Covid-19: il nuovo vaccino per inalazione PIV5 previene malattie e trasmissione

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In un nuovo studio che valuta il potenziale di un vaccino COVID-19 intranasale monodose, un team dell’Università dell’Iowa e dell’Università della Georgia ha scoperto che il vaccino protegge completamente i topi dall’infezione letale da COVID-19.

Il vaccino blocca anche la trasmissione del virus da animale ad animale. I risultati sono stati pubblicati il ​​2 luglio sulla rivista Science Advances.

“I vaccini attualmente disponibili contro il COVID-19 hanno molto successo, ma la maggior parte della popolazione mondiale non è ancora vaccinata e c’è un bisogno critico di più vaccini che siano facili da usare ed efficaci nel fermare la malattia e la trasmissione”, afferma Paul McCray, MD, professore di pediatria-medicina polmonare e microbiologia e immunologia presso l’UI Carver College of Medicine e co-leader dello studio.

“Se questo nuovo vaccino COVID-19 si dimostra efficace nelle persone, può aiutare a bloccare la trasmissione di SARS-CoV-2 e aiutare a controllare la pandemia di COVID-19”.

A differenza dei vaccini tradizionali che richiedono un’iniezione, questo vaccino viene somministrato attraverso uno spray nasale simile a quelli comunemente usati per vaccinare contro l’influenza. Il vaccino utilizzato nello studio richiede solo una singola dose e può essere conservato a temperature di frigorifero normali per un massimo di tre mesi.

Poiché viene somministrato per via intranasale, il vaccino può anche essere più facile da somministrare, soprattutto per coloro che hanno paura degli aghi.

“Sviluppiamo questa piattaforma di vaccini da più di 20 anni e abbiamo iniziato a lavorare su nuove formulazioni di vaccini per combattere il COVID-19 durante i primi giorni della pandemia “, afferma Biao He, Ph.D., professore all’Università. del Dipartimento di Malattie Infettive della Georgia presso il College of Veterinary Medicine e co-leader dello studio.

“I nostri dati preclinici mostrano che questo vaccino non solo protegge dalle infezioni, ma riduce anche significativamente le possibilità di trasmissione”.

Il vaccino sperimentale utilizza un innocuo virus parainfluenzale 5 (PIV5) per fornire la proteina spike SARS-CoV-2 nelle cellule dove richiede una risposta immunitaria che protegge dall’infezione da COVID-19. PIV5 è correlato ai comuni virus del raffreddore e infetta facilmente diversi mammiferi, compreso l’uomo, senza causare malattie significative.

Il team di ricerca ha precedentemente dimostrato che questa piattaforma vaccinale può proteggere completamente gli animali da esperimento da un’altra pericolosa malattia da coronavirus chiamata sindrome respiratoria mediorientale (MERS).

Il vaccino per inalazione PIV5 sviluppato dal team prende di mira le cellule della mucosa che rivestono i passaggi nasali e le vie aeree. Queste cellule sono il principale punto di ingresso per la maggior parte delle infezioni da SARS-CoV-2 e il sito della replicazione precoce del virus. Il virus prodotto in queste cellule può invadere più in profondità i polmoni e altri organi del corpo, il che può portare a malattie più gravi. Inoltre, il virus prodotto in queste cellule può essere facilmente diffuso attraverso l’espirazione consentendo la trasmissione da una persona infetta ad altre.

Lo studio ha dimostrato che il vaccino produceva una risposta immunitaria localizzata, che coinvolgeva anticorpi e immunità cellulare, che proteggeva completamente i topi da dosi fatali di SARS-CoV-2.

Il vaccino ha anche prevenuto infezioni e malattie nei furetti e, soprattutto, sembrava bloccare la trasmissione di COVID-19 dai furetti infetti ai loro compagni di gabbia non protetti e non infetti.


La sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) è emersa come una malattia significativa nella penisola dell’Arabia Saudita a metà del 2012 e l’agente eziologico è stato identificato come un nuovo coronavirus (CoV), MERS-CoV (1). La MERS ha un alto tasso di mortalità (∼35%) associato a gravi malattie polmonari che possono evolvere in sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). MERS-CoV, analogamente a SARS-CoV, che ha causato un’epidemia simile nel 2003, è stato motivo di preoccupazione globale a causa del suo alto tasso di mortalità.

Studi epidemiologici hanno stabilito che MERS-CoV è di origine zoonotica, con trasmissione che si verifica da cammelli dromedari nella penisola arabica (2-4). È documentata la diffusione dai cammelli alle persone (5), così come la diffusione da persona a persona tra gli operatori sanitari in ambito ospedaliero (6). Ad oggi, MERS-CoV si è diffuso in 27 paesi e ha causato 858 decessi in 2.494 casi confermati (4 febbraio 2020, Organizzazione mondiale della sanità [OMS]), incluso un grande focolaio correlato ai viaggi in Corea del Sud nel 2015 (7).

MERS-CoV è un virus a RNA a filamento positivo con involucro il cui ingresso nelle cellule bersaglio è mediato dalla proteina S dell’involucro virale. La proteina S è costituita da una subunità S1 responsabile del legame al recettore del virus, la dipeptidil peptidasi 4 (DPP4 o CD26), tramite un dominio di legame al recettore (RBD) e una subunità S2 che media la fusione della membrana (8-10). Pertanto, la proteina S, in particolare l’RBD, è un obiettivo importante per lo sviluppo del vaccino MERS-CoV (8, 11, 12).

Attualmente non esiste un vaccino o una terapia antivirale contro MERS-CoV. Sono in fase di sviluppo numerosi vaccini MERS-CoV candidati, inclusi quelli basati su virus ricombinante, vettori virali (ad es. MVA, adenovirus e virus del morbillo), nanoparticelle, DNA e DNA/proteine, nonché vaccini a subunità (12 , 13). Nessuno è approvato; quindi, rimane la necessità di un vaccino efficace e ad ampio spettro contro l’infezione da MERS-CoV (14).

PIV5, precedentemente noto come virus delle scimmie 5 (SV5), è un virus a RNA non segmentato, a filamento negativo (NNSV). È un membro del genere Rubulavirus della famiglia Paramyxoviridae, che comprende il virus della parotite (MuV) e il virus della parainfluenza umana di tipo 2 (HPIV2) e di tipo 4 (HPIV4) (15). PIV5 codifica otto proteine ​​virali note (15).

La proteina nucleocapside (NP), la fosfoproteina (P) e la grande proteina RNA polimerasi (L) sono importanti per la trascrizione e la replicazione del genoma dell’RNA virale. PIV5 è un eccellente vettore virale candidato per lo sviluppo di vaccini; è sicuro e infetta un gran numero di mammiferi senza essere associato ad alcuna malattia, ad eccezione della tosse dei canili nei cani (16-20).

Poiché PIV5 non ha una fase del DNA nel suo ciclo di vita, il suo utilizzo evita le possibili conseguenze indesiderate di modificazioni genetiche del DNA della cellula ospite attraverso la ricombinazione o l’inserimento. Rispetto ai virus a RNA a filamento positivo, la struttura del genoma di PIV5 è stabile. È stato generato un PIV5 ricombinante che esprime F del virus respiratorio sinciziale (RSV) e il gene F è stato mantenuto per più di 10 generazioni (21).

PIV5 può essere coltivato fino a 8 × 108 PFU/ml, indicando il suo potenziale come vettore di vaccino sicuro e conveniente che può essere utilizzato nella produzione di massa. Abbiamo scoperto che i vaccini contro l’influenza, il virus respiratorio sinciziale (RSV) e la rabbia basati su PIV5 sono efficaci (22-28).

Negli studi sull’influenza, abbiamo precedentemente riportato che un vettore PIV5 che esprime il virus dell’influenza NA ha fornito un’immunità sterilizzante (nessuna mortalità, nessuna morbilità e nessun virus rilevato nei polmoni di topi sfidati a 4 giorni dopo la sfida) e PIV5 che esprime NP ha protetto il 100% di topi contro il virus dell’influenza letale H1N1 challenge nei topi (25), dimostrando che PIV5 è un eccellente vettore per lo sviluppo di vaccini per patogeni respiratori. Qui indaghiamo sull’utilità di un vaccino basato su PIV5 che esprime la proteina MERS S in un robusto modello murino umanizzato di infezione letale da MERS-CoV.

DISCUSSIONE

Sono state prese in considerazione molte strategie per sviluppare vaccini sia per SARS-CoV che per MERS-CoV. Un SARS-CoV vivo attenuato con mutazioni introdotte razionalmente è stato efficace nei criceti siriani dorati (30). Tuttavia, lo sviluppo di un vaccino vivo attenuato per un virus a RNA a filamento positivo come SARS-CoV è stato spesso ostacolato da problemi di sicurezza. Diversi candidati al vaccino MERS sono sotto inchiesta.

Un vaccino a base di DNA che esprima la proteina S a lunghezza intera è il più avanzato fino ad oggi (31); è ben tollerato nell’uomo, come dimostrato in uno studio clinico di fase I. Il regime prime-boost di MVA (Modified Vaccinia Ankara) che esprime la proteina MERS S ha indotto anticorpi neutralizzanti e risposte delle cellule T nei topi e ha limitato la replicazione virale dopo la stimolazione nei topi e nei cammelli. Tuttavia, MVA-S non ha fornito immunità sterilizzante e MERS-CoV infettivo e RNA genomico sono stati rilevati dopo la stimolazione in topi e cammelli (32, 33).

Il regime di potenziamento del virus del morbillo (MV) che esprime MERS S o S solubile ha indotto risposte immunitarie sia umorali che cellulari. Dopo la sfida MERS, MERS-CoV infettivo o RNA genomico è diminuito significativamente, ma questi due vaccini non hanno fornito un’immunità sterilizzante e sono stati osservati segni di infiammazione nel tessuto polmonare del topo (34).

Un virus della rabbia inattivato (RABV) che esprime MERS S1 ha fornito una protezione completa dal challenge MERS nei topi, ma erano necessarie tre dosi di vaccino da 10 μg (35). Inoltre, il modello murino trasdotto da Ad5/hDPP4 utilizzato in questi studi presenta dei limiti. Anche l’adenovirus (Ad5) che esprime MERS S o S1 ha indotto un anticorpo neutralizzante nei topi (36).

Ad41, un adenovirus enterico, può indurre una maggiore immunità della mucosa quando somministrato per via orale o intragastrica (ig) (37, 38). Tuttavia, l’immunizzazione ig di Ad41-S e Ad5-S non è riuscita a generare l’immunità della mucosa. Sebbene Ad41-S inducesse l’immunità umorale nel siero, era significativamente inferiore a Ad5-S (39).

Sono stati utilizzati anche sistemi vettoriali basati su adenovirus di scimpanzé (40). Nel nostro lavoro, abbiamo dimostrato che una singola dose a partire da 104 PFU di PIV5-MERS-S era sufficiente per fornire una protezione del 100% contro la letale sfida MERS-CoV. La dose bassa è particolarmente vantaggiosa in una situazione in cui è necessario un programma di immunizzazione di massa in un breve periodo di tempo. Per quanto ne sappiamo, questo è il vaccino MERS-CoV più efficace testato in un modello animale rilevante.

Il meccanismo protettivo del vaccino PIV5-MERS-S nei topi C57BL/6 è probabilmente dovuto a robuste risposte immunitarie cellulari dopo l’immunizzazione PIV5-MERS-S. Mentre l’anticorpo neutralizzante è stato generato nei topi C57BL/6 dopo un’immunizzazione a dose singola con PIV5-MERS-S, i titoli erano modesti rispettivamente a 1:64 e 1:128 con 104 PFU e 106 PFU di PIV5-MERS-S (Fig. .2A e B).

Coerentemente con le risposte immunitarie cellulari protettive che proteggono i topi, è stato rilevato un afflusso significativo di cellule CD8+ IFN-γ+ nei polmoni dei topi C57BL/6 dopo l’immunizzazione PIV5-MERS-S (Fig. 3). Inoltre, l’osservazione che i topi immunizzati con PIV5-MERS-S avevano un tasso più elevato di clearance del virus MERS (Fig. 4C) suggerisce un ruolo per l’immunità basata sulle cellule T nella protezione dei topi C57BL/6 dalla sfida letale.

È interessante notare che nei topi BALB/c, PIV5-MERS-S ha generato titoli anticorpali neutralizzanti fino a 1: 2.000 (Fig. 2C). È possibile che i titoli anticorpali neutralizzanti più elevati nei topi BALB/c possano essere protettivi. Sfortunatamente, l’unico modello di piccolo animale disponibile è un modello di topo umanizzato sullo sfondo C57BL/6.

È noto che la proteina S è un importante antigene protettivo per i coronavirus. Potrebbe essere possibile migliorare l’efficacia del nostro vaccino esprimendo ulteriori proteine ​​MERS-CoV come N e M utilizzando PIV5 come vettore. Tuttavia, un candidato al vaccino SARS-CoV basato sul virus parainfluenzale 3 (PIV3) che esprime N, M o E senza la proteina S non è riuscito a proteggere i criceti dalla sfida SARS-CoV (41).

La capacità di PIV5-MERS-S di generare risposte immunitarie cellulari e umorali nei topi può essere in parte attribuita alla capacità di PIV5 di esprimere la proteina MERS S nella sua conformazione nativa. Come mostrato in Fig. 1C, PIV5-MERS-S ha causato una massiccia formazione di sincizio nelle cellule Vero, indicando che la proteina S era funzionale nel promuovere la fusione cellula-cellula. Pertanto, abbiamo ragionato sul fatto che la proteina S prodotta nelle cellule infettate da PIV5-MERS-S mantiene una conformazione nativa.

La proteina MERS S ha 1.353 residui di amminoacidi. L’intero inserimento del gene S con sequenze regolatorie appropriate è lungo oltre 4.000 nucleotidi. Questo è il singolo gene più lungo che abbiamo inserito nel genoma di PIV5. Poiché abbiamo inserito questo gene tra SH e HN e il gene SH non è essenziale, potrebbe essere possibile rimuovere SH per consentire l’inserimento di sequenze più lunghe. Pertanto, ipotizziamo che il genoma PIV5 possa ospitare sequenze più lunghe di 4.000 nucleotidi

È stato riportato che i topi immunizzati SARS-CoV inattivati ​​hanno generato una patologia polmonare di tipo ipersensibile dopo la sfida del virus, sollevando la preoccupazione per la malattia potenziata dal vaccino (42, 43). In precedenza, un vaccino contro il virus respiratorio sinciziale (RSV) inattivato con formalina causava un aumento della malattia nei bambini vaccinati, portando a decessi correlati al vaccino (44). Allo stesso modo, è stato riportato che MERS-CoV inattivato genera un’immunopatologia di tipo Th2 dopo la stimolazione con MERS-CoV nei topi (29).

Nel caso di un vaccino RSV basato su PIV5, studi approfonditi indicano che il vaccino RSV basato su PIV5 non causa malattie aggravate (45). Pertanto, come vettore virale, PIV5 non è noto per causare malattie potenziate e, nel nostro esperimento, non abbiamo osservato risposte immunitarie anormali nei topi immunizzati con PIV5-MERS-S dopo la sfida MERS-CoV, suggerendo che PIV5-MERS-S è improbabile che sia associato a una malattia avanzata.

I tessuti polmonari di topi immunizzati con MERS-CoV inattivato hanno avuto un afflusso di eosinofili dopo la stimolazione con MERS-CoV, indicativo di una risposta di tipo ipersensibilità. Questo risultato è coerente con un precedente rapporto secondo cui l’immunizzazione MERS-CoV inattivata ha causato un aumento dell’espressione di IL-4 e IL-5 e un afflusso di eosinofili nei polmoni dopo la stimolazione (29).

Capire se l’immunizzazione con MERS-CoV inattivato può causare un aumento della malattia è fondamentale per lo sviluppo di un vaccino sicuro ed efficace.
Sebbene MERS-CoV abbia un’elevata morbilità e mortalità, ha una prevalenza molto bassa nelle popolazioni umane. I cammelli dromedari sono considerati l’ospite intermedio che trasmette MERS-CoV all’uomo. Pertanto, potrebbe essere possibile controllare la diffusione di MERS-CoV negli esseri umani controllando l’infezione nei cammelli dromedari. Forse la trasmissione del virus dai cammelli all’uomo può essere bloccata, con l’immunizzazione concomitante delle popolazioni umane ad alto rischio, come proposto da CEPI (The Coalition for Epidemic Preparedness Innovations) e dall’OMS.

Come vettore del vaccino, PIV5 è stato efficace in topi, ratti di cotone, criceti, porcellini d’India, furetti, cani e primati non umani (25, 46-49). In futuro varrà la pena testare PIV5-MERS-S sui cammelli.

Recentemente, SARS-CoV-2 (2019-nCoV) è stato identificato a Wuhan, in Cina, alla fine del 2019. Si tratta di un nuovo CoV zoonotico correlato al SARS-CoV che può causare gravi malattie respiratorie (COVID-19). Ad oggi, questo virus ha provocato un carico di malattia significativo, con oltre 465.000 casi segnalati in 199 paesi e un tasso di mortalità stimato di circa il 2%.

La scoperta che PIV5 esprimendo MERS S proteggeva i topi contro la sfida letale di MERS-CoV a una singola dose bassa di 104 PFU suggerisce il suo potenziale uso come vettore di vaccino per virus emergenti come SARS-CoV-2. Sono in corso ulteriori studi sull’utilizzo di PIV5 che esprime la proteina S da SARS-CoV-2 come candidato al vaccino.

link di riferimento: https://journals.asm.org/doi/10.1128/mBio.00554-20


Maggiori informazioni:  Dong An et al, Protezione di topi e furetti K18-hACE2 contro la sfida SARS-CoV-2 mediante un’immunizzazione della mucosa monodose con un vaccino COVID-19 a base di virus parainfluenzale 5,  Science Advances  (2021). DOI: 10.1126/sciadv.abi5246

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