Covid-19: perché la mutazione D614G è più stabile ed in grado di diffondersi più velocemente?

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Le varianti di coronavirus in rapida diffusione nel Regno Unito, in Sud Africa e in Brasile stanno sollevando sia preoccupazioni che domande sul fatto che i vaccini COVID-19 proteggeranno da loro.

Un nuovo lavoro condotto da Bing Chen, Ph.D., presso il Boston Children’s Hospital ha analizzato come la struttura delle proteine ​​spike del coronavirus cambia con la mutazione D614G – trasportata da tutte e tre le varianti – e ha mostrato perché queste varianti sono in grado di diffondersi più rapidamente. Il team riporta i suoi risultati su Science (16 marzo 2021).

Il team di Chen ha ripreso i picchi con la microscopia crioelettronica (cryo-EM), che ha una risoluzione fino al livello atomico. Hanno scoperto che la mutazione D614G (sostituzione di una “lettera” di un singolo amminoacido nel codice genetico per la proteina spike) rende il picco più stabile rispetto al virus SARS-CoV-2 originale. Di conseguenza, sono disponibili picchi più funzionali per legarsi ai recettori ACE2 delle nostre cellule, rendendo il virus più contagioso.

Prevenire il cambiamento di forma delle punte

Nel coronavirus originale, le proteine ​​spike si legherebbero al recettore ACE2 e quindi cambierebbero drasticamente forma, ripiegandosi su se stesse. Ciò ha permesso al virus di fondere la sua membrana con le membrane delle nostre cellule e di entrare.

 Tuttavia, come hanno riferito Chen e colleghi nel luglio 2020, i picchi a volte cambiano forma prematuramente e cadono a pezzi prima che il virus possa legarsi alle cellule. Sebbene ciò abbia rallentato il virus, il cambiamento di forma ha anche reso più difficile per il nostro sistema immunitario contenere il virus.

Una proteina spike più robusta spiega la diffusione più rapida delle varianti di coronavirus
Questo modello mostra la struttura della proteina spike nella sua configurazione chiusa, nella sua forma originale D614 (a sinistra) e nella sua forma mutante (G614). Nella proteina spike mutante, il loop 630 (in rosso) stabilizza il picco, impedendogli di aprirsi prematuramente e rendendo SARS-CoV-2 più infettivo. Crediti: Bing Chen, PhD, Boston Children’s Hospital

“Poiché la proteina spike originale si sarebbe dissociata, non era abbastanza buona da indurre una forte risposta anticorpale neutralizzante”, afferma Chen.

Quando Chen e colleghi hanno ripreso la proteina spike mutante, hanno scoperto che la mutazione D614G stabilizza il picco bloccando il cambiamento prematuro di forma. È interessante notare che la mutazione rende anche i picchi si legano più debolmente al recettore ACE, ma il fatto che gli spike siano meno inclini a cadere a pezzi prematuramente rende il virus nel complesso più contagioso.

“Supponiamo che il virus originale abbia 100 picchi”, spiega Chen. “A causa dell’instabilità della forma, potresti avere solo il 50 percento di loro funzionali. Nelle varianti G614, potresti avere il 90% di funzionalità , quindi anche se non si legano allo stesso modo, è molto probabile che tu abbia un’infezione. “

Chen propone che i vaccini riprogettati incorporino il codice per questa proteina spike mutante. La forma più stabile del picco dovrebbe rendere qualsiasi vaccino basato sul picco (come il vaccino Moderna, Pfizer e Johnson & Johnson) più propensi a suscitare anticorpi neutralizzanti protettivi, dice.

Direzione futura: un farmaco per bloccare l’ingresso del coronavirus

Chen ei suoi colleghi stanno applicando ulteriormente la biologia strutturale per capire meglio come SARS-CoV-2 si lega al recettore ACE2, con un occhio alle terapie per impedire al virus di entrare nelle nostre cellule.

A gennaio, il team ha mostrato in Nature Structural & Molecular Biology che una proteina ACE2 “esca” strutturalmente progettata lega il virus 200 volte più fortemente dell’ACE2 del corpo. L’esca ha inibito potentemente il virus nella coltura cellulare, suggerendo che potrebbe essere un trattamento anti-COVID-19. Chen sta ora progettando di portare avanti questa ricerca sui modelli animali.


Una nuova variante del virus SARS-CoV-2 che trasporta una mutazione puntiforme nella proteina Spike (D614G) è recentemente emersa e ha rapidamente superato le altre in prevalenza. Questa mutazione è in linkage disequilibrium con una variante della proteina ORF1b (P314L), rendendo difficile discernere il significato funzionale della mutazione Spike D614G dalla sola genetica della popolazione. Qui, eseguiamo mutagenesi sito-diretta su Spike ottimizzato per codoni umani wild-type per introdurre la variante D614G.

Utilizzando più linee cellulari umane, comprese le cellule epiteliali polmonari umane, abbiamo scoperto che le particelle lentivirali pseudotipizzate con Spike D614G sono più efficaci nel trasdurre le cellule rispetto a quelle pseudotipate con Spike wild-type. L’aumentata trasduzione con Spike D614G variava da 1,3 a 2,4 volte nelle cellule Caco-2 e Calu-3 che esprimono ACE2 endogeno e da 1,5 a 7,7 volte in A549ACE2 e Huh7.5ACE2 con sovraespressione ACE2.

Inoltre, la trans-complementazione del virus SARS-CoV-2 con Spike D614G ha mostrato un’aumentata infettività nelle cellule umane. Sebbene vi sia una differenza minima nel legame del recettore ACE2 tra le varianti D614 e G614 Spike, la variante G614 è più resistente alla scissione proteolitica, suggerendo un possibile meccanismo per l’aumento della trasduzione.

Discussione
In sintesi, abbiamo dimostrato che la mutazione recente e ora dominante nella glicoproteina SARS-CoV-2 Spike D614G aumenta l’efficienza dell’ingresso cellulare del virus in un’ampia gamma di tipi di cellule umane, comprese le cellule del polmone, del fegato, e due punti. Abbiamo mostrato una maggiore efficienza di ingresso utilizzando sia un sistema modello lentivirale pseudotipato che un virus SARS-CoV-2 competente per la replicazione. 

Data la concordanza tra il sistema lentivirale pseudotipato e il virus SARS-CoV-2, ciò suggerisce che i cambiamenti nella proteina Spike sono ben rappresentati utilizzando lo pseudovirus, che dovrebbe consentire a un gruppo molto più ampio di laboratori di utilizzare e studiare varianti di Spike.

Abbiamo anche scoperto che G614 Spike è più resistente alla scissione proteolitica durante la produzione della proteina nelle cellule ospiti così come sulle particelle lentivirali pseudotipizzate, suggerendo che il virus replicato prodotto nelle cellule umane può essere più infettivo a causa di una maggiore proporzione di funzionale (non tagliato con dominio di legame al recettore) Proteina spike per virione.

In contrasto con un recente studio con il virus della leucemia murina con pseudotipo di Spike (Zhang et al., 2020), non abbiamo osservato una differenza nell’incorporazione di Spike in particelle lentivirali con la variante G614 rispetto alla variante D614, che è coerente con le osservazioni da altri gruppi (Ozono et al., 2020; Yurkovetskiy et al., 2020).

È ormai ben stabilito che SARS-CoV-2 Spike è processato proteoliticamente principalmente dalla furina; tuttavia, nuovi rapporti suggeriscono che G614 potrebbe essere elaborato anche da elastasi-2 (Hu et al., 2020). Sono necessarie ricerche future per confermare questi risultati e stabilire se Spike G614 viene elaborato proteoliticamente in modo diverso sul virus SARS-CoV-2 vivo.

Utilizzando l’interferometria biostrato con monomeri purificati di frammenti di SARS-CoV-2 Spike S1 e proteine ​​ACE2, non abbiamo trovato differenze significative nella cinetica di legame con il recettore ACE2 derivante dalla mutazione D614G. Yurkovetskiy e colleghi hanno riferito che, con trimeri a tutta lunghezza Spike purificati, la mutazione G614 sposta la conformazione della proteina Spike a uno stato competente di legame ACE2 (Yurkovetskiy et al., 2020), suggerendo che i trimeri a tutta lunghezza Spike si comportano in modo diverso rispetto agli Spike Monomeri S1 che abbiamo studiato in questo studio.

Diversi altri gruppi hanno anche riferito che il D614G determina una maggiore idoneità virale e l’efficienza dell’infezione (Hu et al., 2020; Jiang et al., 2020; Li et al., 2020; Ozono et al., 2020; Plante et al. , 2020; Yurkovetskiy et al., 2020; Zhang et al., 2020). La maggior parte di loro ha utilizzato particelle virali con pseudotipizzazione di Spike per dimostrare questa scoperta. Sebbene sia opinione comune che la mutazione Spike G614 aumenti la forma fisica e l’infettività virale, il meccanismo con cui si manifesta varia tra questi studi.

Molti di questi studi hanno esaminato l’elaborazione proteolitica, l’incorporazione e lo stato di conformazione di legame ACE2 della proteina Spike, con alcune discrepanze tra loro per quanto riguarda l’elaborazione proteolitica e l’incorporazione di Spike. Ciò può essere spiegato, almeno in parte, dalle differenze tecniche nei protocolli utilizzati per generare le particelle virali con pseudotipizzazione Spike.

Ad esempio, gli studi utilizzano un’ampia varietà di sistemi pseudovirali, come il virus della leucemia murina (Zhang et al., 2020), il virus del sarcoma del topo (Jiang et al., 2020) e il lentivirus (il nostro studio e Yurkovetskiy et al., 2020). Sebbene tutti e quattro gli studi abbiano utilizzato cellule HEK293 per generare le particelle, ognuno ha utilizzato metodi di trasfezione diversi ed è possibile che i reagenti di trasfezione possano influenzare negativamente lo stato cellulare e l’attività della proteasi.

Due studi che hanno utilizzato le varianti isogeniche SARS-CoV-2 D614 e G614 non hanno riscontrato differenze nella scissione e nell’incorporazione della proteina Spike nelle particelle virali (Hou et al., 2020; Plante et al., 2020). Le differenze nella biologia Spike tra pseudovirus isogenici e virus SARS-CoV-2 possono essere dovute a differenze nell’assemblaggio e nella presentazione del trimero proteico Spike, nonché all’assenza / presenza di ulteriori proteine ​​SARS-CoV-2. Nel complesso, queste differenze illustrano i vantaggi e i limiti dell’utilizzo di pseudovirus e virus isogenici che dovrebbero essere presi in considerazione in studi futuri.

Nonostante il consenso emergente che il G614 si traduca in una diffusione virale più rapida (Korber et al., 2020), è ancora incerto se ciò avrà un impatto clinico sulla progressione della malattia COVID-19. Due studi che hanno esaminato le potenziali differenze nella gravità clinica o nei tassi di ospedalizzazione non hanno visto una correlazione con lo stato di mutazione di Spike (Korber et al., 2020; Wagner et al., 2020), sebbene uno studio abbia trovato un arricchimento piccolo ma non significativo di G614 mutazioni tra i pazienti in unità di terapia intensiva (Korber et al., 2020).

Dato il suo rapido aumento degli isolati umani e la migliore trasduzione attraverso un ampio spettro di tipi di cellule umane, la variante G614 e altre varianti recenti meritano un’attenta considerazione da parte dei ricercatori biomedici che lavorano su terapie candidate, come quelle per modulare le proteasi cellulari, e sui vaccini che forniscono Spike D614 acidi nucleici o peptidi.

link di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7891930/


Ulteriori informazioni:  Jun Zhang et al. Impatto strutturale sulla proteina spike SARS-CoV-2 mediante sostituzione D614G,  Science  (2021). DOI: 10.1126 / science.abf2303

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