Il Dr. Kulasinghe, del QUT Centre for Genomics and Personalised Health and School of Biomedical Sciences, ha consegnato i risultati a uno speciale incontro virtuale dell’American Association of Cancer Research (AACR) su “COVID-19 and Cancer” all’inizio di questo mese.
Ha detto che i risultati del test potrebbero informare i medici quei pazienti che potrebbero sviluppare una grave infezione e richiedere un ventilatore quando si presentano per la prima volta e quindi differenziarli dai pazienti che potrebbero sperimentare un caso più delicato e che potrebbero tornare a casa e auto-isolarsi.
“Questo è estremamente importante per il triage dei pazienti quando gli ospedali sono vicini o oltre la capacità”, ha detto il Dott. Kulasinghe.
“Abbiamo utilizzato la profilazione trascritmica spaziale (una tecnica che consente ai ricercatori di mappare le interazioni e i geni da cellula a cellula) per studiare campioni polmonari di pazienti COVID-19 che erano morti.
“Questi approcci di biologia del profilo spaziale per comprendere tessuti complessi sono stati votati come metodo dell’anno nei metodi naturali del 2020.
“Abbiamo attinto alla nostra precedente esperienza nella profilazione spaziale del cancro ai polmoni per studiare covid-19 nei polmoni.
“Utilizzando l’imaging ad alta risoluzione e la profilazione genomica, siamo stati in grado di mappare la presenza del virus nei polmoni fino alle singole cellule presenti nel tessuto polmonare.
“Abbiamo scoperto una manciata di geni pro-infiammatori che sono stati upregolati (espressione più alta) nei casi di COVID-19 rispetto al virus pandemico più vicino, all’influenza suina o all’H1N1 e ai polmoni di persone sane.
“I geni pro-infiammatori, incluso uno chiamato ifi27, sono coinvolti nella risposta all’interferone di tipo 1, una risposta infiammatoria per difendere il corpo da virus e altri agenti patogeni.
“Il valore della misurazione di questo biomarcatore, ifi27, in un tampone nasale o in un campione di sangue è nel triaging dei pazienti perché può dirci quanto è grave la malattia COVID-19 non appena il paziente cerca aiuto medico con i sintomi covid.”
Il Dr. Kulasinghe ha detto che i ricercatori hanno misurato ifi27 in casi asintomatici, lievi, moderati e gravi di COVID-19.
“Abbiamo visto che ifi27 è elevato in modo step-wise con casi gravi con alti livelli ifi27.”
Il Dr. Kulasinghe ha detto che i ricercatori sapevano che ifi27 era elevato nel sangue dei pazienti covid-19.
“Ma non c’era stata alcuna prova di da dove proveniva il segnale per gli alti livelli ifi27.
“Profilando spaziale il tessuto polmonare dei pazienti covid-19 che erano morti, abbiamo avuto un quadro molto più approfondito dei cambiamenti cellulari guidati dall’infezione virale e che i polmoni erano una fonte dell’ifi27 allevato.
“Questa tecnica ci ha anche permesso di identificare a quali cellule nei polmoni il virus si legava.”
Questo progetto di ricerca collaborativa con l’University of Queensland Diamantina Institute e il Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research è stato premiato con l’Ausbiotech Johnson & Johnson Industry Excellence Collaboration Award e l’Industry Choice Award nel 2020.
“Spatial Profiling of Lung SARS-CoV-2 and Influenza Virus Infection Dissects Virus-Specific Host Responses and Gene Signatures” è pubblicato sul server di pre-stampa MedRxiv.
La grave sindrome respiratoria acuta coronavirus 2 (SARS-CoV-2) emersa alla fine del 2019 si è diffusa a livello globale, causando una pandemia di malattia respiratoria designata malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). I biomarcatori del sangue robusti che riflettono i danni ai tessuti sono urgentemente necessari per stratificare e tagliare meglio i pazienti infetti.
Qui, utilizziamo la trascritomica spaziale per generare un quadro approfondito del panorama trascrizionale polmonare di COVID-19 (10 pazienti), pandemia H1N1 (pH1N1) influenza (5) e pazienti con controllo non infettato (4). La trascrittomica ospite ha mostrato una significativa upregolazione dei geni associati all’infiammazione, alla produzione di interferone di tipo I, alla coagulazione e all’angiogenesi nei polmoni dei pazienti COVID-19 rispetto ai controlli non infetti.
Il SARS-CoV-2 era distribuito in modo non uniforme nei polmoni con poche aree ad alta carica virale e questi erano in gran parte associati solo ad una maggiore risposta all’interferone di tipo I. Un numero molto limitato di geni è stato espresso in modo differenziato tra i polmoni dei pazienti affetti da influenza e COVID-19.
Specifici geni associati all’interferone (incluso IFI27) sono stati identificati come nuovi biomarcatori candidati per covid-19 differenziando questo COVID-19 dall’influenza. Collettivamente, questi dati dimostrano che la trascritomica spaziale è un potente strumento per identificare nuove firme geniche all’interno dei tessuti, offrendo nuove intuizioni sulla patogenesi della SARS-COV-2 per aiutare nel triage e nel trattamento dei pazienti.
Il GRAVE COVID-19 è associato a un trascrittame differenziale limitato rispetto alla grave influenza
Solo un numero limitato di geni è stato identificato come espresso in modo differenziato tra campioni di influenza COVID-19 e pH1N1 (2 geni deregolamentati e 4 geni upregolati, Fig. 6). Dei sei geni significativamente regolati in modo differenziato nei campioni di COVID-19, tre sono stati associati alla risposta IFN di tipo I (LY6E, IFI27 e IFI6), due erano membri della famiglia di proteine da shock termico(HSPA6 & HSPA1A) e uno, CT45A1, se combinato con vari fattori di crescita, è associato alla sopravvivenza cellulare e alla tumorigenesi.
È interessante notare che tutti e tre i geni inducibili all’interferone sono stati anche significativamente upregolati nei campioni covid-19 rispetto a quelli senza infezione virale (Extended Data Table 7). Due membri della famiglia di proteine da shock termico (HSPA1A e HSPA) sono stati identificati come significativamente down-regulated nei tessuti COVID-19.
Queste due proteine sono state trovate significativamente upregolamentate nei tessuti pH1N1 rispetto ai tessuti non infetti (dati non mostrati), suggerendo una potenziale firma specifica dell’influenza. Insieme, questi dati indicano che il virus dell’influenza pH1N1 e il SARS-CoV-2 inducono solo trascrizioni polmonari ospiti sottilmente diverse, ma possono essere potenzialmente distinti da una firma immunitaria associata alla malattia del nucleo.
Discussione
Comprendere le funzioni biologiche, le reti e le interazioni ospite-patogeno che hanno un impatto sullo sviluppo di organi e malattie richiede sia informazioni cellulari che un contesto spaziale. Le analisi del sequenziamento dell’RNA sfuso o del sequenziamento dello scRNA forniscono una panoramica globale della risposta di un organo a un agente patogeno, in genere identificando ampie vie infiammatorie.
Tuttavia, tali approcci non riescono a identificare sottili cambiamenti cellulari individuali che sono spazialmente distinti. Ciò ha un impatto particolare quando si considerano cellule immunitarie innate e adattive che possono essere cruciali per comprendere le risposte specifiche dell’agente patogeno e per distinguere il profilo di un agente patogeno da un altro.
Al contrario, trascritti risolti spazialmente di tessuti infetti viralmente offre la possibilità di disinfettere le singole cellule infette, contributi di carica virale, risposte cellulari e quindi variabilità da paziente a paziente.
Lo spettro clinico del COVID-19 è altamente variabile. L’associazione della carica virale con la gravità della malattia fornirebbe un meccanismo per la stratificazione precoce dei pazienti per le opzioni di trattamento. Infatti, le analisi dei tamponi nasofaringei suggeriscono che l’RNA sars-cov-2 nasofaringeo è correlato in modo indipendente con la gravità della malattia16, simile alle osservazioni precedenti con SARS-CoV-117.
Tuttavia, l’associazione tra replicazione virale nel polmone e malattia grave rimane più complicata. Qui, abbiamo osservato che 8 pazienti su 10 morti a causa del COVID-19 non avevano RNA virale rilevabile nelle biopsie polmonari come determinato da RNAscope. L’analisi trascrittomica ha mostrato che le aree ad alta carica virale erano associate a una risposta IFN di tipo I pronunciata, coerente con altre analisi spaziali preliminari dei polmoni dei pazienti COVID-19 11 e presumendo a causa dell’aumento dei modelli molecolari associati agli agenti patogeni virali (PAMP) disponibili per la stimolazione IFN di tipo I. Tuttavia, anche in campioni in cui non è stato rilevato alcun RNA virale, una firma genica IFN di tipo I pronunciata poteva ancora essere osservata nel tessuto polmonare.
Queste osservazioni aggiungono peso alla crescente comprensione del ruolo tipo I IFN nelle infezioni SARS-CoV-218. Le prove attuali suggeriscono che un’induzione precoce e robusta degli interferoni di tipo I può aiutare a controllare la replicazione virale e aiutare a garantire un’infezione lieve.
Al contrario, un’induzione ritardata dell’IFN di tipo I (cioè dopo il picco di replicazione virale) è in gran parte irrilevante per il controllo virale in quanto le tette virali sono già diminuite a questo punto dell’infezione, ma possono aiutare a perpetuare la risposta pro-infiammatoria dannosa e il danno polmonare 18,19. I dati trascritomici qui presentati parlano così del ruolo sfumato delle IFN di tipo I nell’infezione da SARS-CoV-2.
L’analisi trascritomica polmonare è un potente strumento per delineare la patogenesi della SARS-CoV-2 e identificare come differisce rispetto ad altri agenti patogeni respiratori come il virus dell’influenza. Studi precedenti hanno suggerito che i polmoni dei pazienti covid-19 mostrano una maggiore incidenza di microtrombi capillari alveolari e trombosi con microangiopatia rispetto a quelli dei pazienti influenzali5.
Nel presente studio, i livelli di D-dimero sono stati elevati in sei pazienti covid-19 su dieci e sono state osservate alcune trombosi. Coerentemente con queste osservazioni, un precedente rapporto che utilizza analisi dell’RNA polmonare sfuso per identificare 69 geni correlati all’angiogenesi espressi in modo differenziato nei pazienti COVID-19, ma non nei pazienti affetti da influenza11.
Sorprendentemente, mentre abbiamo osservato che sia il COVID-19 che i pazienti influenzali avevano un’upregolazione dei geni associati alla coagulazione e all’angiogenesi, questi geni non erano espressi in modo differenziato tra i due gruppi di pazienti infetti da virus. Questi dati contrastanti indicano il ruolo complementare della profilazione del sangue, delle analisi spaziali sfuse e specifiche dei tessuti nella definizione dei parametri clinici per la terapia.
Il rilevamento accurato, la diagnosi tempestiva e un trattamento efficace sono tutti essenziali per la gestione del COVID-19 e saranno fondamentali per frenare la diffusione virale man mano che il numero di nuove infezioni aumenta ogni giorno. Sono stati esplorati diversi potenziali biomarcatori clinici e trascrittivi per il triaging dei pazienti con COVID-19.
I biomarcatori clinici includono proteina C-reattiva, amiloide siere A, interleuchina-6, lattato deidrogenasi, rapporto neutrofilo-linfocita, D-dimero, linfociti e conta piastrinica 20,21. Tuttavia, la maggior parte di questi studi si è concentrati sui biomarcatori nel sangue del paziente. Mentre i campioni di sangue periferico sono un sito conveniente e altamente accessibile per il campionamento clinico, questo non è il sito primario di infezione virale.
Pertanto, le informazioni delineate dalle analisi del sangue potrebbero non riflettere la gravità dei tessuti e quindi ostacolare la scoperta del biomarcatore. Inoltre, un biomarcatore che potrebbe essere rapidamente identificato nel tessuto respiratorio (ad esempio tramite un tampone nasale) può essere più accessibile in contesti di risorse basse rispetto a uno che richiede un campione di sangue. È interessante notare che precedenti analisi dell’IFI27 (interferone-alfa proteina inducibile 27) nel sangue dei pazienti covid-19 hanno rivelato che l’IFI27 era upregolato nell’infezione da SARS-CoV-22-24. Qui, abbiamo identificato l’IFI27 come differenziato upregolato nei polmoni sia dei pazienti COVID-19 vs pazienti di controllo che nell’insieme altamente ristretto di geni espressi in modo differenziato tra COVID-19 e pazienti influenzali.
IFI27 è stato precedentemente utilizzato come biomarcatore per differenziare con successo la polmonite batterica dall’infezione da virus influenzale25.
Questi dati sollevano l’eccitante possibilità che IFI27 possa non solo rappresentare un biomarcatore per covid-19 grave, ma che possa anche aiutare a differenziare questa malattia da altre infezioni virali clinicamente simili. Ciò diventa particolarmente importante in quanto la “seconda ondata” di COVID-19 negli Stati Uniti e in Europa è destinata a sovrapporsi alla stagione dell’influenza invernale. La convalida di questo gene in campioni nasali, così come le associazioni con la gravità della malattia saranno necessarie per confermare IFI27 come firma genica utile per stratificare i pazienti COVID-19.
Questo studio è stato soggetto a diverse importanti limitazioni. In primo luogo, tutti i dati sono stati ricavati da una piccola coorte di campioni provenienti da un singolo sito di studio e resta da determinare quanto questi dati possano essere estrapolati ad altre popolazioni di pazienti. Inoltre, sono necessari ulteriori studi in una gamma più ampia di pazienti (cioè quelli con malattia lieve e moderata) per determinare il valore terapeutico di uno qualsiasi dei biomarcatori di tessuto putativo identificati nel presente documento.
Tuttavia, nonostante queste limitazioni, questi dati rivelano il potere senza precedenti della profilazione spaziale combinato con analisi bioinformatiche multiparametriche dettagliate per sezionare le variabili chiave che contribuiscono all’espressione genica differenziale tra coorti di pazienti altamente variabili e alla distribuzione eterogenea del virus e della reattività immunitaria all’interno dei tessuti.
Questo studio ha anche dimostrato l’importanza di utilizzare la suite di strumenti di modellazione lineare disponibili in limma per interrogare la complessa progettazione di esperimenti multifattoriali in questo studio. In particolare, la capacità di Limma di modellare progetti sperimentali complessi e di implementare il prestito di informazioni tra i geni per gestire il numero relativamente piccolo di campioni nel pannello, lo rendono uno strumento di analisi altamente attraente per le tecniche di profilazione spaziale con pannelli genico mirati.
Il presente studio suggerisce che la profilazione spaziale presenterebbe molti vantaggi nell’analisi dei campioni di COVID-19 in diverse coorti di pazienti per identificare le firme di risposta fondamentali distinte dagli effetti di fondo. Questo lavoro ha quindi stabilito le basi per valutare coorti tissutali più grandi per valutare la relazione tra biomarcatori del sangue e dei tessuti, progressione della malattia, patologia e riparazione.
link di riferimento: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.11.04.20225557v1.full
Maggiori informazioni: Profilazione spaziale della SARS-CoV-2 polmonare e dell’infezione da virus influenzale seziona risposte host specifiche del virus e firme geniche, (2020). DOI: 10.1101/2020.11.04.20225557
