Covid-19: tamponi anali come campione potenzialmente ottimale per il rilevamento di SARS-CoV-2

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Da dicembre 2019, un’epidemia di polmonite atipica causata dal coronavirus 2 della SARS (SARS-CoV-2) ha portato a una grave epidemia in Cina e in altri paesi.

Le analisi filogenetiche dei genomi del coronavirus hanno rivelato che SARS-CoV-2 appartiene al genere Betacoronavirus, una classe di virus ssRNA di senso positivo che possono causare infezioni respiratorie, intestinali, del fegato e del sistema nervoso negli animali e nell’uomo [1].

SARS-CoV-2 è composto da quattro proteine ​​strutturali, note come proteine ​​S (spike), E (busta), M (membrana) e N (nucleocapside) e possiede l’82% di identità a SARS-CoV e il 50% di identità a Coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) basato sul sequenziamento del genoma [2]. Inoltre, si diffonde per trasmissione da uomo a uomo tramite goccioline o contatto diretto e si stima che l’infezione abbia un periodo di incubazione medio di 6,4 giorni e un numero di riproduzione di base di 2,24-3,58 [3].

Numerosi studi retrospettivi hanno indicato che le manifestazioni cliniche prevalenti dei pazienti COVID-19 sono febbre, tosse secca e dispnea [4]; sintomi meno comuni presenti come produzione di espettorato, mal di testa e alcuni sintomi gastrointestinali; inoltre, è stato scoperto un numero crescente di pazienti con infezione asintomatica [5-7].

Secondo le ultime linee guida per la diagnosi e il trattamento della polmonite causata da 2019-nCoV (versione di prova 7) pubblicate dalla Commissione sanitaria nazionale della Repubblica popolare cinese [8], la diagnosi di COVID-19 deve essere confermata dalla trascrittasi inversa -PCR (RT-PCR) o sequenziamento genico.

Attualmente, vari campioni biologici di COVID-19 vengono utilizzati per la rilevazione di SARS-CoV-2 e i tamponi nasofaringei del tratto respiratorio superiore sono il tipo di campione più comune. Tuttavia, prove crescenti hanno rivelato un rilevamento positivo degli acidi nucleici nei tamponi anali di pazienti con COVID-19, sebbene il tasso di positività sia basso [9,10].

Uno studio precedente ha mostrato un test RT-PCR positivo su tamponi faringei di pazienti guariti da COVID-19 [11], portando a conflitti con i criteri attuali [8].

Qui, abbiamo riportato casi clinicamente curati con solo risultati positivi nei tamponi anali, che è in conflitto con i criteri attuali per il rilascio di persone dalla quarantena, e abbiamo ulteriormente studiato il valore clinico dei tamponi anali per il rilevamento della SARS-CoV-2.

Proponiamo i tamponi anali come campione potenzialmente ottimale per il rilevamento di SARS-CoV-2 per la valutazione della dimissione ospedaliera di pazienti COVID-19.

Discussione
Da dicembre 2019, lo scoppio di COVID-2019 causato da SARA-CoV-2 è diventato un problema sanitario globale [15]. La SARS-CoV-2 si è rapidamente diffusa in Cina e in tutti i continenti tranne l’Antartide [16-19] e ha causato oltre 3,5 milioni di casi confermati con 24.000 decessi (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus- 2019 / rapporti sulla situazione).

Finora, l’origine del coronavirus rimane poco chiara. L’ultimo rapporto ha scoperto che il genoma del pangolino-CoV mostrava un’identità nucleotidica del 91,02% con il genoma SARS-CoV, il che ha suggerito che le specie di pangolino sono un serbatoio naturale di CoV simili a SARS-CoV-2 [20].

Il rilevamento molecolare rimane il gold standard per la diagnosi. Come metodo consigliato, RT-PCR è ampiamente utilizzato per rilevare SARS-CoV-2. Ad oggi, i tamponi faringei, espettorati e anali sono stati considerati applicabili per il rilevamento della RT-PCR. Le prove hanno dimostrato che il tipo di campione gioca un ruolo critico nel rilevamento di SARS-CoV-2.

L’RNA virale può essere facilmente rilevato in campioni rinofaringei, di espettorato e di feci [21], e i tassi di positività più elevati sono stati rilevati in campioni di espettorato e lavaggio broncoalveolare [22]. Tuttavia, il decorso dell’infezione da SARS-CoV-2 rimane poco chiaro.

In quanto recettore cellulare per SARS-CoV-2, l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) è la chiave affinché SARS-CoV entri nelle cellule bersaglio durante il corso dell’infezione virale [23-25]. L’espressione della proteina ACE2 negli organi umani ha mostrato che l’ACE2 è espresso in modo più abbondante sulla superficie delle cellule epiteliali alveolari e delle cellule epiteliali dell’intestino tenue [26], che sono coinvolte nella progressione della polmonite [27]. Curiosamente, può esistere una connessione tra i polmoni e il tratto gastrointestinale [28] e SARS-CoV-2 può essere trasmesso attraverso molteplici vie nelle diverse fasi dell’infezione virale.

In questo studio, abbiamo scoperto che il rilevamento di SARS-CoV-2 era positivo nei tamponi anali ma negativo in altri tipi di campioni di pochi pazienti guariti, il che sfida gli standard attuali per la dimissione e la fine dell’isolamento obbligatorio per i pazienti COVID-19.

Simile ai pazienti SARS-CoV e MERS-CoV [29,30], è stata osservata un’infezione intestinale nelle fasi successive dell’infezione, indicando che il tempo di eliminazione di SARS-CoV-2 nel tratto digerente era successivo a quello nel tratto respiratorio . In particolare, i sintomi gastrointestinali sono stati riscontrati nei bambini con COVID-19 [31].

Tuttavia, l’onere delle nuove infezioni da coronavirus è ancora sottovalutato; solo l’1% circa di tutti i casi confermati di SARS-CoV-2 coinvolge bambini secondo le stime attuali [32], quindi è necessario studiare più campioni e metodi biologici (ad esempio, rilevamento sierologico) per l’infezione da SARS-CoV-2 nei bambini.

In particolare, il virus SARS-CoV-2 vivo è stato isolato da campioni fecali in tre degli 11 pazienti adulti [33]. Pertanto, i tamponi anali potrebbero essere il campione ottimale per il rilevamento di SARS-CoV-2 per valutare la dimissione ospedaliera dei pazienti COVID-19. I pazienti con risultati fecali positivi richiedono un ulteriore isolamento fino a quando il virus non è completamente eliminato.

Sulla base delle conoscenze su questa specifica infezione virale e considerando il rilevamento prolungato dell’RNA virale nei tamponi anali [34] e l’RNA virale rilevabile nella coorte sanguigna che progredisce verso uno stadio di sintomo grave [35], abbiamo proposto il corso potenziale di infezione di SARS-CoV -2 come segue (Figura 3): infezione delle vie respiratorie superiori (principalmente da goccioline respiratorie); infezione delle vie respiratorie inferiori (presentata principalmente come infezione polmonare); formazione di viremia; e trasmissione ad altri organi (compreso il tratto GI) e colonizzazione tramite ACE2. Pertanto, è necessario scegliere diversi tipi di campione per il rilevamento di SARS-CoV-2 in varie fasi di infezione. Fortunatamente, Sethuraman et al. ha ideato una linea temporale clinicamente utile di marker diagnostici per la rilevazione di COVID-19 [36].

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Figura 3.
Potenziale corso di infezione di SARS-CoV-2 e dei diversi campioni per il rilevamento di SARS-CoV-2.
Innanzitutto, SARS-CoV-2 infetta il sistema respiratorio superiore principalmente da goccioline respiratorie (asintomatiche o febbre, tosse secca, affaticamento, mialgia e dispnea; risultati RT-PCR altamente positivi nei tamponi faringei). Successivamente, infetta il tratto respiratorio inferiore e si replica in modo massiccio (presentato principalmente come infezione polmonare; risultati altamente positivi della RT-PCR nei tamponi faringei e nell’espettorato). Inoltre, il virus viene rilasciato nel sangue, portando alla formazione di viremia (basso numero di copie rilevato nel sangue mediante RT-PCR). Infine, viene trasmesso ad altri organi, compreso il tratto gastrointestinale, e colonizza tramite ACE2 (tasso di rilevamento positivo più elevato nei tamponi anali).
ACE2: enzima di conversione dell’angiotensina 2; GI: gastrointestinale; RT-PCR: trascrittasi inversa-PCR.

In sintesi, abbiamo scoperto che il rilevamento di SARS-CoV-2 era positivo nei tamponi anali ma negativo in altri tipi di campioni di diversi pazienti guariti. I nostri risultati contribuiscono notevolmente a una comprensione completa di COVID-19. Sebbene lo studio fosse limitato a un piccolo numero di pazienti, ulteriori studi longitudinali su una coorte più ampia aiuterebbero a comprendere la prognosi della malattia.


La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus-2 (SARS-CoV-2), può portare a una malattia grave o critica ed è una pandemia globale [1,2]. Le manifestazioni cliniche di COVID-19 vanno da infezioni asintomatiche, infezioni del tratto respiratorio lievi, gravi o critiche, sintomi gastrointestinali e neurologici e morte [3-7]. Si stima che l’infezione da SARS-CoV-2 sia responsabile di circa il 20% dei casi gravi e di circa il 5% dei casi fatali tra gli individui infetti [2].

Per questa infezione mortale, si dovrebbe prestare molta attenzione alla diminuzione della mortalità nei casi gravi con terapie antivirali efficaci. È quindi di grande importanza determinare con precisione la cinetica della diffusione del virus e i siti di replicazione virale.

La presenza di RNA virale è stata segnalata in un’ampia gamma di tipi di campioni, inclusi ma non limitati a campioni respiratori, feci, urina e sangue [3,7]. Il rilevamento dell’RNA virale non solo fornisce una prova importante per la diagnosi clinica, ma riflette anche i siti di replicazione del virus e la carica dell’RNA virale è un parametro utile per identificare lo stato della replicazione e della clearance virale [7-9].

Pertanto, la quantificazione della carica virale nei pazienti è stata utilizzata per monitorare la progressione della malattia. Le correlazioni tra carica virale di RNA e sintomi clinici e risultati dei test di laboratorio hanno fornito indizi per prevedere la gravità della malattia. Ad esempio, i livelli di RNA virale negli aspirati nasofaringei e nel sangue erano correlati alla morte nei pazienti con infezione da SARS-CoV [10].

Nei pazienti COVID-19, le cariche virali nell’espettorato e nel sangue sono risultate correlate alla prognosi [7,11]. Tuttavia, gli studi più recenti hanno coinvolto pochi casi gravi e hanno utilizzato un unico tipo di campione. Se la carica virale nei campioni raccolti da diversi siti anatomici predice l’esito clinico nei pazienti gravi deve ancora essere studiato a fondo.

In un precedente rapporto, due coorti COVID-19 affette da infezioni gravi sono state reclutate per uno studio clinico (LOTUS) per determinare l’efficacia antivirale di lopinavir-ritonavir [8]. In questo studio, abbiamo quantificato longitudinalmente la carica virale in campioni consecutivi di tampone faringeo (TS) e tampone anale (AS) raccolti dalle coorti LOTUS per valutare la carica virale nei campioni raccolti da diversi siti anatomici e la loro associazione con gli esiti clinici nella COVID grave -19 pazienti. I nostri risultati suggeriscono che la replicazione virale nei siti extrapolmonari e la carica di RNA virale sono altamente correlati con l’esito avverso dei pazienti COVID-19.

Discussione
In questo studio, abbiamo analizzato il tasso positivo di RNA virale e la carica virale in campioni di TS e AS accoppiati raccolti consecutivamente da pazienti COVID-19 gravi ospedalizzati. Abbiamo scoperto che l’RNA virale poteva essere rilevato nei campioni TS e AS, ma i tassi di positività erano diversi (TS 33,4%, AS 20,9%).

Anche le cariche virali medie erano differenti tra i gruppi (TS 1,0 × 106 copie / ml, AS 2,3 × 105 copie / ml). Il tempo dall’insorgenza dei sintomi al rilevamento di RNA virale positivo nei campioni di AS è stato significativamente inferiore nei non sopravvissuti rispetto ai sopravvissuti (numero mediano di giorni di 14 vs 19). Il tasso di positività al virus e la carica virale nella AS nella settimana 2 dopo l’insorgenza dei sintomi erano significativamente più alti nei non sopravvissuti rispetto ai sopravvissuti.

Diversi gruppi hanno riportato il tasso di rilevamento di SARS-CoV-2 in diversi campioni di pazienti COVID-19 con diverse gravità della malattia. Tuttavia, i dati variano notevolmente tra gli studi [11,12,15]. Altri studi hanno riportato che i tassi medi di RNA virale positivo nei campioni di TS e di feci dei pazienti COVID-19 erano rispettivamente del 18,2% -62,5% e del 17,0% -26,7% [12,16].

Questi valori disparati possono essere attribuiti alla gravità della malattia incoerente, al tempo di campionamento, al numero di campione e al tipo utilizzati per valutare i tassi di rilevamento positivo virale negli studi. La carica virale TS tra le settimane non ha mostrato differenze significative PSO nel nostro studio, il che era coerente con lo studio di Zheng et al. [7]. Ma Wölfel et al.hanno considerato che c’erano differenze significative della carica virale della TS tra le settimane PSO [14]. La differenza tra i nostri risultati e quelli dei rapporti precedenti potrebbe essere correlata ai casi arruolati con diverse gravità della malattia.

Le rilevazioni di RNA virale nei campioni enterici erano simili a quelle nei pazienti con SARS, in cui il virus è stato isolato da campioni di feci, e un’elevata prevalenza di RNA virale è stata riscontrata nei campioni di feci [17,18]. Esperimenti di coltura di organoidi umani hanno dimostrato che la replicazione di SARS-CoV-2 nell’intestino è maggiore di quella nei polmoni [19,20].

L’espressione della proteina N è stata visualizzata nel citoplasma delle cellule epiteliali ghiandolari gastriche, duodenali e rettali, che hanno ulteriormente confermato la replicazione regionale di SARS-CoV-2 [21]. La presenza di RNA virale in diversi siti anatomici indica la posizione di replicazione e / o la via di trasmissione. È noto che il tratto respiratorio è il sito di replicazione iniziale di SARS-CoV-2.

La rilevazione dell’RNA virale nei campioni anali potrebbe essere il risultato della trasmissione del virus dal tratto respiratorio al tratto intestinale mediante deglutizione, della replicazione del virus all’interno degli organi extrapolmonari o dell’aumentata permeabilità intestinale durante la progressione della malattia. Tuttavia, nel nostro studio non abbiamo trovato alcuna correlazione della carica virale nella SA con i sintomi di infezione intestinale, sebbene diarrea e vomito siano stati riportati nei pazienti COVID-19 [15].

Per ottenere la prova della replicazione attiva del virus in assenza di istopatologia, abbiamo anche analizzato mRNA subgenomici virali in campioni clinici [14]. Ha dimostrato che gli mRNA subgenomici erano rilevabili sia nei campioni TS positivi all’RNA virale (35,6%) che nei campioni AS (13,9%) (Figura 1 supplementare).

I nostri dati sulla diffusione virale indicano anche il ruolo importante dell’intestino durante la progressione della malattia. Collettivamente, questi risultati sottolineano che la replicazione virale enterica e la trasmissione negli individui sono importanti predittori della gravità della malattia. I campioni enterici dovrebbero essere raccolti di routine per test virali per la diagnosi di COVID-19, così come lo sono per la diagnosi di SARS.

La carica virale riflette l’interazione dinamica tra replicazione virale e eliminazione del virus da parte delle attività immunitarie dell’ospite [18]. L’esame della carica virale nei pazienti con SARS e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) è stato utilizzato per prevedere la progressione della malattia [10,22].

Nella SARS, un’elevata carica virale nei campioni di sangue, feci e respiratori era correlata alla morte [10]. Nella MERS, la carica virale nel gruppo grave era maggiore di quella nel gruppo lieve, mentre il tempo e l’intensità di diffusione virale erano strettamente correlati alla SARS [22,23]. La carica virale nel tratto respiratorio è stata riportata positivamente collegata alla gravità della malattia polmonare nei pazienti COVID-19, indicando che è un predittore della gravità della malattia [24].

Nei nostri dati, la carica virale TS era superiore alla carica virale AS. Tuttavia, non abbiamo trovato correlazioni della carica virale TS con la morte nel nostro studio. Tale scoperta era coerente con il rapporto di Fajnzylber et al, in cui hanno reclutato pazienti COVID-19 gravi [25]. Le disparità potrebbero essere correlate alla gravità della malattia dei pazienti reclutati, al tempo di campionamento e al numero di campioni.

Solo la carica virale AS era significativamente più alta nei non sopravvissuti rispetto ai sopravvissuti, e la differenza è diventata significativa alla settimana 2 PSO, il che può indicare che la seconda settimana durante la progressione della malattia è un punto critico per determinare l’esito COVID-19. La presenza o l’assenza di un’infezione extrapolmonare alla settimana 2 indica se il sistema immunitario di un paziente è stato efficace nel prevenire la diffusione del virus, determinando in tal modo la possibilità di sopravvivenza del paziente.

Le rilevazioni di RNA virale e la carica virale in campioni accoppiati raccolti consecutivamente da pazienti hanno mostrato che la TS era positiva ad alte concentrazioni di RNA virale, seguita da AS da sopravvissuti e non sopravvissuti. Il tratto respiratorio che è il sito di replicazione principale di SARS-CoV-2 è stato supportato dall’elevata carica virale TS. L’RNA virale potrebbe essere rilevato prima nella TS rispetto all’AS e la TS aveva cariche virali più elevate rispetto all’AS sia nei sopravvissuti che nei non sopravvissuti.

L’espressione dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2), il recettore per SARS-CoV-2, è molto più alta nell’intestino tenue che nei polmoni [26-28]. Si ipotizza che in alcuni pazienti il ​​virus viaggi nell’intestino dopo l’infezione iniziale del sistema respiratorio e si replichi attivamente [29]; Lo “spillover” dell’RNA virale nel sangue predirebbe quindi esiti avversi. Il monitoraggio dei campioni enterici e di sangue sarebbe un modo specifico per monitorare la progressione della malattia.

Ci sono alcune limitazioni del nostro studio. Uno è che c’erano una mancanza di campioni dai primi 5 giorni e, come tale, non abbiamo potuto fornire una caratterizzazione dettagliata della cinetica della carica virale nella fase iniziale. Il secondo è che, sebbene AS e TS fossero raccolti contemporaneamente ogni 4-7 giorni fino alla dimissione o alla morte dei pazienti, non abbiamo continuato a monitorare i pazienti dopo la dimissione. Tuttavia, le conclusioni di questo studio non sarebbero influenzate.

Il terzo è che abbiamo analizzato la dinamica della positività dell’RNA virale e della carica virale con campioni prelevati da pazienti che hanno ricevuto antivirali, antibiotici, corticosteroidi e altri trattamenti, che potrebbero aver influenzato i modelli. Tuttavia, i nostri risultati possono aiutare a identificare quei pazienti con COVID-19 grave che potrebbero sperimentare la progressione della malattia.

In conclusione, sulla base dell’analisi di una quantità relativamente grande di campioni raccolti da pazienti con COVID-19 grave, abbiamo scoperto che un alto tasso di positività dell’RNA virale in AS, un’elevata carica virale in AS e un rilevamento precoce positivo in AS possono predisporre COVID -19 pazienti a esiti avversi. La somministrazione precoce di farmaci antivirali efficaci è fondamentale per il trattamento di COVID-19. La presenza di replicazione virale nei siti extrapolmonari predispone a esiti avversi e dovrebbe quindi essere monitorata attentamente.

link di riferimento: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2020.1858700


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