) invece di lasciarlo rimanere nella sua forma naturale come piccola proteina, genererebbe livelli più elevati di anticorpi neutralizzanti e la sua capacità di generare una risposta immunitaria aumenterebbe.

Il team di Lovell aveva precedentemente sviluppato una tecnologia che semplifica la conversione di piccole proteine ​​purificate in particelle tramite l’uso di liposomi o piccole nanoparticelle formate da componenti grassi presenti in natura.

Nel nuovo studio, i ricercatori hanno incluso all’interno dei liposomi uno speciale lipide chiamato cobalto-porfirina-fosfolipide o CoPoP. Quel lipide speciale consente alla proteina RBD di legarsi rapidamente ai liposomi, formando più nanoparticelle che generano una risposta immunitaria, ha detto Lovell.

Il team ha osservato che quando l’RBD è stato convertito in nanoparticelle, ha mantenuto la sua forma tridimensionale corretta e le particelle erano stabili in condizioni di incubazione simili a quelle del corpo umano.

Quando topi e conigli di laboratorio sono stati immunizzati con le particelle RBD, sono stati indotti alti livelli di anticorpi. Rispetto ad altri materiali combinati con l’RBD per migliorare la risposta immunitaria, solo l’approccio con particelle contenenti CoPoP ha dato risposte forti.

Altre tecnologie adiuvanti per vaccini non hanno la capacità di convertire l’RBD in forma di particelle, ha detto Lovell.

“Riteniamo che questi risultati forniscano prove alla comunità di sviluppo del vaccino che l’antigene RBD beneficia molto dall’essere in formato particellare”, ha detto Lovell. “Questo potrebbe aiutare a informare il futuro progetto di vaccino che prende di mira questo specifico antigene”.


Ciclo di vita, fisiopatologia e struttura

SARS-CoV-2 ha un genoma di RNA a filamento singolo di circa 34 kilobasi e un nucleocapside di simmetria elicoidale. Il genoma SARS-CoV-2 è identico all’80% al SARS-CoV e al 96% al BatCoV RaTG13.10 L’integrità della particella SARS-CoV è mantenuta da quattro proteine:

  • (i) La proteina S (glicoproteina Spike) che consente l’attaccamento del virus alle cellule ospiti seguito dalla fusione della membrana, promuovendo quindi l’ingresso di SARS-CoV nelle cellule ospiti;
  • (ii) l’abbondante proteina M (membrana) che mantiene l’integrità della membrana della particella virale;
  • (iii) la proteina E (involucro) è la proteina più piccola e svolge un ruolo strutturale e aiuta nell’assemblaggio e nel germogliamento;
  • (iv) la proteina N (nucleocapside) si lega prevalentemente all’RNA SARS-CoV e supporta la formazione di nucleocapside. 21-27

L’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) è il recettore chiave per l’ingresso di SARS-CoV-2 nelle cellule dell’ospite. Le proteasi cellulari [proteasi e catepsine simili alla tripsina delle vie aeree umane e proteasi transmembrana serina 2 (TMPRSS2)] controllano il meccanismo di ingresso virale scindendo la proteina spike e avviando ulteriori meccanismi di penetrazione.28

Almeno sei frame di lettura aperti sono presenti in un tipico genoma CoV che codifica per la produzione di RNA subgenomici, 16 proteine ​​non strutturali (nsps) e proteine ​​strutturali (spike, membrana, busta e proteina nucleocapside) .29-31 Il ciclo di vita di SARS-CoV-2 che spiega l’intero meccanismo fisiopatologico è descritto in dettaglio nella (Figura 11, I).

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Figura 1
Struttura e fisiopatologia di SARS-CoV-2. (I) Ciclo vitale di SARS-CoV-2: la proteina virale S si lega al recettore ACE2 dell’ospite. In seguito all’ingresso, si ha la scissione proteolitica dell’involucro del virus conseguente al rilascio di RNA genomico nel citoplasma, e vengono prodotti RNA più piccoli (“mRNA subgenomici”). Questi mRNA vengono tradotti in diverse proteine ​​(S, M, N,  ecc .) Essenziali per la costruzione dell’assemblaggio virale. Le proteine ​​S, E e M entrano nel reticolo endoplasmatico (ER) e la formazione del complesso nucleoproteico avviene dalla combinazione della proteina nucleocapside (N) e dell’RNA genomico (filamento positivo). La formazione della particella virale completa (proteine ​​e assemblaggio dell’RNA del genoma) avviene nel compartimento dell’apparato ER-Golgi. Le particelle virali vengono quindi trasportate e rilasciate  tramite formazione di vescicole ed esocitosi. (II) ACE2-RBD (proteina S): una singola unità del dominio peptidasi dell’ACE2 umano (rosso) che interagisce con il RBD della proteina S (blu), (la regione in riquadro rappresenta i siti di interazione degli amminoacidi).

Le proteine ​​del Coronavirus S promuovono l’ingresso del virus nelle cellule ospiti e sono l’area di interesse per vari anticorpi. La proteina S di superficie (glicoproteina spike) dei virioni è il sito per il riconoscimento e la fusione di membrana.32-34 La proteina S (un trimero) viene scissa in subunità S1 e S2.

Le subunità S1 contengono il dominio di legame del recettore (RBD) e vengono rilasciate in conformazione post-trasfusione.34-37 S1 si lega direttamente al dominio peptidasi (PD) dell’ACE2, mentre le subunità S2 aiutano nella fusione di membrana che è fondamentale per il virale infezione.38,39 S2 contiene siti di scissione ed è sezionato dalle proteasi dell’ospite.35,40,41

ACE2 è un dimero delle due unità e ospita l’RBD nel suo dominio peptidasi. Il contatto tra ACE2 e SARS-CoV-2 è facilitato dalle interazioni polari. 37,38,42 Un’elica a forma di arco del dominio peptidasi di ACE2 interagisce con la regione dell’ansa del RBD della proteina S (Figura 11, II).

L’altra elica e anelli collegano i filamenti antiparalleli e coordinano il dominio della peptidasi al RBD. Le interazioni amminoacidiche osservate nell’RBD di SARS-CoV-2 e nel dominio peptidasi di ACE2 sono considerati aspetti importanti per il disegno dell’inibitore.43 È stato osservato che l’aminoacido GLN498 di SARS-CoV-2 interagisce con ACE2 al Gli amminoacidi ASP38, TYR41, GLN42, LEU45 e LYS353, mentre LEU455 del virus ha interazione con ASP30, LYS31 e HIS34.

Altre interazioni includono SARS-CoV-2, PHE486 con GLN24, LEU79, MET82, TYR83 e LEU472. GLN493 ha mostrato interazione con ACE2 LYS31 e HIS34 e forma un legame H con GLU35. L’amminoacido ASN501 ha un tipo di interazione simile con ACE2 LYS353, GLY354 e ASP355, mentre l’interazione del legame H è stata osservata con TYR41.44

L’affinità di legame del dominio RBD di SARS-CoV-2 e PD di ACE2 è maggiore rispetto a SARS-CoV.43 È stato riportato che in SARS-CoV-2 l’aminoacido LYS417 ha mostrato un’interazione di ponte salino con ASP30 di ACE2 . Il cerotto caricato positivo ha contribuito al potenziale elettrostatico sulla superficie di RBD che viene aggiunto da LYS417 in SARS-CoV-2 e assente in SARS-CoV.43,45,46

L’esame dell’architettura virionica SARS-CoV-2 utilizzando TEM rivela una morfologia approssimativamente sferica o moderatamente pleiomorfa. Si osserva che il diametro del virione ha un’ampia distribuzione di 80-160 nm e una massa condensata di acido nucleico e proteina nucleocapsidica al di sotto di un doppio strato lipidico ben definito.47

TEM rivela anche la forma simile a un chiodo delle punte SARS-CoV-2 con una testa larga 7 nm e un corpo lungo 23 nm. Dopo la dissociazione della subunità S1 dalla proteina S, è stato osservato un cambiamento conformazionale nella subunità S2. Questo cambiamento da una forma compressa a una forma simile a un chiodo è stato confermato da diversi ricercatori ed è chiamato stato postfusione.

Una mappa tridimensionale (3D) e immagini di proiezione bidimensionali della proteina S2 allo stato postfusione sono state fornite da Song et al. con colorazione negativa EM.37 È stato inoltre confermato dai saggi biofisici e dall’analisi della struttura Cryo-EM che la proteina SARS-CoV-2 S si lega almeno 10 volte più strettamente ai recettori delle cellule ospiti ACE2 rispetto alla proteina spike di SARS-CoV. 39,43,48

Sviluppo di vaccini

La pandemia COVID-19 ha avuto un grave impatto sulla vita umana e in tutto il mondo vengono impiegati sforzi disperati per sviluppare vaccini sicuri ed efficaci. Il primo vaccino candidato è già arrivato agli studi clinici sull’uomo grazie a strategie di sviluppo accelerate e piattaforme tecnologiche avanzate per i vaccini.121

Analogamente a quanto spiegato in precedenza per lo sviluppo terapeutico, la significativa corrispondenza genomica di SARS-CoV-2 con altri coronavirus sta aiutando gli sviluppatori di vaccini a facilitare i progetti verso i vaccini più promettenti.

La strategia target per la maggior parte dei vaccini candidati è quella di indurre nAbs contro la proteina virale S, scongiurando l’assorbimento da parte dell’ospite mediato da ACE2. Nel caso dello sviluppo del vaccino SARS-CoV, sono stati riportati titoli nAbs più elevati e una migliore protezione con i vaccini della subunità della proteina S rispetto a qualsiasi altra strategia target. La ricerca sullo sviluppo di vaccini SARS / MERS suggerisce che le subunità della proteina S, RBD della subunità S1 e la proteina / gene S siano i siti target preferiti. 122-124

Tuttavia, la conoscenza degli antigeni specifici per SARS-CoV-2 per i candidati vaccini in fase di sperimentazione è limitata. Lo sviluppo di candidati vaccini COVID-19 si basa su diverse piattaforme high-tech tra cui virus attenuati e inattivati, vettori virali replicanti e non replicanti, DNA e mRNA, particelle simili a virus e approcci basati su proteine ​​ricombinanti.

Alcune piattaforme offrono vantaggi chiave come i vettori virali con la loro forte risposta immunitaria, espressione proteica superiore e stabilità prolungata e DNA o mRNA offrono flessibilità nella manipolazione dell’antigene, mentre l’approccio di sviluppo basato su proteine ​​ricombinanti è più facile da scalare utilizzando le capacità di produzione esistenti.

Nella Tabella 1 elenchiamo alcuni dei vaccini candidati COVID-19 più avanzati che sono recentemente passati allo sviluppo clinico.125,126 Il potenziamento dell’immunogenicità utilizzando adiuvanti vaccinali è anche allo studio per ridurre la dose vitale e per ampliare la finestra terapeutica e di sicurezza.127,128 Compromesso Anche il sistema immunitario e l’alto rischio di malattia nella popolazione anziana richiedono strategie adiuvanti per migliorare l’efficacia dei vaccini in questa fascia di età.129 Alcuni adiuvanti autorizzati sviluppati specificamente per il vaccino COVID-19 sono AS03 (GlaxoSmithKine), MF59 (Seqirus) e CpG 1018 (Dynavax).

Tabella 1

I candidati al vaccino COVID-19 più avanzati sono recentemente passati allo sviluppo clinico

candidato, sviluppatore principale e numero identificativo della sperimentazione clinicastato e dettaglidesign e caratteristichedata di inizio e di completamento prevista
mRNA-1273 (Moderna) (NCT04283461)in aperto, in aperto, fase Inuovo vaccino basato su mRNA incapsulato con LNP che codifica per una proteina spike (S) stabilizzata alla prefusione a lunghezza intera di SARS-CoV-23 marzo 2020 al 1 giugno 2021
studio di dosaggio per valutare la sicurezza e l’immunogenicità 45 partecipanti
Ad5-nCoV (CanSino Biologicals) ( NCT04313127 )fase di aumento della dose 1nuovo vaccino ricombinante contro il coronavirus (vettore dell’adenovirus di tipo 5 che esprime la proteina S)Dal 16 marzo 2020 al 20 dicembre 2022
studio per valutare la sicurezza, reattogenicità e immunogenicità 108 partecipanti
INO-4800 (Inovio Pharmaceuticals) ( NCT04336410 )studio in aperto, fase IDNA plasmide che codifica per la proteina S (somministrazione intradermica seguita da elettroporazione); dispositivo utilizzato: CELLECTRA 20003 aprile 2020 al 30 novembre 2020
studio per valutare la sicurezza, la tollerabilità e l’immunogenicità 40 partecipanti
LV-SMENP-DC (Shenzhen Geno-Immune Medical Institute, China) (NCT04276896)studio multicentrico, fase I / IIcellule dendritiche modificate con un vettore lentivirale ingegnerizzato che esprime minigeni sintetici sulla base di domini proteici genomici strutturali e proteasi conservati e critici selezionatiDal 24 marzo 2020 al 31 dicembre 2024
studio per valutare la sicurezza e l’efficacia di questo vaccino LV (LV-SMENP) 100 partecipanti
cellula di presentazione dell’antigene artificiale specifico del patogeno (aAPC) (Shenzhen Geno-Immune Medical Institute, Cina) ( NCT04299724 )studio in aperto, fase 1aAPC con modificazione del lentivirus inclusi geni immunomodulatori e minigeni virali basati su domini di proteine ​​virali selezionateDal 15 febbraio 2020 al 31 dicembre 2024
studio per valutare la sicurezza e l’immunità 100 partecipanti
ChAdOx1 nCoV-19 (COV001) Università di Oxford, Inghilterra ( NCT04324606 )studio in singolo cieco, randomizzato, multicentrico, fase I / IIvettore vaccino adenovirus (vettore virale non replicante che codifica per la proteina spike di SARS-CoV-2), il vaccino verrà somministrato per via intramuscolareDal 23 aprile 2020 al maggio 2021
studio per valutare l’efficacia, la sicurezza e l’immunogenicità; 1112 partecipanti previsti (4 gruppi di studio)
BNT162 Biontech / Fosun Pharma / Pfizer ( NCT04368728 )studio randomizzato, controllato con placebo, in cieco per l’osservatore, di ricerca della dose e di selezione dei candidati vaccini, Fase I / IIVaccino mRNA basato sulla formulazione LNP (quattro diversi candidati vaccini, ciascuno dei quali rappresenta diversi antigeni bersaglio). Due candidati includono un mRNA modificato con nucleosidi, uno include un mRNA contenente uridina (uRNA) e un candidato utilizza mRNA autoamplificante (saRNA)Dal 29 aprile 2020 all’8 marzo 2023
Studio per valutare la sicurezza, la tollerabilità, l’immunogenicità e la potenziale efficacia
BNT162 Biontech ( NCT04380701 )studio in due parti con aumento della dose, fase I / II multisito,20 aprile 2020 (data di inizio)
indagare la sicurezza e l’immunogenicità utilizzando diversi regimi di dosaggio

Ruolo della nanotecnologia

La crisi COVID-19 richiede anche un’analisi urgente di tutti gli strumenti nanotecnologici disponibili. Sebbene le strategie di nanomedicina siano in uso per la progettazione dei vettori del vaccino, non ci sono abbastanza altri approcci nanotecnologici in fase di esplorazione per affrontare l’attuale epidemia. Questo manoscritto tenta di presentare sistematicamente lo stato attuale dell’uso delle nanotecnologie nello sviluppo di farmaci e vaccini. Lo sviluppo terapeutico e le sfide contro l’infezione da SARS-CoV-2 non sono così diversi da altre malattie infettive e dalla ricerca oncologica.130 Allo stesso modo, lo sviluppo del vaccino ha importanti punti in comune con le strategie esplorate contro la SARS, i coronavirus MERS precedentemente noti.121,131 Quindi, è vale la pena rivisitare queste strategie terapeutiche / vaccinali strettamente correlate e l’uso associato delle nanotecnologie,

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Figura 4
Strategie di nanomedicina per le terapie COVID-19 e lo sviluppo di vaccini.

Strategia 1. Selezione di nanocarrier per bypassare i limiti convenzionali di un candidato alla droga

Ad esempio, coniugati farmaco-anticorpo relativamente sicuri di auristatine altamente tossiche sono approvati per il trattamento dei tumori ematologici. Una delle principali limitazioni per l’uso di questi coniugati è il carico utile del farmaco tollerabile molto basso. Per risolvere questo problema, sono state sviluppate nanoparticelle polimeriche con un elevato carico utile di auristatina per ottenere una soppressione del tumore efficiente e sicura.149 Allo stesso modo, la formulazione di nanoparticelle a base di poli (glicole etilenico) -poli (lattide) caricate con inibitore della chinasi Aurora B ha rivelato una maggiore efficacia e tossicità ridotta rispetto alla sua forma libera che ha prodotto effetti collaterali intollerabili negli studi clinici di fase II.150 Una ben nota limitazione dei farmaci candidati all’acido nucleico (ad esempio RNAi) è la loro instabilità della circolazione sistemica e il prerequisito della loro consegna intracellulare.

Strategia 2. Farmaci alterati chimicamente / (ri) ingegnerizzati

Le molecole dei farmaci vengono alterate per migliorare la loro compatibilità con una particolare classe o tipo di nanocarrier, rendendo questo un approccio più generico per farmaci candidati con proprietà fisico-chimiche simili.158,159 I nanocarrier a doppio strato lipidico (liposomi) sono nanocarrier preferiti per il caricamento remoto basato su gradiente di pH di anfifili e farmaci ionizzabili.160

L’idrofobicità della doxorubicina è stata modificata chimicamente per aumentarne la compatibilità con le nanoparticelle poli (acido lattico-co-glicolico ).161

Un altro approccio di interesse qui è la sintesi di “profarmaci” per garantire la loro compatibilità e incorporazione all’interno di particolari nanocarrier insieme alle loro caratteristiche di rilascio controllato e localizzato. I profarmaci anti-HIV del candidato cabotegravir antiretrovirale (ARV) sono stati sintetizzati funzionalizzando esteri di acidi grassi (con lunghezze di carbonio variabili), seguiti dal suo rivestimento di polossamero per ottenere formulazioni nanocristalline stabili.

Studi di farmacocinetica in vivo su topi e macachi rhesus hanno rivelato un’efficacia significativamente migliorata di cabotegravir, mostrando un rilascio prolungato del farmaco e parametri farmacocinetici.162 Un’altra strategia profarmaco ARV per emtricitabina altamente solubile in acqua (utilizzando gruppi di mascheramento carbonato e carbammato bioreversibili) mostra un rilascio prolungato profarmaco previsto da modelli di estrapolazione in vitro a in vivo.163

Wei e colleghi hanno segnalato l’uso di liposomi caricati con idrossiclorochina modificata in colesterolo (Chol-HCQ) che hanno abbassato la dose e la tossicità dell’idrossiclorochina e hanno anche inibito la proliferazione dei fibroblasti polmonari di ratto, riducendo così la fibrosi polmonare.

Questa strategia può essere adottata per avere doppi benefici nei pazienti con SAR-COV-2, che mostrano carica virale e fibrosi polmonare.164 Utilizzando un legame estere idrolizzabile, è stato sintetizzato un coniugato farmaco-farmaco antitumorale di irinotecan (idrofilo) e clorambucile (idrofobico). .165

Le nanoparticelle sintetizzate dall’autoassemblaggio di questo coniugato farmaco-farmaco anfifilico mostrano una ritenzione sistemica prolungata, un accumulo di tessuto tumorale e un aumento della captazione cellulare. I leganti estere idrolizzabili coniugati a docetaxel ne hanno consentito il caricamento e il rilascio efficaci dalle micelle polimeriche reticolate con nucleo per fornire un’elevata efficacia terapeutica contro il cancro al seno e alle ovaie.166 Un altro profarmaco simile “acidi grassi coniugati a cabazitaxel” con lipidi PEG si nanoparticelle assemblate che mostrano una ridotta tossicità sistemica e un’efficacia antitumorale superiore.167

Strategia 3. Nanomedicina per la terapia farmacologica combinata

La terapia farmacologica combinata è un’altra possibilità per il trattamento di COVID-19, che offre numerosi vantaggi come dosaggi inferiori dei singoli farmaci che causano meno effetti collaterali, raggiungimento di obiettivi terapeutici multipli e complementari e riduzione della probabilità di sviluppo di resistenza. Diverse combinazioni di questo tipo per il nuovo trattamento del coronavirus sono documentate nelle informazioni paesaggistiche dell’OMS (Tabella 2).

I nanocarrier sono anche intrinsecamente molto utili per la somministrazione di più farmaci con diverse proprietà fisico-chimiche che promettono il pieno potenziale delle terapie combinate.168,169 La flessibilità offerta da una varietà di nanomateriali e tecniche di fabbricazione consente la progettazione di combinazioni di farmaci caricate in nanocarrier con un eccellente controllo nella conservazione rapporti sinergici tra farmaci, farmacocinetica sovrapposta e riduzione degli effetti collaterali associati alla combinazione.170

Sono descritte varie strategie di nanocarrier per il co-incapsulamento di farmaci sia idrofobici che idrofili (Figura Figura 55), ottenendo il rilascio sequenziale di due farmaci, carico raziometrico e rilascio controllato di tre farmaci candidati, consegna codificata di RNAi / plasmideDNA + chemioterapici e consegna in codice di siRNA + micoRNA.171−179

Una nanosospensione di LNP caricati con tre farmaci ARV (due idrofobici: lopinavir e ritonavir e uno idrofilo: tenofovir) è stata formulata per superare l’insufficienza farmacologica dei linfonodi della combinazione orale di questi farmaci. Questa formulazione di nanoparticelle ha mostrato profili di farmaci plasmatici di lunga durata e migliori livelli di farmaco nei linfonodi nei macachi modello in vivo.180

Una nanoformulazione liposomiale (Vyxeos) colorata con una combinazione fissa di farmaci antitumorali daunorubicina e citarabina è stata recentemente approvata dalla US-FDA per il trattamento della leucemia mieloide acuta negli adulti. Le nanoformulazioni magneto-liposomiali pegilate-magneto-liposomiali caricate con più farmaci (antiretrovirali, agenti riattivanti la latenza e antagonista dell’abuso di droghe) hanno mostrato trasmigrazione BBB in vitro e in vivo con significativa attività anti-HIV nelle cellule primarie del SNC.

Questa strategia nanoterapeutica multifunzionale può essere applicata al bersaglio SARS-COV-2 che è migrato al SNC.181 Tuttavia, i regimi di combinazione di farmaci sono uno standard di cura per un’ampia gamma di terapie, ma l’ottimizzazione delle loro nanoformulazioni è un compito in salita. Queste sfide di ottimizzazione includono l’analisi dell’interazione tra due o più farmaci, il bilanciamento dell’antagonismo / sinergia / tossicità e il controllo del profilo di rilascio dei singoli farmaci.182,183

Sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per comprendere le interazioni biologiche e scoprire qualsiasi tipo di sinergismo presente. io

n metodi di screening in vitro per determinare i rapporti ideali dei farmaci richiedono un aggiornamento per imitare il microambiente 3D del tessuto umano bersaglio.184 I modelli animali preclinici sono fondamentali per accelerare la traduzione clinica, ma una disparità tra il modello di malattia negli animali e la malattia umana è il motivo principale del fallimento dello studio.185 Gli scienziati della nanomedicina dovrebbero trarre vantaggio da strumenti avanzati di sviluppo di farmaci, tecnologie di screening, bioinformatica, modelli animali, ecc. per studiare e convalidare le terapie combinate di nanoparticelle.

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Figura 5
Piattaforme nanocarrier utilizzate per terapie farmacologiche combinate.

Tavolo 2

Trattamenti farmacologici di combinazione proposti per COVID-19

descrizione della combinazionecandidatistato
inibitori della proteasiritonavir + lopinavirsotto processo di COVID-19 186 , 187
inibitore non nucleosidico della trascrittasi inversa + inibitore nucleotidico della trascrittasi inversaemtricitabina + tenofovirsotto processo di COVID-19 188
inibitore nucleosidico + inibitore della proteasiribavirina + ritonavir / lopinavirstudio clinico della SARS 189  NCT00578825
antiretrovirale proteasi inibitore + cobicistat (per migliorare la biodisponibilità e  1/2 )darunavir + cobicistatsotto processo di COVID-19 189
antivirali + interferoni di tipo I – proteine ​​di segnalazione prodotte e rilasciate dalle cellule ospiti durante le infezioni viraliIFN (α, β, IFNα2a o rIFN-α2b o IFN-β1a) + ribavirinastudio clinico della SARS, 190  MERS 191 , 192
interferoni – proteine ​​di segnalazione prodotte e rilasciate dalle cellule ospiti durante infezioni virali + ormoni antivirali + steroidiIFN + ribavirina + steroidistudio clinico della SARS 193
inibitore della proteasi + proteine ​​prodotte e rilasciate dalle cellule ospiti + antiviralelopinavir + ritonavir + IFN + ribavirinastudio clinico di MERS 194
interferoni di tipo I – proteine ​​di segnalazione prodotte e rilasciate dalle cellule ospiti durante infezioni virali + immunosoppressoreIFN-β1a + micofenolato mofetilestudio clinico di MERS 195
inibitori della proteasi + proteine ​​prodotte e rilasciate dalle cellule ospitilopinavir + ritonavir + IFNβ1bstudio clinico di MERS 193
Interferone di tipo I ricombinante sviluppato sinteticamente + ormoni steroideiIFN alfacon-1 + corticosteroidistudio clinico di MERS 196

Consegna del vaccino

L’apparente somiglianza di SARS-CoV-2 con altri virus (principalmente SARS-CoV e MERS-CoV), insieme alla conoscenza precedente delle loro risposte immunitarie protettive, è di grande aiuto per sviluppare con successo il vaccino COVID-19.121,131

Le nanoparticelle possono essere caricate con un’ampia gamma di frazioni antigeniche (per intrappolamento fisico o coniugazione chimica) e una corretta visualizzazione antigenica le rende un’alternativa altamente rilevante in vaccinologia rispetto agli approcci convenzionali.

Oltre a salvaguardare la struttura nativa dell’antigene, le nanoparticelle migliorano anche il rilascio e la presentazione degli antigeni alle cellule presentanti l’antigene (APC). I principali vantaggi dei nanocarrier per vaccini sono la loro dimensione nanometrica, poiché anche molti sistemi biologici come virus (incluso SARS-CoV-2) e proteine ​​sono nanometrici.

Le nanoparticelle possono essere somministrate per via orale e intranasale e iniezioni sottocutanee e intramuscolari, offrendo un vantaggio chiave superando le barriere tissutali e mirando a posizioni chiave come i linfonodi, penetrando le barriere mucose ed epiteliali (vie aeree, nasali, gastrointestinali, ecc.). 200 −202

Rapporti precedenti hanno suggerito che sia l’immunità umorale che quella cellulo-mediata svolge un ruolo protettivo nell’infezione SARS-CoV.203,204 Le nanoparticelle hanno dimostrato la loro capacità di colpire sia i sistemi immunitari adattivi (cellule T, cellule B) che innati (macrofagi, monociti, neutrofili ) a livello cellulare.

La modulazione di APC utilizzando nanoparticelle potrebbe essere molto importante, in particolare per le strategie vaccinali COVID-19.205,206 La capacità delle nanoparticelle di fornire l’antigene alle cellule dendritiche (DC) migliorando la presentazione dell’antigene e molti altri meccanismi possono promuovere l’immunità delle cellule T.207

Smith et al. ha spiegato vari meccanismi basati su nanoparticelle per alterare l’induzione della risposta immunitaria in (Figura 6) .208

Per migliorare l’efficacia e la sicurezza dell’approccio vaccinale, un grande vantaggio presentato dalle nanoparticelle è la loro capacità di fornire adiuvanti molecolari e, in alcuni casi, i nanomateriali stessi possiedono una proprietà adiuvante intrinseca per gli antigeni caricati. L’OMS riporta (datato 27 maggio 2020) vari candidati vaccini a base di nanoparticelle in stadio preclinico (Tabella 3) .126

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Figura 6
Modulazione della risposta immunitaria basata su nanoparticelle. (a) Consegna dell’antigene da parte delle nanoparticelle (penetrazione dipendente dalle dimensioni e targeting di tessuti o organi). (b) L’effetto deposito fornisce un rilascio prolungato e sostenuto di antigene stabile. (c) La visualizzazione ripetitiva dell’antigene come risultato della presentazione dell’antigene sulla superficie delle nanoparticelle aiuta l’attivazione del recettore sulle APC e sulle cellule B e (d) la presentazione incrociata dell’antigene fornito dalle nanoparticelle (rilascio citosolico) per attivare le cellule T CD8 + specifiche dell’antigene . Cellula presentante l’antigene (APC); cellula dendritica (DC); reticolo endoplasmatico (ER); Recettore delle cellule B (BCR); Recettore delle cellule T (TCR). Adattato con il permesso di rif (208). Copyright 2013 Springer Nature.

Tabella 3

Candidati vaccini basati su nanoparticelle nella valutazione preclinica Menzionati nel DRAFT Landscape of COVID-19 Candidate Vaccines (a partire dal 27 maggio 2020)

piattaformatipo di vaccino candidato asviluppatore
subunità proteicavaccino con nanoparticelle + matrice M (adiuvante) (a base di glicoproteina SARS-CoV-2 ricombinante)Novavax
antigeni peptidici formulati nella formulazione di LNPIMV, Inc.
vaccino con nanoparticelle (proteina ricombinante) (a base di proteina S e altri epitopi)Istituto di ricerca scientifica di vaccini e sieri, San Pietroburgo
Vaccino con nanoparticelleLakePharma, Inc.
RNAFormulazione LNP di mRNASanofi Pasteur/Translate Bio
Cocktail di mRNA incapsulato con LNP che codifica per VLPFudan University / Shanghai JiaoTong University / RNACure Biopharma
MRNA incapsulato con LNP che codifica per RBD
MRNA incapsulato con LNPUniversità di Tokyo / Daiichi-Sankyo
mRNA incapsulato in liposomiBIOCAD

a LNP: nanoparticelle lipidiche, VLP: particella simile a virus.

Approccio nanomedicale per il vaccino COVID-19
L’anamnesi complessiva del vaccino indica importanti successi contro malattie infettive acute, dove l’immunità sviluppata naturalmente (principalmente neutralizzando gli anticorpi) fornisce una protezione duratura in una sezione di pazienti.

Una delle sfide più grandi nella ricerca sul vaccino COVID-19 è identificare approcci che stimolino l’immunità sia delle cellule T che delle cellule B contro questo virus.

Un’altra sfida è la necessità di accelerare lo sviluppo di precise strategie vaccinali di “prossima generazione” che possano anche rivolgersi a specifici sottogruppi di popolazione o individui con immunità compromessa.209 Le strategie intelligenti per sviluppare vaccini COVID-19 basati su nanocarrier sono ugualmente importanti e talvolta si sovrappongono quando parallelamente alle terapie basate su nanocarrier.121,210

La strategia del nanovaccino richiede anche un forte accento sulla presentazione cellulare dell’antigene selezionato, insieme alla selezione di nanocarrier / nanomateriali appropriati per indurre effetti immunomodulatori complementari. La sezione seguente evidenzia la progettazione razionale dei vaccini basati su nanocarrier con due strategie.

Strategia 1. Selezione di nanocarrier dipendente dall’antigene

Il caricamento degli antigeni all’interno o sulla superficie dei nanocarrier dipende da diversi fattori tra cui le caratteristiche fisico-chimiche dell’antigene, la stabilità biologica, i siti target e la velocità di rilascio dell’immunogeno richiesta. L’adsorbimento fisico degli antigeni sulle nanoparticelle si basa sulla sua carica superficiale e sulle interazioni idrofobiche non covalenti.

Gli antigeni di natura anfotera sono più adatti per l’adsorbimento o l’immobilizzazione superficiale su nanocarrier come nanoparticelle polimeriche a base di chitosano e destrano solfato, nanoparticelle inorganiche (come AuNP) e nanotubi di carbonio.211-214

Il rilascio di antigeni in questi casi è predeterminato in base alle proprietà dell’ambiente biologico come pH, forza ionica, temperatura, ecc. L’incapsulamento e l’intrappolamento della matrice degli antigeni all’interno di un nanocarrier è un’altra tecnica utilizzata per prevenire la sua degradazione biologica.

Le nanoparticelle di poli (lattide-co-glicolide) (PLGA) sono ideali per incapsulare gli antigeni e forniscono un rilascio biologico controllato o prolungato.215 Queste nanoparticelle sono preclinicamente efficaci nel trasportare antigeni come HBsAg, antigeni della malaria tossoide tetanico, antigeni Listeria monocytogenes e Bacillus anthracis spore, generando una risposta immunitaria cellulare e umorale prolungata

Il vaccino COVID-19 basato su mRNA è già in fase di sperimentazione clinica che impiega LNP come vettore. Gli mRNA nudi sono sensibili alla degradazione da parte delle RNasi extracellulari, quindi è essenziale formulare il suo veicolo di rilascio.217,218 Inoltre, questi mRNA comportano il riconoscimento del loro recettore specifico per le cellule e la penetrazione nella membrana lipidica.

La presenza citosolica di mRNA esogene innesca quindi il meccanismo cellulare per la sua traduzione in proteine ​​completamente funzionali.219 Gli LNP sono particelle di dimensioni virali (80-200 nm) sintetizzate dall’autoassemblaggio di un lipide cationico ionizzabile.220 Possiedono la capacità di rilasciare mRNA in modo efficiente nel citoplasma, come dimostrato da diversi studi.

La cinetica a rilascio prolungato dell’espressione dell’mRNA e quindi la traduzione della proteina può essere ottenuta optando per vie intramuscolari e intradermiche, fornendo titoli anticorpali elevati e risposte immunitarie sia delle cellule B che delle cellule T.138 Diverse nanoparticelle di questi lipidi cationici (come 1,2 -dioleoilossi-3-trimetilammoniumpropano (DOTAP) o dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE)) sono formulati con sottili modificazioni (come lipidi cationici + nanoparticelle di colesterolo, lipidi cationici + colesterolo + PEG-LNP), dove il colesterolo viene utilizzato per aumentare la stabilità e il PEG-lipide per aumentare l’emivita della formulazione.

Oltre agli LNP, altri nanocarrier di mRNA includono nanoliposomi di protamina (peptide cationico) (∼100 nm), nanoparticelle di dendrimeri funzionalizzati con lipidi PEG (∼200 nm), nanoemulsione cationica olio in acqua (O / W) a carica positiva (∼120 nm ), nanoparticelle di polietilenimmina (100-300 nm) e nanoparticelle di polimero cationico (chitosano) (300-600 nm) .221-223Figura Figura 77, I – V rappresenta i metodi di somministrazione dei vaccini a mRNA e i nanocarrier comunemente usati.

Un file esterno che contiene un'immagine, un'illustrazione, ecc. Il nome dell'oggetto è nn0c04006_0008.jpg
Figura 7
Principali metodi di somministrazione per vaccini a mRNA e DNA. (I – V) Nanocarrier per la consegna di mRNA, (VI) nanocarrier per la consegna del DNA e (VII) tecnologia di elettroporazione per la consegna intradermica di vaccini a DNA.

Simile all’mRNA, il DNA nudo sperimenta anche la degradazione sistemica da parte delle nucleasi e la consegna incompleta a cellule immunitarie specializzate. Per le formulazioni di vaccini a base di DNA vengono proposti nanocarrier a base di lipidi cationici (abbastanza simili al rilascio di mRNA), polimeri sintetici e naturali e particelle inorganiche.

I nanocarrier polimerici che incapsulano il DNA prevengono l’inattivazione biologica e forniscono un rilascio controllato e un rilascio cellulare mirato. I nanocarrier PLGA sono la piattaforma polimerica più studiata per lo sviluppo di vaccini a DNA, che mostrano migliori risposte sistemiche anticorpali antigene-specifiche.224,225

Per migliorare l’efficienza del caricamento del DNA e la protezione sistemica, vengono esplorate nanoparticelle PLGA funzionali o composite (come glicole-chitosano cationico + PLGA, PLGA + polietilenimmina (PEI)) (Figura Figura 77, VI) .226,227 Altri polimeri cationici ben documentati a base di nanocarrier per la progettazione di vaccini a DNA sono nanoparticelle di chitosano e nanoparticelle / complessi PEI.

L’uso della funzionalizzazione PEG sulle superfici delle nanoparticelle è abbastanza comune per introdurre caratteristiche invisibili (le rende non rilevabili ai fagociti e previene la clearance del sistema reticoloendoteliale), previene l’interazione proteica aspecifica, riduce la tossicità sistemica e migliora la stabilità.228,229

Per migliorare il rilascio di mRNA / DNA attraverso la membrana cellulare e del nucleo, sono allo studio tecnologie fisiche come la pistola genica e l’elettroporazione. Attualmente, lo sviluppo del vaccino sta sfruttando la tecnologia dell’elettroporazione per indurre i pori della membrana cellulare a inserire il DNA (Figura Figura 77, VII). 215,230,231.

Le nanoparticelle di PLGA rivestite di DNA con elettroporazione di superficie hanno mostrato un rilascio cellulare efficiente per suscitare la risposta delle cellule B e T nei suini.231 Il futuro clinico di tali tecnologie di elettroporazione portatile è ora evidente nella corsa della ricerca sul vaccino COVID-19.232 Uno studio clinico in corso (NCT04336410) sta utilizzando un plasmide di DNA che codifica la proteina S SARS-CoV-2 come candidato vaccino per la somministrazione intradermica utilizzando un dispositivo di elettroporazione (CELLECTRA 2000).

Strategia 2. Nanoparticelle adiuvanti del vaccino

Si ritiene che le nanoparticelle di adiuvanti vaccinali (VAN) migliorino l’efficacia e la sicurezza complessive della risposta immunitaria generata. In particolare nella situazione pandemica COVID-19, gli adiuvanti del vaccino sono fondamentali per ridurre la dose di antigene richiesta (dose risparmiata), consentendo la produzione di più unità e rendendola disponibile a una popolazione più ampia.233

Tra i molti candidati vaccini preclinici COVID-19, sono riportati cinque candidati vaccini con subunità proteiche utilizzando una combinazione di antigene e adiuvante. NVX-CoV2373, un vaccino con nanoparticelle (a base di glicoproteina SARS-CoV-2 ricombinante) con un adiuvante (matrice M) dovrebbe essere presto introdotto negli studi clinici.

Quindi, è importante discutere le possibili strategie impiegate dai VAN in altri studi di ricerca che potrebbero aiutare a migliorare gli attuali progetti di vaccini COVID-19. Informare specifiche cellule immunitarie di attivare una risposta immunitaria protettiva contro uno specifico antigene è il meccanismo di base dei VAN progettati per migliorare l’efficacia (fungendo da stimoli di promozione dell’immunità, chiamati anche “segnali di pericolo”).

Nel caso di un virus, questi segnali di pericolo sono caratterizzati come PAMP e modelli molecolari associati al danno (DAMP) derivati ​​dallo stesso virus.235 I PAMP e i DAMP sono riconosciuti da recettori specifici chiamati recettori di riconoscimento dei modelli (PRR).

Un esempio di tali recettori sono i recettori Toll-like che sono espressi dalle cellule immunitarie per sovraregolare il priming robusto dei linfociti T e B rilasciando citochine infiammatorie.236-238 Gli adiuvanti che migliorano la sicurezza forniscono una sorta di segnale contro-regolatorio che istruisce il sistema immunitario a sviluppare un tolleranza per gli antigeni in arrivo. I VAN possono agire come nanocarrier per adiuvanti molecolari o avere una proprietà fisico-chimica intrinseca per stimolare il percorso pro o anti-immunità.211

I VAN sono progettati per affrontare i limiti legati alla somministrazione convenzionale di adiuvanti vaccinali molecolari come la rapida eliminazione del flusso sanguigno, la distribuzione sistemica e la mancanza di targeting delle cellule immunitarie, nonché la mancanza di colocalizzazione antigene-adiuvante. Le nanoparticelle polimeriche che incapsulano piccole molecole sono impiegate per il rilascio organo-specifico linfoide con esposizione controllata.

L’effetto di risparmio della dose è riportato con nanoparticelle liposomiali colorate che mostrano risposte immunitarie sicure e senza compromessi.239 Il targeting dei linfonodi dei VAN è una strategia consolidata per ottenere un risparmio di dose significativamente elevato effetto, mentre le DC che prendono di mira i VAN possono aumentare la sua adiuvanticità.

I risultati di uno studio in vivo contro la provocazione infettiva hanno dimostrato che le nanoparticelle di PLGA e fosfato di calcio co-incapsulano sia l’antigene che gli adiuvanti per migliorare l’efficacia aumentando l’assorbimento dell’antigene, l’attivazione dell’APC e titoli anticorpali più elevati.240-242 In altri studi, la strategia di co-incapsulamento consente il la colocalizzazione dell’antigene e dell’adiuvante nei compartimenti endosomiali / fagosomiali favorendo l’attivazione delle DC e innesca una robusta presentazione incrociata e il priming dei linfociti T. 243,244

È stata osservata un’attivazione sinergica di APC e una risposta anticorpale prolungata con la consegna codificata di adiuvanti di piccole molecole TLR4 e TLR7 utilizzando nanoparticelle PLGA.245 VAN (inclusi PLGA, AuNP) sono anche impiegati per codeliver auto-antigeni o farmaci immunoregolatori come adiuvanti per indurre antigene specifico tolleranza periferica dei linfociti T autoreattivi e blocca qualsiasi risposta autoimmune grave.246-251

Le nanoparticelle a causa della loro intrinseca adiuvanticità (attivando il sistema del complemento, inducendo l’autofagia e l’attivazione dell’inflammasoma) sono anche considerate come VAN.252-258 La chimica di superficie e l’idrofobicità delle nanoparticelle insieme ad altre proprietà fisico-chimiche sono in grado di eleggere intrinsecamente questi meccanismi adiuvanti.253,259,260

L’attivazione del sistema di complimento dipendente dai gruppi idrossilici seguita da miglioramento dell’immunità cellulare è stata segnalata con nanoparticelle di poli (propilene solfuro) stabilizzate pluroniche.259 È stato segnalato che le nanoparticelle di allumina coniugate con antigene migliorano le risposte immunitarie cellulari e umorali come risultato dell’induzione dell’autofagia nelle DC, promuovendo l’antigene presentazione incrociata ai linfociti T. 255

È stato riportato che le nanoparticelle di oro e PLG attivano l’inflammasoma NALP3 nelle DC, con conseguente miglioramento dell’adiuvanticità simile a un meccanismo di adiuvanticità mediato dall’allume.261,262 L’aumento dell’idrofobicità della catena laterale delle nanoparticelle di poli (acido γ-glutammico) ha mostrato un aumento dell’assorbimento e dell’attivazione delle DC.263 Allo stesso modo , L’idrofobicità superficiale di AuNP può aumentare l’espressione di citochine infiammatorie sia in vitro che in vivo. (264)

Gli adiuvanti vaccinali sono stati utilizzati per aumentare l’efficienza e le risposte anticorpali dei vaccini negli anziani. Comprendono i gruppi più vulnerabili della popolazione e hanno il più alto tasso di mortalità per la malattia COVID-19.265,266 L’invecchiamento è associato a un’infiammazione sistemica subclinica cronica continua (infiammazione-invecchiamento) e all’indebolimento acquisito del sistema immunitario, cioè senescenza immunitaria. .267

La senescenza immunitaria è contrassegnata da una significativa diminuzione dell’immunoglobulina M, dei livelli di interferone, della conta dei linfociti T, della velocità di divisione e proliferazione cellulare, della chemiotassi dei neutrofili e della fagocitosi.267,268 Emulsione O / W, complessi immunostimolanti, liposomi cationici e anionici, virosomi e le microparticelle sono tra le varie tecnologie adiuvanti sviluppate per migliorare la vaccinazione antinfluenzale nella popolazione anziana.129

Gli adiuvanti di emulsione O / W a base di squalene MF59 e AS03 sono stati autorizzati per i vaccini antinfluenzali destinati agli anziani.269,270 Un adiuvante a base di liposomi AS01 è un altro esempio chiave di tecnologia con licenza sviluppata per il vaccino della subunità herpes zoster rivolto alla popolazione anziana o superiore) .271,272

L’aggiunta di adiuvanti ha mostrato una diminuzione del rischio di polmonite e influenza negli studi clinici e può quindi svolgere un ruolo significativo nella regolazione delle risposte del sistema immunitario degli anziani, che possono essere ulteriormente regolate per il progresso del vaccino COVID-19.129

Portata di vari approcci nanotecnologici

Lo scopo della nanotecnologia per le terapie COVID-19 e la ricerca sui vaccini non è limitato ai progetti terapeutici e di vaccini convenzionali. Diversi altri approcci, tra cui approcci nanomateriali e biomimetici avanzati, rappresentano un buon potenziale utilizzo in un’epidemia simile a COVID-19.

Szunerits e colleghi hanno studiato la prospettiva di punti quantici di carbonio funzionalizzati (CQD) per inibire l’infezione da coronavirus umano (HCoV-229E) (Figura 88, I – III) .273 CQD di diverse dimensioni (<10 nm), potenziale di superficie (Da -7,9 a -39,2 mV) e le funzionalità sono state esplorate come inibitori dell’infezione da cellule Huh-7 (cellula ospite) da HCoV-229E e hanno mostrato un’inattivazione del virus dipendente dalla concentrazione.

I CQD modificati con acido boronico hanno mostrato la massima efficacia con un valore EC50 di 5,2 ± 0,7 μg mL – 1, illustrando l’importanza della funzionalità dell’acido boronico per inibire l’interazione nella fase iniziale del recettore della proteina S virale con la membrana della cellula ospite. Le membrane cellulari che imitano i nanodecoys sono una scelta interessante per ingannare e intrappolare i patogeni.

Questi nanodecoys biomimetici includono formulazioni liposomiali, lipoproteine ​​ricostituite e nanostrutture di membrane cellulari.274 Liposomi con superficie ingegnerizzata mirata con anticorpi antivirali costituiscono una strategia efficace per fornire protezione contro l’infezione del virus coxsackie A-21.275 Allo stesso modo, membrana cellulare ospite della zanzara vengono impiegati nanodecoys avvolti per intrappolare il virus Zika e prevenire efficacemente l’infezione delle cellule ospiti

Lauster e colleghi hanno presentato un approccio interessante che impiega una proteina spike del virus dell’influenza A (emeagglutinina, HA) che imita un legante multivalente che può legarsi al virus in una modalità multivalente distinta e inibirne l’infezione.277 Normalmente si osserva un legame multivalente. tra l’HA trimerico virale e i residui di acido sialico terminale (Sia) dei glicani superficiali della cellula ospite.

La presentazione strutturalmente definita dei ligandi Sia è funzionalizzata su uno scaffold 3D simmetrico compatto, cioè un capside batteriofago simile a una cellula ospite e mirato all’ectodominio HA trimerico del virus. I residui K16 presenti nel rivestimento proteico dei batteriofagi icosaedrici simmetrici Qβ capside (diametro ∼25 nm) hanno fornito una piattaforma ideale per ancorare i ligandi Sia con una lunghezza variabile del linker per imitare i siti di legame del trimer di HA (Figura Figura88, IV).

La tomografia crioelettronica ha mostrato che questi capsidi Qβ coprivano l’involucro del virus A / X31 (sottotipo H3N2) e bloccavano significativamente l’interazione della cellula ospite (Figura 88, V). Le nanoparticelle del capside fagico hanno dimostrato il potenziale di inibire l’infezione da virus durante studi in vitro, ex vivo e in vivo (Figura Figura88, VI).

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Figura 8
Vari approcci nanotecnologici. (I) Sintesi idrotermale di CQD funzionalizzati, come inibitore del legame di HCoV-229E – cellule Huh-7 (cellula ospite) e ulteriore infezione. (II, A) Inibizione virale dipendente dalla concentrazione con CQD (1–4) e (II, B) EC50 per CQD (3, 4) e CQD-3 + mannosio (rapporto di incubazione di 2: 1, 4 ° C per la notte ). (III, A) Inibizione virale dipendente dalla concentrazione con CQD (5–7), (III, B) EC50 per CQD (5 e 6) e (III, C) EC50 per CQD (5 e 6) + mannosio (incubazione rapporto 2: 1, 4 ° C per la notte) .273 Adattato con il permesso di rif (273). Copyright 2019 American Chemical Society. (IV) Qβ fago capside come legante del virus dell’influenza A multivalente e ad alta affinità (a) somiglianza strutturale tra i siti di attacco Sia (presenti sul capside) e le tasche di legame HA-Sia (sul virione A / X31), (b) procedura di funzionalizzazione del fago capside Qβ per introdurre ligandi Sia, (c) test di inibizione dell’emoagglutinazione contro diverse unità HA (KiHAI, in nero) e le costanti di dissociazione apparenti (KD, app in verde) misurate mediante termoforesi su microscala contro A / X31 virione. (V) immagini Cryo-TEM che mostrano diversi capsidi Qβ che coprono l’involucro A / X31 e bloccano l’interazione dell’ospite: (a) Qβ [Gal3] senza interazione virale, (b) Qβ [Sia1] decorato con virus, (c) a Modello 3D che mostra più capsidi Qβ [Sia1] (viola) attaccati con un singolo virione (involucro giallo), HA (ciano) e neuraminidasi (NA, verde) (scala per a, b: 100 nm ec: 25 nm). (d – f) Il cerchio rosso indica incidenti di legame specifici di Qβ [Sia1] capside a trimeri HA e (g) eventi di legame di ectodomini HA virali a Qβ [Sia1] capside discreto presentato con raccolta di 20 immagini (scala per d – g: 20 nm). (VI) Studio di inibizione dei ceppi del virus dell’influenza A da parte di Qβ [Sia1] capside. (a) Immagini confocali che mostrano i capsidi Qβ [Sia1] che inibiscono l’infezione virale (A / Pan / 99) di cellule A549 (cellule infette: giallo, nuclei: blu e scala: 40 μm). (b) La percentuale di cellule infette (utilizzando il segnale della nucleoproteina virale) con diversi trattamenti e un controllo. (c) Studio di inibizione di A / X31 vincola l’infezione utilizzando Qβ [Sia1] fago capside e la sua tossicità cellulare in assenza di virus (Qβ [Hpg] è usato come controllo). (d) Grafico a barre che mostra i titoli del supernatante cellulare dei virus A / X31 e A / Pan / 99 dopo il trattamento con Qβ [Sia1] e oseltamivir carbossilato (OC) (senza trattamento come controllo, PFU: unità formanti placche). (e) Esperimento ex vivo che mostra il potenziale di Qβ [Sia1] capside di inibire l’infezione virionica A / Pan / 99 nel tessuto polmonare umano. (f) L’esperimento in vivo su topi BALB / c mostra il potenziale di Qβ [Sia1] capside di proteggere le infezioni A / X31. Adattato con il permesso del rif (277). Copyright 2020 Springer Nature.

link di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7325519/


Ulteriori informazioni:  Wei ‐ Chiao Huang et al. L’induzione dell’anticorpo neutralizzante SARS ‐ CoV ‐ 2 RBD è potenziata dalla vaccinazione antiparticolato,  materiali avanzati  (2020). DOI: 10.1002 / adma.202005637

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