COVID-19: confermato che gli anticorpi vengono rilevati fino a 3 mesi dopo l’infezione

Un nuovo studio sugli operatori sanitari condotto dal Barcelona Institute for Global Health (ISGlobal) mostra che gli anticorpi IgA e IgM contro SARS-CoV-2 decadono rapidamente, mentre i livelli di anticorpi IgG vengono mantenuti per almeno tre mesi dopo l’infezione.

Il follow-up più lungo di questo gruppo fornirà le informazioni tanto necessarie sulla durata dei diversi tipi di anticorpi contro SARS-CoV-2, il virus che causa COVID-19 , nonché sul loro ruolo nella protezione da malattie e reinfezioni.

Dall’inizio della pandemia COVID-19, ci sono state due domande scottanti: quante persone sono state realmente infettate e se le persone infette sono protette da future reinfezioni o malattie.

I ricercatori di ISGlobal Carlota Dobaño e Alberto García-Basteiro hanno unito le forze per aiutare a rispondere a queste domande con lo studio SEROCOV1, che intende seguire una coorte di oltre 550 operatori sanitari presso l’Hospital Clínic di Barcellona.

Il team ha dimostrato che, al culmine della pandemia COVID-19 in Spagna, la prevalenza dell’infezione da SARS-CoV-2 tra gli operatori sanitari era dell’11,2% (il 9,2% aveva anticorpi e il 2% aveva un’infezione attiva rilevata dalla PCR).

Questa era leggermente superiore alla prevalenza di anticorpi nella popolazione generale di Barcellona (7%), stimata da uno studio nazionale di sieroprevalenza eseguito poco dopo.

In questo nuovo studio, i ricercatori di ISGlobal e Hospital Clínic presentano i dati dopo tre mesi di follow-up dello stesso gruppo di operatori sanitari. 

Come nel primo studio, un test immunitario basato sulla tecnologia Luminex sviluppata dal team di Dobaño è stato utilizzato per misurare tre tipi principali di anticorpi (IgM, IgG e IgA) diretti contro il dominio di legame del recettore (RBD) del SARS-CoV-2 Proteina Spike, che le consente di infettare le cellule umane.

I risultati mostrano che, un mese dopo la valutazione iniziale di sieroprevalenza condotta all’inizio di aprile 2020, la percentuale di partecipanti con evidenza di infezione precedente o attuale era aumentata al 15% e che circa il 60% delle nuove infezioni rilevate era asintomatica.

“In un mese, abbiamo trovato 25 nuove infezioni tra i partecipanti, il che è piuttosto alto, considerando che il picco della pandemia era passato e la popolazione era rimasta confinata per più di un mese”, dice García-Basteiro, che è anche un medico presso il Servizio Sanitario Internazionale di Hospital Clínic.

Degli 82 partecipanti sieropositivi rilevati al mese 1, 66 sono stati seguiti per altri due mesi. Entro il terzo mese, la maggior parte (78%) non aveva più livelli rilevabili di IgM, alcuni (24,5%) non avevano più IgA rilevabili, ma la maggioranza (97%) ha mantenuto livelli rilevabili di IgG.

In effetti, i livelli di IgG in alcuni partecipanti sono aumentati rispetto alla prima analisi. I casi sintomatici avevano livelli più elevati di IgA ma non sono state osservate differenze nella velocità con cui gli anticorpi diminuivano tra infezioni asintomatiche e sintomatiche. Nel complesso, i livelli di IgG1 erano più alti, sebbene alti livelli di IgG2 fossero correlati a una maggiore durata dei sintomi.

“I nostri risultati confermano che gli anticorpi IgM e IgA diminuiscono rapidamente entro il primo mese o due dopo l’infezione, cosa che dovrebbe essere tenuta presente quando si eseguono studi di sieroprevalenza o si interpretano i risultati sierologici”, afferma Gemma Moncunill, prima autrice dello studio.

“Anche se la durata degli anticorpi IgG rilevabili dopo l’infezione è ancora sconosciuta, i nostri risultati mostrano che rimangono relativamente stabili per almeno tre mesi“, aggiunge. 

Il team di SEROCOV1 (che comprende ricercatori di diversi programmi di ISGlobal e dei dipartimenti di salute sul lavoro, medicina preventiva e salute internazionale presso Hospital Clínic) prevede di seguire questa coorte per un tempo più lungo, al fine di valutare l’evoluzione della sieroprevalenza in questo gruppo ad alto rischio, la durata degli anticorpi rilevabili, inclusi diversi isotipi e sottoclassi di diversi antigeni, e il loro ruolo nella protezione da malattie e reinfezioni.

Un test estremamente potente per misurare gli anticorpi SARS-CoV-2

Infatti, il team di Dobaño ha recentemente sviluppato e pubblicato un saggio multiplex per misurare simultaneamente IgM, IgA e IgG su un pannello di otto diversi frammenti virali (antigeni) da spike SARS-CoV-2 (S), nucleoproteine ​​(N) e membrana ( M) proteine.

I test mostrano una specificità del 100% e una sensibilità superiore al 95% e sono stati ottimizzati per ridurre al minimo il tempo di elaborazione. Combinando più marcatori, questi test possono rilevare una gamma più ampia di risposte anticorpali di basso livello nella popolazione.

“Oltre a valutare meglio l’ immunità SARS-CoV-2 nella popolazione, questi test possono essere di grande valore per valutare i marcatori di protezione durante il test dei vaccini COVID-19 ” , afferma Dobaño.

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Gli anticorpi svolgono un ruolo importante nella neutralizzazione del virus e forniscono protezione all’ospite contro la reinfezione virale. La risposta anticorpale all’infezione da SARS-CoV-2 è stata ampiamente studiata nel sangue (siero, plasma) dei pazienti COVID-19 al fine di ottenere informazioni sulla risposta immunitaria dell’ospite.

I livelli di anticorpi contro la proteina spike sono particolarmente importanti poiché questa grande glicoproteina trimerica ospita il dominio di legame del recettore (RBD). L’RBD facilita l’accesso di SARS-CoV-2 alle cellule umane legandosi al suo contro-recettore dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE-2) (1) e gli anticorpi neutralizzanti hanno dimostrato di colpire l’RBD (2).

La maggior parte degli studi concorda sul fatto che gli anticorpi IgG contro gli spike SARS-CoV-2 e gli antigeni RBD vengono rilevati nel sangue di oltre il 90% dei soggetti entro 10-11 giorni dall’insorgenza dei sintomi (PSO) (3-7). Tuttavia, se i livelli di IgG specifiche per l’antigene SARS-CoV-2 persistono (8-13), o in alternativa decadono (14), rimane una questione dibattuta.

L’esame di diversi biofluidi da più coorti e l’attenzione agli antigeni testati è necessario per risolvere questo problema estremamente importante che ha un’elevata rilevanza per la progettazione del vaccino.

Un’altra lacuna nella nostra conoscenza è che sappiamo molto poco sulla risposta anticorpale locale nel sito dell’infezione. SARS-CoV-2 entra nei tratti naso e oro-faringeo dove successivamente si replica (15). Per questo motivo, i tamponi nasofaringei e faringei vengono utilizzati per testare il virus utilizzando la PCR quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR) per rilevare l’RNA virale.

Tuttavia, la saliva ha anche dimostrato di essere un biofluido efficace per testare la presenza dell’mRNA di SARS-CoV-2 (16-19). Ciò ha senso dato che la diffusione faringea di SARS-CoV-2 precede la replicazione virale nei polmoni (15) e, come il citomegalovirus (20, 21), le ghiandole salivari stesse possono essere un serbatoio per il virus (22).

Eppure, nonostante la cavità orale sia un sito per la replicazione virale, pochi studi hanno esaminato gli anticorpi anti-SARS-CoV-2 in questo compartimento.

In questo studio, abbiamo esaminato la risposta anticorpale anti-SARS-CoV-2 per un periodo di 115 giorni nel siero e nella saliva da n = 439 (siero) en = 128 (saliva) pazienti con COVID-19, rispetto ai controlli . Le IgG specifiche per l’antigene in entrambi i biofluidi sono state rilevate al massimo entro 16-30 giorni di PSO e non sono diminuite drasticamente nel livello relativo fino a 105-115 giorni di PSO.

Al contrario, IgM e IgA antigene-specifiche sono state indotte rapidamente ma successivamente sono diminuite sia nel siero che nella saliva. Nel siero, gli anticorpi neutralizzanti hanno raggiunto il loro massimo entro 31-45 giorni PSO e sono diminuiti lentamente fino a 105 giorni, con un calo più pronunciato nell’ultimo prelievo di sangue (105-115 giorni PSO)

È importante sottolineare che i livelli di IgG e IgM contro entrambi gli antigeni erano fortemente correlati tra i campioni di siero e saliva appaiati (n = 71), indicando che la saliva può essere utilizzata per monitorare la risposta immunitaria all’infezione da SARS-CoV-2. Nel loro insieme, la risposta IgG sistemica e mucosa a SARS-CoV-2 è sostenuta per un periodo di 3 mesi, mentre la risposta IgM e IgA si verifica precocemente ed è transitoria.

RISULTATI

Un metodo chemiluminescente completamente automatizzato per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni SARS-CoV-2 nel siero di pazienti acuti e convalescenti

Per studiare la risposta anticorpale a SARS-CoV-2, inizialmente ci siamo concentrati sugli anticorpi (IgM, IgG, IgA) contro l’omotrimero spike e RBD, poiché gli anticorpi neutralizzanti sono diretti alla proteina spike (23). I saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la rilevazione nel siero (o plasma) di trimeri anti-spike e anticorpi RBD anti-spike sono stati costruiti come in (3, 24) come test colorimetrici a 96 pozzetti e implementati come 384- bene i saggi di chemiluminescenza.

Per tutti i test basati su siero, i valori colorimetrici o chemiluminescenti sottratti al bianco sono stati normalizzati a un pool di sieri di convalescenza aggiunti a ciascuna piastra del test ed espressi come rapporti a questo pool di campioni positivi (letture ELISA convertite in rapporto; vedere Metodi).

Le curve Receiver-Operating Characteristic (ROC) sono state generate su coorti di veri negativi (campioni in banca raccolti pre-COVID, n = 339 per saggi manuali e automatici) e positivi (pazienti convalescenti con diagnosi PCR confermata, n = 402 per saggi manuali e automatizzati , vedi tabella 1).

Per i saggi IgG manuali e automatici, in queste coorti sono state ottenute sensibilità del 95,6% e del 95,5% per il picco e del 93,8% e del 91,3% per RBD, rispettivamente, con un tasso di falsi positivi ≤1% (Figura S1A-B e Tabella S1 per le statistiche ROC). Le aree sotto le curve (AUC) erano ≥0,97 in tutti i casi, indicando eccellenti prestazioni del test.

Sono stati sviluppati anche test automatizzati per la rilevazione di IgA e IgM (Figura S1C-D), sebbene le caratteristiche di sensibilità / specificità fossero inferiori a quelle dei test IgG almeno in parte perché, come descritto di seguito, queste risposte anticorpali diminuiscono più rapidamente . I risultati per i test IgG automatici e manuali erano ben correlati (Figura S1E-F).

Tabella 1

Coorti di pazienti e controlli negativi.

	SALIVA	SANGUE
	No. pazienti	No. campioni	Età media	Sesso		No. pazienti	No. campioni	Età media	Sesso
No. M	No. F		No. M	No. F
Tutti i campioni		247	263	–	141	106	Tutti i campioni	739	796	–	379	360
Pazienti con COVID-19	Coorte 1	47	54	61	28	19	Pazienti con COVID-19	439	496	58	229	210
Coorte 2	81	90	58	48	33
Controlli negativi pre-COVID	Coorte 1	0	0	0	0	0	Controlli negativi pre-COVID	300	300	54.5	150	150
Coorte 2	27	27	43	12	15
Controlli negativi non esposti raccolti nel 2020	Coorte 1	42	42	60	24	18
Coorte 2	50	50	58	29	21
Campioni di siero-saliva abbinati		71	71	58	33	38

Questi saggi ELISA automatizzati sono stati utilizzati per profilare coorti di sieri acuti e convalescenti confermati da pazienti COVID-19 raccolti come parte della sorveglianza COVID-19 dal Toronto Invasive Bacterial Diseases Network (Tabella 1).

Come previsto, sulla base dell’analisi ROC i controlli convalescenti e pre-COVID avevano distribuzioni di rapporti molto diverse per entrambi gli antigeni (Fig. 1A, D). D’altra parte, il siero raccolto da pazienti con meno di 21 giorni di PSO (siero acuto, n = 132) aveva distribuzioni bimodali nelle loro risposte IgG per entrambi gli antigeni (con una media complessiva inferiore), suggerendo che le concentrazioni di anticorpi stavano aumentando nel tempo.

Per confrontare la relazione tra RBD e livelli di spike trimer IgG, abbiamo tracciato i loro valori l’uno contro l’altro. Sebbene vi fosse una correlazione complessivamente elevata tra gli antigeni (Fig. 1G), abbiamo notato molti più campioni acuti con risposte ad alto picco-trimero e bassa RBD rispetto al contrario, coerentemente con il fatto che RBD è incluso all’interno dell’antigene del trimero spike.

Anche la concentrazione di IgA e IgM nel siero convalescente era nettamente superiore a quella dei campioni pre-COVID, ma i casi acuti avevano una mediana più alta rispetto ai convalescenti (Fig. 1B & E, C & F). Anche i livelli di IgA e IgM a RBD e spike erano ben correlati (Fig. 1H-I).

La distribuzione bimodale delle risposte IgG nel siero acuto (Fig. 1A, D), insieme ai diversi pattern di risposta per IgG rispetto a IgA / IgM nei campioni acuti e convalescenti (Fig. 1B & E, C & F), ha suggerito noi per tracciare i livelli di anticorpi rispetto ai giorni di PSO.

L’analisi di correlazione dei ranghi di Spearman ha rivelato un aumento complessivo della risposta IgG rispetto a una diminuzione della risposta IgA e IgM ad entrambi gli antigeni nel tempo e la risposta IgG in particolare non sembrava essere lineare (confrontare i pannelli AB con CD ed EF nella Figura S2 ; I risultati delle IgG sono stati riprodotti nell’analisi dei saggi IgG manuali, mostrati nei pannelli GH).

Per esaminare questa risposta più da vicino, i campioni sono stati raggruppati per giorni PSO (intervalli di 15 giorni) e sono stati tracciati i livelli delle diverse immunoglobuline (i campioni di controllo negativo pre-COVID sono stati tracciati insieme per il confronto; Fig.2). Come è stato riportato in altri studi (3, 4, 7), i livelli di IgG hanno raggiunto il picco nel periodo di 16-30 giorni, ei livelli di IgG contro il trimero dei picchi sono apparsi relativamente sostenuti per 115 giorni (Fig. 2A).

I livelli di IgG contro RBD hanno mostrato una diminuzione di ~ 25,3% entro il giorno 105 e di ~ 46,0% entro il giorno 115 (Fig. 2D). I livelli di IgA e IgM per entrambi gli antigeni erano invece molto meno sostenuti: dopo aver raggiunto un massimo nel periodo di 16-30 giorni, si è verificato un netto e continuo declino per tutta la serie temporale in modo tale che entro 115 giorni, gli anti-spike e gli anti- I livelli di IgA RBD erano ~ 74,1% e ~ 84,2% dei rispettivi livelli massimi, mentre i livelli di IgM erano ~ 66,2% e ~ 75,1%, rispettivamente (Fig. 2B, E & C, F).

Le analisi multivariabili che regolano la gravità della malattia, il sesso e l’età del paziente non hanno modificato le conclusioni sulle suddette relazioni tra tempo PSO e IgM anti-RBD, IgM anti-spike, IgA anti-RBD, IgA anti-spike e anti-RBD IgG; tuttavia, il modesto calo delle IgG anti-spike dopo il giorno 35 è stato statisticamente significativo (dati non mostrati).

La stabilità relativa dei livelli del trimero anti-spike IgG, una diminuzione parziale dei livelli IgG anti-RBD e IgA anti-spike e una perdita quasi completa dei livelli IgM e IgA anti-RBD nel tempo sono stati rilevati anche in coppie di risultati. campioni di siero di pazienti ospedalizzati (n = 57), raccolti al momento del ricovero e 3-12 settimane dopo, utilizzando un’analisi di loess non parametrica (Fig. 3 come in (25)).

Sebbene il nostro focus fosse sulla proteina spike, abbiamo anche esaminato la risposta dell’anticorpo al nucleocapside (noto anche come nucleoproteina, NP), poiché questo è l’antigene bersaglio di più test commerciali. Abbiamo sviluppato un saggio utilizzando NP espresso dai batteri (Figura S3A-C). Quando abbiamo esaminato i livelli di anticorpi anti-NP raggruppati per tempo PSO, abbiamo scoperto che i loro schemi erano molto simili a quelli per le risposte IgG e IgA / IgM anti-spike e anti-RBD, vale a dire una stabilità relativa nell’IgG e un declino più rapido Livelli di IgA / IgM sia nella serie temporale bin che nella serie longitudinale (Figura S3D-F).

Per valutare il potenziale di neutralizzazione di questi anticorpi, abbiamo utilizzato il nostro approccio ELISA (snELISA) di neutralizzazione surrogata basato su proteine ​​recentemente stabilito (Fig. 2G; (24)). In breve, snELISA misura la capacità degli anticorpi (nel siero nel nostro caso) di prevenire l’associazione di ACE2 biotinilato solubile a RBD immobilizzato: un segnale più alto (punteggio integrato di snELISA) in questo test indica una bassa neutralizzazione.

Utilizzando le serie temporali categorizzate come sopra, riportiamo che la neutralizzazione raggiunge il suo massimo nel periodo PSO di 31-45 giorni e diminuisce a un plateau mediano intermedio nei bin PSO di 46-105 giorni prima di scendere più drasticamente nel giorno 106–115 Campioni PSO (notiamo, tuttavia, che in questo intervallo di tempo sono presenti meno campioni (n = 9) rispetto agli altri contenitori (n = 20); Fig. 2G).

In sintesi, in un ampio sondaggio trasversale, i livelli di IgG, ma non di IgA o IgM, persistevano per almeno 3 mesi PSO per tutti gli antigeni misurati, con i livelli di anticorpi contro il trimero spike più stabili nel tempo rispetto a quelli per RBD e NP. I livelli di anticorpi neutralizzanti rispecchiavano questi livelli di anticorpi, sebbene il calo osservato nell’ultimo contenitore (105–115 giorni PSO), che non era potente come gli altri contenitori, dovrà essere studiato più da vicino.

Gli anticorpi contro gli antigeni SARS-CoV-2 vengono rilevati nella saliva dei pazienti COVID-19

Sebbene i nostri test basati sul siero siano scalabili e robusti, la saliva rappresenta un biofluido relativamente inesplorato per la rilevazione di anticorpi contro gli antigeni SARS-CoV-2 con molti vantaggi pratici, tra cui l’essere non invasivi e la capacità di auto-raccolta a casa. Lo svantaggio della saliva come biofluido è la sua bassissima concentrazione di anticorpi (26), che rende necessario ottimizzare la sensibilità di rilevamento.

Abbiamo esplorato vari modelli di test e abbiamo scoperto che per ottenere rapporti segnale-rumore affidabili era necessario catturare spike biotinilati e antigeni RBD su piastre rivestite di streptavidina (piuttosto che adsorbire proteine ​​non biotinilate direttamente sulle piastre ELISA). Questo metodo richiedeva anche che la saliva fosse pre-adsorbita per rimuovere qualsiasi proteina legante la streptavidina. Mentre il calore (65 ° C per 30 min) ha impedito il rilevamento di anticorpi nella saliva, il trattamento dei campioni di saliva con Triton X-100 è stato compatibile con il nostro test (Figura S4) e ha provocato l’inattivazione virale (Tabella S2).

Sostenuti da questi risultati, abbiamo prima eseguito un esperimento pilota, utilizzando campioni di saliva espettorata acquisiti durante la fase iniziale della pandemia, misurando i livelli di anticorpi contro gli antigeni SARS-CoV-2 in n = 54 pazienti COVID-19 (coorte 1), confrontandoli con controlli negativi non esposti raccolti localmente (n = 42).

Poiché questi campioni sono stati diluiti a vari livelli, abbiamo normalizzato i valori in IgG / IgA totali (a seconda del dosaggio dell’isotipo) o in livelli di albumina come fatto in precedenza da altri (27). La media, la deviazione standard e l’intervallo di concentrazione di IgA e IgG totali dei pazienti COVID-19 erano 60,2 ± 99,2 μg / ml (4,6 μg / ml – 656,9 μg / ml) e 25,5 ± 47,7 μg / ml (2,5 μg / ml – 275,1 μg / ml), rispettivamente. La media, la deviazione standard e l’intervallo di concentrazione di IgA e IgG totali dai controlli negativi non esposti erano 89,3 ± 72,7 μg / ml (7,0 μg / ml – 452,9 μg / ml) e 7,0 ± 7,8 μg / ml (2,4 μg / ml – 48,8 μg / ml), rispettivamente.

La media, la deviazione standard e l’intervallo di concentrazione dell’albumina nei pazienti COVID-19 e nei controlli negativi non esposti erano 9,6 ± 8,1 μg / ml (1,3 μg / ml – 32,6 μg / ml) e 9,3 ± 9,4 μg / ml (1,2 μg / ml – 45,8 μg / ml), rispettivamente. I campioni di saliva dei pazienti COVID-19 hanno mostrato un livello significativamente più alto di livelli di IgG e IgA per spike e RBD rispetto ai controlli negativi quando normalizzati con entrambi i metodi (Figura S5).

Dopo questo esperimento pilota, abbiamo proceduto con ulteriori raccolte di saliva utilizzando Salivettes® per standardizzare il nostro metodo di raccolta senza utilizzare un diluente (coorte 2) per misurare i livelli di IgG, IgA e IgM sia per gli antigeni spike che per quelli RBD. Nella coorte 2, abbiamo ottenuto n = 90 campioni da 80 pazienti che variavano nel tempo PSO dal giorno 3-104. Questi sono stati confrontati con 50 controlli negativi non esposti per la coorte 2, di cui 42 erano anche controlli negativi per la coorte 1. A questi controlli negativi, abbiamo anche aggiunto campioni di saliva dell’era pre-COVID come comparatore aggiuntivo (n = 27).

I nostri test antigeni avevano un volume di lavoro di 50 μl in ciascun pozzetto e in questi test abbiamo misurato gli anticorpi anti-spike e anti-RBD nei campioni a tre diluizioni: 1/5, 1/10 e 1/20. In ogni piastra sperimentale, abbiamo eseguito un controllo positivo (pool di saliva da diversi pazienti COVID-19) e un controllo negativo (pool di saliva da soggetti non esposti) anche piastrati a 1/5, 1/10 e 1/20. Abbiamo misurato l’area sotto la curva di ogni campione ed eseguito una normalizzazione dei controlli interni della piastra come mostrato nella Figura S6.

Abbiamo riportato i valori normalizzati come percentuale del controllo positivo (indicato come “punteggio integrato”). Sebbene non ci siamo normalizzati ai livelli totali di Ig nella coorte 2, abbiamo comunque misurato i livelli di Ig nella saliva dei pazienti COVID-19 e dei controlli negativi. Il volume di lavoro di questi esperimenti era di 50 μl e per ciascun campione sono state eseguite diverse serie di diluizioni, a seconda dell’isotipo dell’anticorpo misurato, per determinare al meglio le concentrazioni totali di IgA / M / G.

I livelli totali di IgG, ma non i livelli di IgA o IgM, sono risultati più alti nei pazienti COVID-19 rispetto ai controlli (Fig. 4A-C). Inoltre, la coorte 2 ha mostrato differenze statisticamente significative tra i livelli relativi di anticorpi IgG, IgA e IgM specifici per antigeni spike e RBD rispetto alla saliva dei controlli negativi (Fig. 4D-I).

La sensibilità dei test della saliva per gli anticorpi IgG a spike e RBD (con un tasso di falsa scoperta <2%) era rispettivamente dell’89% e dell’85%, mentre la sensibilità dei test per gli anticorpi IgA a spike e RBD era del 51% e 30 %, rispettivamente, e la sensibilità dei dosaggi per gli anticorpi IgM a spike e RBD erano rispettivamente del 57% e del 33%. (Figura S7 e Tabella S3).

La sensibilità inferiore dei test IgA è attribuita in parte ai livelli più elevati di IgA anti-spike e anti-RBD nei controlli negativi (vedere Discussione).

Successivamente, abbiamo esaminato i livelli di anticorpi anti-spike e anti-RBD nella nostra coorte trasversale nel tempo PSO. Analogamente ai dati sierici, i livelli di IgG nella saliva per il picco e gli antigeni RBD sono rimasti stabili per tutto il periodo di raccolta di 3 mesi. Al contrario, sono state osservate riduzioni significative per i livelli di IgA a picco e RBD (ρ = -0,307 e ρ = -0,300, rispettivamente) e risultati simili sono stati osservati per i livelli di IgM a picco e RBD (ρ = -0,33 e ρ = -0,32 , rispettivamente). Al giorno 100, i livelli di IgA e IgM anti-spike e anti-RBD erano appena rilevabili (Fig. 5). In sintesi, l’infezione da SARS-CoV-2 produce risposte IgG, IgA e IgM rilevabili nella saliva contro gli antigeni spike e RBD, con solo la risposta IgG che persiste oltre il giorno 60.

I livelli di anticorpi contro gli antigeni SARS-CoV-2 nel siero sono correlati a quelli nella saliva

Come accennato, la saliva ha molti vantaggi per la raccolta di biofluidi rispetto al siero. Per valutare se la saliva potesse essere utilizzata in modo affidabile in un test diagnostico, abbiamo determinato se i livelli di anticorpi per il picco e RBD nella saliva fossero correlati con quelli misurati nel siero. Dei pazienti COVID-19 analizzati, n = 71 avevano campioni accoppiati di saliva e siero prelevati in tempi simili (cioè entro 4 giorni).

Abbiamo osservato una significativa correlazione positiva tra saliva e siero per ciascuna combinazione antigene-anticorpo (Fig. 6; i valori sono riportati su scale logaritmiche; vedere la legenda per i dettagli). Le correlazioni per IgG anti-RBD e anti-spike (ρ = 0,71, ρ = 0,54) e IgM anti-RBD e anti-spike (ρ = 0,65, ρ = 0,58) erano più forti di quelle per i livelli di siero e saliva anti -RBD e anti-spike IgA (ρ = 0,39 e ρ = 0,54 rispettivamente).

Pertanto, almeno per le misurazioni di IgM anti-spike e IgG anti-RBD, la saliva può rappresentare una buona alternativa per il test degli anticorpi.

DISCUSSIONE

Gli anticorpi sono componenti chiave nell’arsenale dell’immunità protettiva contro nuove infezioni virali come SARS-CoV-2. Comprendere la loro durata e la loro compartimentazione del sistema in una popolazione diversificata sono dati critici che informano la nostra capacità di monitorare la sieroprevalenza nelle comunità, selezionare donatori di plasma per il trattamento e progettare vaccini contro COVID-19.

Abbiamo esaminato la stabilità dei livelli di anticorpi nei primi tre mesi dopo l’infezione sia nel siero che nella saliva. Non abbiamo osservato un drastico calo dei livelli di IgG anti-picco, anti-RBD o anti-NP per un periodo di 3 mesi. Lo stesso valeva per le misurazioni antigene-specifiche nella saliva (anti-spike e anti-RBD IgG).

D’altra parte, analogamente ad altri risultati (28, 29), le risposte IgA e IgM agli antigeni SARS-CoV-2 sono diminuite sia nel siero che nella saliva.

In sintesi, i nostri dati mostrano che una risposta IgG durevole contro gli antigeni SARS-CoV-2 è generata sia nella saliva che nel siero nella maggior parte dei pazienti con COVID-19.

Dei tre isotipi misurati, la risposta IgA correla il minimo tra siero e saliva, in particolare per l’antigene RBD.

Ciò potrebbe suggerire una qualche compartimentazione della risposta IgA nella cavità orale rispetto alla periferia.

Data la presenza di SARS-CoV-2 RNA nella saliva, è ragionevole ipotizzare che, come altri virus come la rosolia (26), 229E alfa-coronavirus (30) e MERS beta-coronavirus (31), le mucose e i linfonodi drenanti del tratto oro e nasofaringeo fungono da sito per l’inizio di una risposta immunitaria a SARS-CoV-2.

In tal caso, le plasmacellule (PC) che producono anticorpi contro SARS-CoV-2 migreranno indietro verso le mucose oro- e nasofaringee e produrranno anticorpi che dovrebbero essere rilevabili nella saliva, un fluido che ha già alti livelli di IgA (32 ). Con il tempo, questa risposta verrà rilevata nella circolazione sistemica, probabilmente a causa della migrazione del PC in nuove nicchie come abbiamo precedentemente descritto nei topi (33).

In effetti, noi e altri due gruppi abbiamo osservato anticorpi specifici per SARS-CoV-2 nella saliva (34, 35). Ci sono alcune variazioni tra i protocolli di studio che è importante considerare: Randad et al. ha applicato un pennello sul bordo gengivale come mezzo per catturare le IgG dal sangue, ha inattivato questo materiale con il calore ed eseguito analisi immunologiche multiplex degli anticorpi utilizzando la tecnologia Luminex per rilevare i livelli di anticorpi specifici dell’antigene (35).

Al contrario, la nostra strategia è stata quella di raccogliere la saliva in un modo che si avvicini al meglio alla risposta immunitaria che ha luogo nella mucosa locale. In questo modo, il nostro studio assomiglia di più a quello di Faustini et al., Che hanno utilizzato la tecnologia ELISA su tutta la saliva, amplificando il segnale con un ulteriore passaggio anticorpale (34).

Sebbene Faustini et al. abbiamo impiegato diluizioni di saliva nello stesso intervallo di quello che abbiamo usato (da 1: 5 a 1:20), il grado di correlazione tra il siero e la saliva per ciascuna coppia di anticorpi / antigeni ELISA era meno evidente in quello studio che nel nostro (34). Se queste discrepanze sono metodologiche (cioè, rilevamento di Ig specifiche rispetto a quelle totali) e / o si riferiscono al maggior numero di soggetti asintomatici nel documento Faustini et al. lo studio resta da definire.

Mentre la specificità dei test della saliva era molto buona per le risposte IgG anti-spike e anti-RBD basate sulle curve ROC, questo era meno vero per IgA, in particolare la risposta IgA anti-RBD. Questo perché alcuni dei nostri controlli negativi, indipendentemente dal fatto che siano stati raccolti durante la pandemia (negativi non esposti) o prima della pandemia, mostrano livelli di IgA anti-RBD che si avvicinano al 50% della saliva di controllo aggregata (vedi Fig. 4H) .

Non è chiaro il motivo per cui ciò si verifichi solo per la combinazione IgA / RBD. Presumibilmente si tratta di IgA cross-reattive che si legano a SARS-CoV-2 RBD. Di interesse, finora gli anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 sembrano avere un’ipermutazione somatica limitata (36, 37), suggerendo che possano provenire da un repertorio naïve o da cellule B che sono state attivate in risposte extrafollicolari dove l’ipermutazione somatica è limitata.

Si è tentati di ipotizzare che questi anticorpi IgA preesistenti possano fornire una protezione tampone contro SARS-CoV-2 nella cavità orale e, in tal caso, è essenziale accertare la loro specificità antigenica originale. È necessario un lavoro futuro per confermare questi risultati in una più ampia gamma di soggetti e utilizzando diverse fonti di antigene RBD.

I nostri risultati secondo cui la risposta IgG agli antigeni SARS-CoV-2 è stabile per un periodo di 3 mesi sono coerenti con altri studi che hanno ugualmente notato la durevolezza nella risposta IgG al trimero spike (8-13). Questi dati ei nostri contrastano con quelli di Long et al., Che hanno mostrato un rapido decadimento dei livelli di anticorpi durante la definizione del profilo della risposta a un motivo peptidico lineare della parte C-terminale della proteina spike (14) invece del trimero spike usato qui, ed è possibile che la selezione dell’antigene tenga conto di alcune differenze.

Tuttavia, questo non spiega risultati discrepanti rispetto alla risposta anti-NP nel siero, che troviamo anche ampiamente persistita nel periodo di 3 mesi. Una potenziale differenza che potrebbe spiegare questi risultati divergenti è che abbiamo impiegato un ELISA sensibile e robusto basato su piastra di chemiluminescenza, mentre Long et al. hanno utilizzato kit immunoenzimatici a chemiluminescenza magnetica con antigeni peptidici o ricombinanti immobilizzati.

Un limite del nostro studio è che non abbiamo guardato oltre il giorno 115 PSO – le nostre raccolte sono iniziate a metà marzo 2020 – ed è del tutto plausibile che i livelli di IgG antigene-specifici alla fine diminuiranno con il tempo. Sebbene gli anticorpi IgG anti-picco siano rimasti abbastanza stabili, anche al giorno 115 PSO, il nostro saggio di neutralizzazione surrogata ha rivelato un calo dell’attività nell’ultimo intervallo di tempo (giorni 116-115 PSO), coerente con alcuni studi precedenti (9, 13, 14) .

Questo intervallo di raccolta finale non è ben alimentato come gli altri contenitori, quindi questo richiede ulteriori indagini. Tuttavia, un calo dell’attività di neutralizzazione utilizzando il test surrogato rispecchia la significativa riduzione delle IgA (e IgM) antigene-specifiche. Resta da valutare il contributo di questi isotipi all’attività di neutralizzazione complessiva in diversi momenti dopo l’infezione.

Infatti, l’IgA è un importante mediatore della protezione contro i virus gastrointestinali (38), è essenziale per ottenere l’immunità contro i virus aviari (39), ha dimostrato di contribuire alla risposta dell’anticorpo neutralizzante (nAb) a SARS-CoV-2 (28) e può anche essere un isotipo nAb più potente dell’IgG (40).

Inoltre, è stato riscontrato che un anticorpo monoclonale clonato da cellule B derivate da topi umanizzati infettati da SARS-CoV fornisce un’attività neutralizzante cross-reattiva a SARS-CoV-2 quando ingegnerizzato sulla spina dorsale IgA, e questa attività neutralizzante è stata ulteriormente potenziata se il L’IgA è stata co-espressa con la catena J per produrre IgA dimerica e la componente secretoria per produrre IgA secretoria – la forma di IgA che viene secreta sulle superfici mucose (41).

Sebbene Sterlin et al. mostrano che la risposta iniziale del plasmablast IgA diminuisce rapidamente, le plasmacellule produttrici di IgA hanno dimostrato di persistere per decenni nelle mucose intestinali degli esseri umani (42), e queste non saranno facilmente misurabili nel sangue. Infatti, abbiamo scoperto che di tutti e 3 gli isotipi misurati, i livelli di IgA specifici per l’antigene nella saliva mostravano la più scarsa correlazione con i livelli di IgA specifici per l’antigene nel siero.

Quando combinato con la formazione parallela di cellule B della memoria riattivabili (43), molte delle quali risiedono nei tessuti (25), l’ospite ha meccanismi eccellenti per il montaggio di un’immunità umorale rapida e robusta alla riesposizione del patogeno che può essere mancato utilizzando misurazioni basate sul sangue. Uno studio epidemiologico che segue prospetticamente i casi di COVID-19 confermati per diversi mesi determinerà se questi principi immunologici sono veri nel contesto dell’infezione da SARS-CoV-2.

In conclusione, il nostro studio fornisce la prova che la risposta IgG al picco di SARS-CoV-2 persiste nella saliva e nel siero e che questa risposta può essere correlata tra i due biofluidi, in particolare per le IgG. Dato che il virus può anche essere misurato nella saliva mediante PCR (16-19), l’uso della saliva come biofluido per le misurazioni sia del virus che degli anticorpi può avere qualche valore diagnostico.

Poiché SARS-CoV-2 inizialmente si replica nei tratti oro e rinofaringeo, in futuro sarà fondamentale caratterizzare la natura e la cinetica degli anticorpi salivari nei primi momenti post-infezione in individui tracciati per contatto al fine di determinare se ci sono correlati di protezione che influenzano il setpoint virale e la progressione della malattia COVID-19.

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More information: Gemma Moncunill et al, SARS-CoV-2 seroprevalence and antibody kinetics among health care workers in a Spanish hospital after three months of follow-up, The Journal of Infectious Diseases (2020). DOI: 10.1093/infdis/jiaa696