I risultati sono pubblicati oggi sulla rivista Neurochemistry International.
Gli oli essenziali (EO) sono miscele di composti volatili estratti dalle piante. Sono utilizzati in aromaterapia perché possono essere rilasciati nell’aria e inalati a temperatura ambiente. Gli EO inalati vengono prontamente assorbiti nel cervello, che è distinto dai bioattivi negli alimenti vegetali che vengono mangiati.
Tuttavia, nonostante i forti potenziali benefici per la salute umana e in particolare per la salute del cervello, l’utilizzo di EO non è realmente ottimizzato per il tipo o la dose. Ciò significa che gli EO vengono utilizzati in aromaterapia, senza una buona comprensione di quali siano i migliori per particolari benefici. Fino ad ora, non era chiaro quali tipi o quale dose avrebbero prodotto il beneficio ottimale.
“Tuttavia, per ottenere benefici è necessario comprendere quali tipi sono i migliori e quale dose è necessaria”, ha affermato.
“Riteniamo che l’interazione degli oli essenziali con i livelli naturalmente elevati di ascorbato (ad esempio la vitamina C) nel cervello possa produrre effetti antiossidanti o pro-ossidanti. Sono gli effetti antiossidanti, ma non pro-ossidanti, che portano al beneficio dell’umore”, ha affermato il professor Bennett.
“Per la prima volta, questo lavoro apre la strada alla selezione e alla classificazione degli EO in base alle loro proprietà meccanicistiche e allo sviluppo di terapie potenzialmente economiche ma efficaci per il cervello”, ha affermato il professor Bennett.
Lo studio del professor Bennett e Ph.D. il candidato Minoli Aponso è stato in grado di identificare quali EO andranno a beneficio del miglioramento dell’umore e, in alternativa, quali produrranno proprietà anti-infettive.
“Stiamo lavorando allo sviluppo di EO per una serie di applicazioni, tra cui: trattamento di depressione e ansia, infezioni, infiammazioni e potenzialmente anche cancro”, ha affermato il professor Bennett.
I ricercatori stanno anche lavorando per comprendere la dose necessaria per ottenere effetti benefici.
“Possiamo prevedere la ‘dose’ volatile e potenzialmente inalabile di qualsiasi EO ea qualsiasi temperatura, compresi gli estremi climatici”, ha affermato Minoli.
“Questa ricerca rappresenta una svolta significativa in quanto caratterizza gli effetti degli EO nel cervello in modo da ottimizzarne il potenziale terapeutico”.
Un olio essenziale è definito internazionalmente come il prodotto ottenuto per idrodistillazione, distillazione in corrente di vapore o distillazione a secco o mediante un opportuno processo meccanico senza riscaldamento (per gli Agrumi) di una pianta o di alcune parti di essa [1]. Sono liquidi oleosi aromatici, volatili, caratterizzati da un odore forte, raramente colorati, e generalmente con una densità inferiore a quella dell’acqua. Possono essere sintetizzati da tutti gli organi della pianta (fiori, gemme, semi, foglie, ramoscelli, corteccia, erbe, legno, frutti e radici) e quindi estratti da queste parti, dove vengono immagazzinati in cellule secretorie, cavità, canali, cellule epidermiche o tricomi ghiandolari [2,3]. Gli oli essenziali rappresentano solo una piccola frazione della composizione della pianta; tuttavia conferiscono le caratteristiche per cui le piante aromatiche vengono utilizzate nell’industria alimentare, cosmetica e farmaceutica [4].
Le proporzioni dei componenti presenti negli oli essenziali variano notevolmente. I componenti principali possono costituire fino all’85% degli oli essenziali, mentre i componenti rimanenti possono essere presenti solo in tracce [5]. L’aroma di ciascun olio risulta dalla combinazione degli aromi di tutti i componenti e anche i costituenti minori dell’olio possono avere ruoli organolettici importanti da svolgere [6].
Oltre alle tecniche di estrazione sopra riportate ve ne sono altre che possono essere utilizzate per l’estrazione della frazione volatile, tuttavia questa non può essere definita in quei casi “olio essenziale”. Tali tecniche includono: distillazione sotto vuoto, estrazione con solvente combinata off-line con distillazione, distillazione-estrazione simultanea (SDE), estrazione con fluido supercritico (SFE) ed estrazione e idrodistillazione assistita da microonde (MAE e MA-HD), statica (S- HS), campionamento dinamico (D-HS) e spazio di testa ad alta capacità di concentrazione (HCC-HS) [1]. Questi autori spiegano in modo sintetico come operano tutte queste tecniche.
Gli oli essenziali hanno una composizione complessa, contenente da una dozzina a diverse centinaia di componenti. La grande maggioranza dei componenti identificati negli oli essenziali comprende i terpeni (ossigenati e non), con prevalenza di monoterpeni e sesquiterpeni. Tuttavia, anche gli allil- e propenilfenoli (fenilpropanoidi) sono componenti importanti di alcuni oli essenziali [7].
La gascromatografia capillare è la tecnica di scelta per l’analisi degli oli essenziali a causa della volatilità e della polarità dei componenti dell’olio essenziale, combinando due fasi stazionarie a polarità diversa. L’identificazione dei componenti dell’olio viene generalmente eseguita mediante dati cromatografici (indici di Kováts, indici di ritenzione lineare, tempo di ritenzione relativo, bloccaggio del tempo di ritenzione) e/o dati spettrali, principalmente mediante spettrometria di massa (GC-MS), nonché altre tecniche riportate in un recente articolo di revisione [1].
La complessità degli oli essenziali rende ardua la quantificazione dei loro componenti. Secondo l’articolo di revisione [1] ci sono almeno quattro approcci ampiamente utilizzati: abbondanza percentuale relativa, abbondanza percentuale normalizzata standard interni, quantificazione “assoluta” o vera di uno o più componenti utilizzando standard interni e/o esterni e quantificazione mediante un metodo convalidato. Viene fornita una serie di applicazioni per ciascun approccio [8].
Dal punto di vista biogenetico, i terpenoidi e i fenilpropanoidi hanno diversi precursori metabolici primari e sono generati attraverso diverse vie biosintetiche. Le vie coinvolte nei terpenoidi sono la via mevalonato e indipendente dal mevalonato (deossixilulosio fosfato), mentre i fenilpropanoidi hanno origine attraverso la via dello shikimato [9,10]. Alcuni autori hanno esaminato le vie biosintetiche dei terpenoidi e dei fenilpropanoidi, rispettivamente, gli enzimi ei meccanismi enzimatici coinvolti e le informazioni sui geni che codificano per questi enzimi [9,10].
L’ingegneria genetica delle vie metaboliche ha dato alcuni risultati promettenti per migliorare la produzione di sostanze volatili. A tale scopo, batteri, lieviti e piante sono stati geneticamente modificati per la produzione di terpenoidi o volatili derivati dall’acido shikimico. In un recente articolo di revisione sono stati raccolti diversi risultati di diversi autori riguardanti la produzione di metaboliti volatili da parte di microrganismi transgenici e piante geneticamente modificate [11]. Alcuni autori hanno concluso che questo tipo di approccio potrebbe essere utilizzato con successo per generare livelli notevoli di terpenoidi. Tuttavia, l’ingegnerizzazione di alcune classi di questo gruppo di composti è piuttosto difficile poiché il pool di precursori terpenoidi potrebbe non essere sufficiente per la produzione di quantità sostanziali del composto desiderato [12].
In Natura, gli oli essenziali svolgono un ruolo importante nell’attrazione degli insetti per favorire la dispersione dei pollini e dei semi o per respingerne altri. Inoltre, gli oli essenziali possono anche agire come antibatterici, antivirali, antimicotici, insetticidi, erbicidi o avere effetti deterrenti contro gli erbivori riducendo il loro appetito per tali piante. Gli oli essenziali hanno anche un ruolo importante nella comunicazione allelopatica tra le piante [3,13]. L’individuazione di alcune di queste proprietà biologiche necessarie per la sopravvivenza delle piante è stata anche la base per la ricerca di proprietà simili per il combattimento di diversi microrganismi responsabili di alcune malattie infettive nell’uomo e negli animali. Questa ricerca intende rispondere alla crescente resistenza dei microbi patogeni agli antibiotici.
Reichling et al. (2009) [14] hanno raccolto i risultati più importanti sulle proprietà antibatteriche e antivirali degli oli essenziali pubblicati nell’ultimo decennio. In questa recensione, gli oli essenziali contro i batteri delle vie respiratorie, anti-Helicobacter pylori, anti-Mycoplasma pneumoniae; oli essenziali contro il virus del DNA: HSV1 (virus dell’herpes simplex), HSV-2, NDV (malattia di Newcastle); o virus RNA: SARS-Cov (coronavirus associato a sindrome respiratoria acuta grave) e virus Junin sono stati esaminati. Inoltre, gli oli essenziali si sono anche rivelati efficaci nell’inibire la crescita e la riduzione del numero di patogeni alimentari più gravi come Salmonella spp., E. coli O157:H7 e Listeria monocytogenes [2].
L’attività antiossidante degli oli essenziali è un’altra proprietà biologica di grande interesse perché possono preservare gli alimenti dagli effetti tossici degli ossidanti [15]. Inoltre, gli oli essenziali essendo anche in grado di eliminare i radicali liberi possono svolgere un ruolo importante nella prevenzione di alcune malattie come la disfunzione cerebrale, il cancro, le malattie cardiache e il declino del sistema immunitario. Prove crescenti hanno suggerito che queste malattie possono derivare da danni cellulari causati dai radicali liberi [16,17].
Se gli oli essenziali sono in grado di eliminare alcuni radicali liberi, possono anche agire come agenti antinfiammatori, perché una delle risposte infiammatorie è l’esplosione ossidativa che si verifica in diverse cellule (monociti, neutrofili, eosinofili e macrofagi). La fagocitosi dei batteri, che si verifica durante l’infiammazione, è accompagnata da un drammatico aumento del consumo di ossigeno con conseguente formazione del radicale anione superossido (O2•-) che viene rapidamente convertito in perossido di idrogeno (H2O2), spontaneamente o dall’enzima superossido dismutasi .
Il perossido di idrogeno può poi essere ridotto anche da ioni di metalli di transizione che generano il radicale idrossile (HO°), uno dei più forti agenti ossidanti in grado di reagire rapidamente con gli acidi grassi polinsaturi, determinando la produzione di radicali perossilici (ROO•). Il perossido di idrogeno può anche ossidare gli ioni alogenuro (Cl-) ad acido ipocloroso (HOCl), che è un forte ossidante che può reagire con le ammine producendo clorammine, alcune delle quali sono molto tossiche [18,19,20,21,22].
Questi radicali sono comunemente noti come ROS (specie reattive dell’ossigeno). Tuttavia e durante un processo infiammatorio si ha anche la generazione di altri radicali liberi denominati RNS (specie reattive dell’azoto). L’ossido nitrico (•NO) e l’anione perossinitrito (ONOO-) sono due esempi di questo tipo di radicali. L’ossido nitrico è prodotto in grandi quantità dalle sintasi inducibili dell’ossido nitrico (iNOS) nei macrofagi e nei neutrofili attivati durante le reazioni di difesa e immunologiche. Tuttavia questa specie reattiva può anche esercitare la sua tossicità generando l’anione perossinitrito dopo aver reagito con il radicale anione superossido [22,23,24,25].
Il perossinitrito è formato dai fagociti per uccidere i microrganismi invasori, tuttavia se in alte concentrazioni può ossidare diverse biomolecole dell’ospite per nitrazione con i conseguenti danni cellulari responsabili di diverse malattie [26].
ROS e RNS sono generati nei fagociti per neutralizzare gli organismi invasori, avendo quindi un ruolo importante nel meccanismo di difesa dell’ospite. Tuttavia, la loro sovrapproduzione può essere responsabile di danni ai siti infiammatori. Inoltre, queste specie reattive svolgono ruoli importanti nell’infiammazione essendo elementi scatenanti o segnalando molecole messaggere.
ROS e RNS agiscono come modulatori di proteine e lipidi chinasi e fosfatasi, recettori di membrana, canali ionici e fattori di trascrizione, incluso il fattore nucleare-κB (NF-κB), che regolano l’espressione delle citochine chiave [22]. Questa breve recensione riporta il potenziale degli oli essenziali come antiossidanti e agenti antinfiammatori, nonché i meccanismi in vitro coinvolti in tali proprietà.
Come agisce un antiossidante?
Gli antiossidanti possono agire come barriere fisiche per impedire la generazione di ROS o l’accesso dei ROS a importanti siti biologici (filtri UV, membrane cellulari); trappole/pozzetti chimici che “assorbono” energia ed elettroni, spegnendo i ROS (carotenoidi, antocianidine); sistemi catalitici che neutralizzano o deviano i ROS [enzimi antiossidanti SOD (superossido dismutasi), catalasi e glutatione perossidasi]; legame/inattivazione di ioni metallici per prevenire la generazione di ROS (ferritina, ceruloplasmina, catechine); e antiossidanti che rompono la catena che eliminano e distruggono i ROS (acido ascorbico, tocoferoli, acido urico, glutatione, flavonoidi) [27].
Pertanto, e in base alla loro modalità di azione, gli antiossidanti possono essere classificati come primari, secondari o co-antiossidanti. Gli antiossidanti primari sono in grado di donare rapidamente un atomo di idrogeno a un radicale lipidico, formando un nuovo radicale, più stabile. Gli antiossidanti secondari reagiscono con i radicali iniziatori (o inibiscono gli enzimi iniziatori), o riducono il livello di ossigeno (senza generare specie radicaliche reattive).
Pertanto, questi antiossidanti secondari possono ritardare la velocità della reazione di iniziazione dei radicali mediante l’eliminazione degli iniziatori. Ciò può essere effettuato disattivando specie ad alta energia (ossigeno singoletto); assorbendo la luce UV; lavaggio dell’ossigeno; metallo chelante che catalizza la reazione dei radicali liberi, o enzimi inibitori, come perossidasi, NADPH ossidasi, xantina ossidasi, tra gli altri enzimi ossidativi [28].
Sono stati applicati metodi diretti e indiretti per determinare l’attività antiossidante di rottura della catena dei prodotti naturali. I metodi diretti si basano sullo studio dell’effetto di un prodotto testato (es. cibo) contenente antiossidanti sulla degradazione ossidativa di un sistema di prova. Il substrato dell’ossidazione può essere costituito da singoli lipidi, miscele lipidiche (oli), proteine, DNA, plasma sanguigno, LDL e membrane biologiche. Possono essere utilizzati lipidi omogenei o sistemi microeterogenei (micelle e liposomi) a seconda della solubilità dei campioni. Il metodo indiretto studia la capacità dell’antiossidante di eliminare alcuni radicali liberi, che non è associata alla vera degradazione ossidativa [29].
Nei metodi diretti, possono basarsi sulla cinetica della perossidazione lipidica o sulla cinetica del processo non a catena (metodi di competizione diretta). Nel primo caso si possono utilizzare due modalità di perossidazione lipidica per testare l’attività antiossidante: una di queste è la modalità di autossidazione quando il processo procede spontaneamente, con autoaccelerazione dovuta all’accumulo di LOOH; l’altra modalità si basa sull’utilizzo del modello cinetico della reazione a catena controllata.
L’utilizzo di azocomposti termo-labili [2,2′-azobis(2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH) e 2,2′-azobis(2,4-dimetilvaleronitrile) (AMVN) solubile in lipidi] che decompongono e producono radicali liberi attivi a temperature moderate a qualsiasi velocità desiderata, che possono essere facilmente alterati e controllati sono due buoni esempi molto usati [29]. Quando questi azocomposti termolabili non vengono utilizzati, e per accelerare l’ossidazione dei lipidi, aumenta la pressione e la temperatura parziali dell’ossigeno; aggiunta di catalizzatori di metalli di transizione; esposizione alla luce; e possono essere utilizzate fonti variabili di scuotimento e radicali liberi [5].
Esistono due metodi molto diffusi per monitorare la perossidazione lipidica: la determinazione dei dieni coniugati (assorbanza a 234 nm) e il saggio TBARS (sostanze reattive all’acido tiobarbiturico). Questo metodo misura la malonaldeide formata dopo la decomposizione dell’idroperossido lipidico, che forma un cromoforo rosa con acido tiobarbiturico (TBA). Tuttavia, TBARS è rappresentativo di uno stadio piuttosto avanzato dell’ossidazione lipidica, quando il substrato di ossidazione ha subito una trasformazione sostanziale [29].
Esistono altri metodi, tra cui la determinazione del numero di perossidi, del numero di iodio, la misurazione cromatografica dei composti volatili, la misurazione dell’acido formico [il metodo Rancimat in un test automatizzato che misura la conduttività degli acidi grassi a basso peso molecolare (acido formico) prodotti durante l’auto -ossidazione dei lipidi a 100 ºC o superiore] [5].
Nei metodi di competizione diretta, gli antiossidanti naturali competono per il radicale perossilico con uno scavenger di radicali liberi di riferimento. Esempi di scavenger di radicali liberi di riferimento includono la proteina naturale fluorescente R-ficoeritrina e la crocina naturale, o fluoresceina, che competono con il campione antiossidante per i radicali perossilici formati. Questi radicali possono essere prodotti mediante l’aggiunta di AAPH o AMVA. Questo è il principio del cosiddetto protocollo ORAC (capacità di assorbimento dei radicali dell’ossigeno). Un altro esempio è lo sbiancamento del β-carotene durante l’autossidazione dell’acido linoleico o in una reazione a catena controllata utilizzando un iniziatore a radicali liberi: AAPH [29].
Esempi di radicali liberi che non sono associati alla vera degradazione ossidativa (metodo indiretto) sono il 2,2′-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-solfonato) (ABTS) o il 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH), entrambi con colore diverso a seconda dello stato redox. Un altro esempio di metodo indiretto si basa sulla riduzione di Fe3+ a Fe2+, in presenza di 2,4,6-tripridil-s-triazina. Questo metodo è noto come FRAP (potere antiossidante riducente ferrico). Esistono anche metodi basati sulla chemiluminescenza del luminale in presenza di radicali liberi, che possono essere prodotti tramite AAPH [29].
Oltre ai metodi per determinare l’attività antiossidante di rottura della catena, esistono anche i restanti metodi per valutare la capacità di scavenging di altri radicali liberi come superossido, idrossile, ossido nitrico, perossinitrito o per chelazione di metalli (antiossidanti secondari). Molti metodi sono stati sviluppati e compilati in recenti articoli di revisione, essendo anche in alcuni di essi riportati i vantaggi e gli svantaggi di tali metodi [27,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41]. Anche la capacità antiossidante degli oli essenziali è stata valutata utilizzando diversi metodi. Una recente revisione discute la diversità dei test utilizzati da diversi autori per valutare l’attività antiossidante degli oli essenziali [5].
Oli essenziali come antiossidanti
3.1 Saggi associati alla perossidazione lipidica
L’ossidazione dei lipidi è una reazione complessa che può essere generata attraverso tre differenti vie: 1. Reazioni a catena non enzimatiche mediate da radicali liberi; 2. Foto-ossidazioni non enzimatiche, non radicaliche; 3. Reazioni enzimatiche [5].
La prima via porta all’inizio di reazioni a catena distruttive in rapida progressione, che generano idroperossidi e composti volatili, generalmente attraverso un processo a tre fasi: inizio, propagazione e terminazione.
La fase di iniziazione comporta la rottura omolitica dell’idrogeno in posizione α rispetto al doppio legame della catena degli acidi grassi, che porta alla formazione di un radicale allilico. Queste specie sono intermedi altamente instabili e di breve durata che si stabilizzano estraendo idrogeno da un’altra specie chimica o reagiscono rapidamente con l’ossigeno per formare un radicale perossilico (fase di propagazione). Nella fase di propagazione, i radicali perossilici formati possono ossidare ulteriormente il lipide, producendo idroperossidi.
Questi sono stabilizzati tramite riarrangiamento del doppio legame (deslocalizzazione elettronica), originando dieni e trieni coniugati. Questi intermedi si decompongono, originando alcoli, aldeidi, formiati alchilici, chetoni, idrocarburi, radicali alcossilici e acido formico. Tutti questi composti sono considerati prodotti secondari dell’ossidazione dei lipidi [5].
Nella valutazione della perossidazione lipidica, possono essere utilizzati diversi substrati lipidici. cioè oli e grassi, acido linoleico, esteri metilici di acidi grassi e lipoproteine a bassa densità (LDL). L’attività antiossidante in tali sistemi può essere rilevata misurando il substrato e il consumo di ossidante, e la formazione di intermedi o prodotti finali [5].
Sono disponibili diversi test per determinare i prodotti primari e secondari dell’ossidazione dei lipidi. Dai più recenti lavori pubblicati su riviste scientifiche sull’attività antiossidante degli oli essenziali è possibile registrare tale diversità sulla valutazione dell’attività antiossidante degli oli essenziali.
3.1.1. Valutazione del livello di perossidazione mediante tiocianato ferrico
Durante l’ossidazione dell’acido linoleico si formano perossidi (prodotti primari dell’ossidazione) che ossidano il Fe2+ a Fe3+. Questi ultimi ioni formano un complesso con tiocianato, e questo complesso ha un’assorbanza massima a 500 nm. Pertanto, un’elevata capacità di assorbimento indica un’elevata ossidazione dell’acido linoleico. Utilizzando questo metodo, alcuni autori [42] hanno scoperto che Lavandula angustifolia Mill. l’olio proveniente dall’Australia era significativamente più efficace contro la perossidazione lipidica rispetto a qualsiasi altro olio studiato. Tale olio era costituito prevalentemente da linalolo e acetato di linalile.
3.1.2. Saggio di dieni coniugati
L’effetto antiossidante delle sostanze in esame può essere valutato monitorando la formazione del diene coniugato nella fase iniziale della perossidazione lipidica. Gli idroperossidi formati dal metillinoleato per ossidazione a 40 ºC sono stati misurati da [43] nel tempo, spettrofotometricamente, a una lunghezza d’onda di 234 nm (per l’assorbimento di dieni coniugati). Gli oli di Thymus vulgaris L. (timo), Eugenia caryophyllus (C. Spreng) Bull et Hare, e Ocimum basilicum L. (basilico) hanno esercitato un’apprezzabile attività antiossidante, paragonabile a quella dell’α-tocoferolo, riferimento scelto dagli autori [ 43]. Nell’olio di timo predominavano il p-cimene e il timolo; nell’olio di chiodi di garofano dominavano l’eugenolo e il -cariofillene; e nell’olio di basilico, linalolo, isoanetolo ed eugenolo costituivano i componenti principali.
3.1.3. Test di sbiancamento
del -carotene Il metodo di sbiancamento del -carotene (ossidazione accoppiata di -carotene e acido linoleico) stima la capacità relativa dei composti antiossidanti negli estratti vegetali di eliminare il radicale del perossido di acido linoleico che ossida il β-carotene nella fase di emulsione. Il β-carotene in assenza dell’antissodante subisce una rapida decolorazione poiché il radicale dell’acido linoleico libero attacca il β-carotene, che perde i doppi legami e, di conseguenza, il suo colore arancione.
Dalle sette specie di Lauraceae dell’Himalaya, gli oli essenziali di Dodecadenia grandiflora Nees, Lindera pulcherrima (Nees) Benth. ex Hook. F. e Persea gamblei (King ex Hook. f.) Kosterm sono stati in grado di inibire l’ossidazione dell’acido linoleico. I sesquiterpenoidi dominavano gli oli. Furanodiene e germacrene D predominavano negli oli di Dodecadenia grandiflora, mentre furanodienone e curzerenone costituivano i principali componenti dell’olio di Lindera pulcherrima [44]. Gli oli di Persea gamblei erano costituiti da -cariofillene, γ-gurjunene e β-cubenene. Tali attività erano indipendenti dalla presenza di composti fenolici negli oli essenziali.
Mighri et al. (2010) [45] hanno studiato l’attività antiossidante degli oli essenziali di Artemisia herba-alba Asso. coltivato nel sud della Tunisia. Sono stati utilizzati diversi metodi e uno di questi era il test -bleaching. Hanno trovato quattro tipi di olio: β-tujone, α-tujone, tujone (α + β) e 1,8-cineolo/canfora/tujone (α + β). Tutti questi oli hanno mostrato deboli capacità antiossidanti per prevenire l’ossidazione dell’acido linoleico. L’olio ricco di β-tujone ha mostrato la migliore percentuale di inibizione (12,5%), tuttavia molto inferiore al BHA (89,2%). L’hanno attribuito tali risultati all’assenza di composti non fenolici [45].
Gli oli essenziali di diverse parti di Myrtus communis var. italica L. foglia, fusto e fiore sono stati valutati chimicamente. α-pinene e 1,8-cineolo dominavano l’olio fogliare; 1,8-cineolo, α-pinene, trans-cariofillene e linalolo costituivano i principali componenti dell’olio di stelo, mentre nell’olio di fiori, insieme a questi 4 componenti, erano presenti anche α-terpineolo ed eugenolo. Gli oli di foglie e fiori hanno le migliori attività antiossidanti, tuttavia inferiori a quelle del BHT e del BHA. Gli autori [46] hanno attribuito tali deboli attività al basso livello di composti fenolici (eugenolo nei fiori) o addirittura alla loro assenza (stelo e foglia), perché anche gli estratti studiati nel presente lavoro presentavano attività più elevate. Tuttavia è opportuno citare le attività simili riscontrate negli oli di foglie e di fiori, nonostante l’assenza di fenoli negli oli di foglie.
L’attività antiossidante di Hymenocrater longiflorus Benth. dall’Iran è stato valutato [47]. I componenti principali degli oli includevano α-pinene, 1,8-cineolo, -eudesmol, spathulenol, hedycaryol, δ-cadinene, tra gli altri componenti, tuttavia predominando i sesquiterpeni ossigenati (47,4%). Gli oli essenziali sono stati in grado di inibire lo sbiancamento del -carotene. La percentuale di inibizione era addirittura vicina (66,4%) a quelle riscontrate per la sub-frazione non polare (cloroformica) (69,1%), che presentava la migliore attività. Tuttavia, gli autori non hanno spiegato questi risultati che sono in contraddizione con quelli ottenuti quando l’attività antiossidante è stata misurata con un altro metodo, in cui la frazione polare ricca di composti fenolici aveva la massima attività [47].
Sono state anche analizzate le attività antiossidanti di altri oli isolati da diverse piante iraniane [48,49]. In entrambi i casi le attività sono state deboli. L’inibizione percentuale di Salvia eremophila Boiss. l’olio era di circa un terzo di quello del BHT, a differenza degli estratti metanolici della stessa pianta, che presentavano attività paragonabili a quella del BHT. Gli autori hanno considerato l’assenza di composti fenolici negli oli responsabili di tale debole attività. α-pinene, borneolo, canfene e trans-cariofillene erano i componenti principali dell’olio [48]. Per l’olio Psammogeton canescens (DC.) vatke gli autori [49] hanno anche attribuito la debole attività degli oli alla presenza di β-bisabolene, apiole, α-pinene e aneto apiole, tutti composti non fenolici.
Sono state valutate le attività antiossidanti, antimicrobiche e antispasmodiche di Origanum acutidens (Hand.-Mazz) Ietswaart dalla flora turca [50]. Il carvacrolo era il componente principale dell’olio essenziale. Questo olio presentava attività antiossidante, ma inferiore a quella della sostanza di riferimento utilizzata dagli autori (BHT). Nonostante l’elevata percentuale di carvacrolo presente nell’olio, la percentuale di inibizione ha raggiunto solo il 65%, in contrasto con il 100% di BHT.
3.1.4. Sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS)
Questo metodo misura la malondialdeide (MDA) formatasi dopo la decomposizione dell’idroperossido lipidico (prodotti secondari dell’ossidazione), che forma un cromoforo rosa con l’acido tiobarbiturico (TBA). Questo complesso colorato, che assorbe a 532 nm, provoca la condensazione di TBA e malondialdeide in ambiente acido. Questo metodo non è molto specifico, perché i 4-idrossi-alcheni, i 2,4-alcadienali e i 2-alcheni, i prodotti di degradazione di proteine e zuccheri, amminoacidi, acidi nucleici e antociani sono anche in grado di reagire con TBA, formando un cromoforo [5 ].
L’olio essenziale di Ageratum conyzoides L., costituito principalmente da precocene I e cariofillene, possedeva buone capacità di prevenire la perossidazione lipidica, utilizzando come substrato lipidico l’omogenato di fegato [51]. I risultati sono stati anche migliori di quelli trovati per il BHA di riferimento. Gli autori hanno anche testato estratti metanolici delle stesse piante ma le attività erano circa 100 volte inferiori a quelle degli oli essenziali. Gli autori ipotizzano anche che l’attività antiaflatossigena riscontrata per gli oli essenziali possa essere in parte dovuta alla loro attività antiossidante [51].
L’attività antiossidante degli oli essenziali di cinque piante di spezie utilizzate nella dieta mediterranea è stata valutata [52] attraverso il test delle specie reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS) utilizzando tuorlo d’uovo come substrato. Tutti gli oli essenziali testati (Thymus vulgaris L., [Eugenia caryophyllus (C. Spreng) Bull et Hare], Origanum vulgare L., Salvia officinalis L. e Rosmarinus officinalis L.) avevano attività antiossidante, ma l’olio di Thymus vulgaris presentava la migliore attività , vicino a quello verificato per BHT. Predominavano il terpinen-4-olo, il γ-terpinene, il cis-sabinene idrato, il linalolo e il p-cimene.
L’attività antiossidante degli oli essenziali di timo dal Portogallo è stata l’obiettivo dello studio in [53]. Gli autori hanno studiato la capacità di prevenire la perossidazione lipidica attraverso lo stesso metodo descritto da [52] e hanno scoperto che Thymus zygis subsp. zygis e Thymus zygis subsp. sylvestris ottenuti da diverse regioni del Portogallo hanno mostrato una buona attività antiossidante, anche migliore di quella del BHT. Negli oli predominano carvacrolo, timolo, p-cimene e γ-terpinene, anche se in percentuali diverse.
Timo marschallianus Volontà. e Thymus proximus Serg. gli oli provenienti dalla Cina avevano una capacità inferiore di prevenire la perossidazione della lecitina rispetto al BHT, utilizzando il metodo TBARS. Tuttavia, tra gli oli, quello isolato dal Thymus proximus aveva un’attività molto più elevata. In questo olio predominavano p-cimene, γ-terpinene e timolo, mentre nell’altro olio dominavano solo γ-terpinene e timolo. Secondo questi risultati, gli autori [54] hanno sottolineato l’importanza del p-cimene nell’attività antiossidante del Thymus proximus, oltre al timolo e al γ-terpinene.
Tra le sette specie di Lauraceae dell’Himalaya, solo gli oli essenziali di Dodecadenia grandiflora e Lindera pulcherrima sono stati in grado di inibire la perossidazione lipidica, utilizzando l’omogenato di fegato come substrato lipidico. Questi oli, insieme a Persea gamblei, sono già stati segnalati come potenti inibitori dell’ossidazione linoleica misurata attraverso il test di sbiancamento del -carotene [44]. Tali attività erano indipendenti dalla presenza di composti fenolici negli oli essenziali.
La valutazione delle attività antiossidanti degli oli essenziali di Capparis spinosa L. e Crithmum maritimum L. della Dalmazia (Croazia) con metodi diversi, ha mostrato che utilizzando il metodo TBARS, gli oli presentati a 1 g/L (la più alta concentrazione testata) hanno una capacità inferiore inibire la perossidazione lipidica rispetto al BHA, ma vicino a quello del BHT. Hanno anche scoperto che l’attività era dose-dipendente. Le differenze di attività di entrambi i campioni non erano significative, sebbene lo fossero le differenze nella composizione chimica degli oli. L’olio di Capparis spinosa era costituito prevalentemente da isotiocianato di metile, mentre il sabinene e il limonene erano i componenti principali dell’olio di Crithmum maritimum [55].
Amomum tsao-ko Crevost & Lemairé è una pianta zingiberacea chiamata ‘Caoguo’ o ‘Tsao-ko’, ampiamente diffusa nel sud-ovest della Cina. Poiché alcuni rapporti hanno correlato la citotossicità con l’attività antiossidante e l’olio essenziale studiato dagli autori aveva una sostanziale attività antitumorale, [56] ha analizzato l’attività antiossidante dei loro campioni utilizzando diversi metodi, uno di questi è il metodo TBARS. Il substrato lipidico era costituito da liposomi contenenti lecitina, e l’induzione della perossidazione è stata effettuata con solfato ferroso.
Hanno trovato una debole attività antiossidante, come previsto dagli autori, a causa del basso contenuto fenolico degli oli. Il componente principale era 1,8-cineolo. L’assenza di composti fenolici correlati a una debole attività antiossidante non è in accordo con quelli riportati da [44,55], che ha riscontrato un’attività potente e moderata con oli che presentano rispettivamente furanodiene, germacrene D, furanodienone, curzerenone e sabinene e limonene. Nonostante la diversa composizione degli oli è anche importante sottolineare che questa differenza di attività può essere attribuita anche al diverso substrato lipidico utilizzato in entrambi i lavori.
Parti aeree e semi di Foeniculum vulgare Mill. gli oli possiedono composizioni chimiche differenti, tuttavia per quanto riguarda l’attività antiossidante, gli autori in [57] hanno riscontrato che per concentrazioni più elevate di oli essenziali (>750 mg/L per le parti aeree e > 1.000 mg/L per i semi) una diminuzione di l’attività è stata osservata, suggerendo che elevate concentrazioni di oli essenziali possiedono un’attività pro-ossidante, indipendentemente dalla loro ricchezza in trans-anetolo (parti aeree) o metil chavicol (semi).
Suanarunsawat et al. (2010) [58] hanno studiato le attività anti-iperlipidemiche e antiossidanti degli oli essenziali estratti dalle foglie di Ocimum sanctum L. in ratti nutriti con una dieta ricca di colesterolo. L’eugenolo e il metil eugenolo erano i componenti più importanti negli oli essenziali. Gli oli sono stati in grado di ridurre gli alti livelli di TBARS nei tessuti cardiaci o epatici, proteggendoli dall’ossidazione indotta dallo stress.
La malonaldeide può essere misurata anche mediante gascromatografia con rivelatore di azoto fosforo, previa derivatizzazione della malonaldeide a 1-metilpirazolo con N-metilidrazina. Questo metodo è stato seguito da [43] che ha dimostrato che gli oli di Thymus vulgaris e Eugenia caryophyllus possedevano l’attività più forte, anche paragonabile a quella dell’α-tocoferolo. Tuttavia, nello stesso lavoro gli autori hanno anche riferito che a concentrazioni più elevate di olio di timo, tale capacità diminuiva. L’olio di basilico, che era considerato un buon antiossidante quando se ne misurava l’attività mediante il saggio del diene coniugato, non risaltava in questo test, in cui veniva considerato solo come dotato di moderata attività. Tali risultati possono rivelare che il basilico è solo in grado di prevenire l’ossidazione primaria dei lipidi.
3.1.5. Saggio aldeide/acido carbossilico
Questo saggio è utile per valutare gli effetti degli antiossidanti contro i fenomeni di ossidazione lenta che si verificano in periodi di tempo prolungati, come mostrato nella durata di conservazione degli alimenti [59]. Gli autori [43] utilizzando questo metodo hanno dimostrato che gli oli di Thymus vulgaris, Eugenia caryophyllus, Cinnamomum zeylanicum Blume., Ocimum basilicum L. e Illicium verum Hook. F. sono stati in grado di prevenire l’ossidazione dell’esanale ad acido esanoico promossa dal calore e dall’aria pura introdotti in un sistema sigillato, dopo 40 giorni di conservazione. La diminuzione dell’esanale è stata seguita da gascromatografia accoppiata a un rivelatore a ionizzazione di fiamma. Tali risultati possono dimostrare la scarsa importanza dei composti fenolici per prevenire l’ossidazione dell’esanale, poiché l’olio di Illicium verum era principalmente costituito da anetolo [43].
3.1.6. Misura dell’acido formico
Il metodo Rancimat è un test automatizzato che misura la conduttività degli acidi grassi a basso peso molecolare (acido formico) prodotti durante l’autoossidazione dei lipidi a 100 ºC o più [5]. L’attività antiossidante degli oli essenziali di cinque piante speziate utilizzate nella dieta mediterranea che è stata valutata tramite il metodo TBARS [52] è stata valutata anche tramite il metodo Rancimat in cui il substrato lipidico era lo strutto.
Il sistema è stato riscaldato a 120 ºC e nella miscela è stato costantemente immesso un flusso d’aria di 20 L/h. La fine del periodo di induzione è stata caratterizzata dall’improvviso aumento della conducibilità dell’acqua, dovuto alla dissociazione degli acidi carbossilici volatili. I loro risultati hanno mostrato che gli oli di Thymus vulgaris e Origanum vulgare L. hanno mostrato il miglior indice di attività antiossidante, come determinato dal metodo Rancimat, ma inferiore all’attività del BHT (standard sintetico). Il carvacrolo era il componente principale dell’olio di Origanum vulgare.
In questo caso, un olio ricco di componenti fenoliche (origano) e l’altro (timo) senza grandi livelli di tali componenti presentavano attività simili, contrariamente a quanto riportato per il TBARS, in cui il timo possedeva la migliore attività [52]. Questo è un buon esempio in cui diversi metodi di valutazione antiossidante possono dare risultati diversi, mostrando quindi l’importanza di utilizzare diversi metodi per valutare l’attività enatiossidante dei campioni.
L’estrazione con fluido supercritico dell’olio volatile dalle parti aeree di Thymus vulgaris L. e la corrispondente composizione è stata confrontata con quelle dell’olio essenziale isolato per idrodistillazione. I componenti principali in entrambi i casi erano p-cimene, γ-terpinene, linalolo, timolo e carvacrolo. Le percentuali variavano a seconda del metodo di estrazione utilizzato, tuttavia in entrambi i casi dominavano p-cimene e timolo. La grande differenza è risultata essere la presenza di timochinone nell’olio volatile ottenuto attraverso l’estrazione del fluido supercritico. La presenza di questo componente potrebbe essere responsabile della più alta attività antiossidante valutata dal test Rancimat, in cui il substrato lipidico era l’olio di girasole [60].
È inoltre da sottolineare la differenza nella composizione chimica degli oli di Thymus vulgaris riportata da [52,60], mostrando quindi l’importanza della valutazione della composizione chimica dei campioni.
3.2. Capacità di rimozione dei radicali liberi
Per misurare la capacità di rimozione dei radicali liberi, i metodi sono raggruppati in due gruppi, in base alle reazioni chimiche coinvolte: metodi basati sulla reazione di trasferimento dell’atomo di idrogeno e metodi basati sulla reazione di trasferimento di singolo elettrone [5].
3.2.1. Dosaggio del 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH)
Il test DPPH più comunemente usato è semplice e altamente sensibile. DPPH è commercializzato in forma radicale grazie alla sua stabilità. Questo radicale mostra un forte assorbimento massimo a 517 nm (viola). In presenza di antiossidanti il colore vira dal viola al giallo. Pertanto l’unica attrezzatura necessaria per il test è uno spettrofotometro UV-Vis.
Inizialmente, si pensava che il radicale DPPH fosse ridotto alla corrispondente idrazina quando reagiva con le sostanze donatrici di idrogeno. Tuttavia, studi più recenti hanno dimostrato che ciò che avviene è principalmente un rapido trasferimento di elettroni dal campione al radicale DPPH. L’estrazione di idrogeno dal campione da parte del radicale DPPH è marginale, perché avviene molto lentamente e dipende dal solvente che accetta il legame idrogeno. Il metanolo e l’etanolo, solventi generalmente utilizzati per saggi di capacità antiossidante, accettano fortemente il legame idrogeno, quindi la reazione di estrazione dell’idrogeno avviene molto lentamente [5].
Per la sua semplicità e sensibilità, alcuni autori utilizzano solo il metodo DPPH per valutare le attività antiossidanti degli oli essenziali. Recentemente, nella nostra ricerca bibliografica, si possono trovare alcuni esempi [61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,63,64]. A volte, la decisione di utilizzare solo questo metodo può essere attribuita alla bassa attività antiossidante rilevata, pertanto gli autori hanno ritenuto superfluo perseguire altri metodi.
Un esempio è il caso riportato in [61], in cui gli autori hanno riscontrato una bassa attività antiossidante di Commiphora ornifolia (Balf. f.) Gillett e Commiphora parvifolia Engl. oli anche ad alte concentrazioni. In base a questi risultati e alla composizione chimica degli oli, in cui erano assenti i composti fenolici, gli autori hanno probabilmente ritenuto superfluo utilizzare altri metodi. Un altro esempio è l’olio di foglie di Olea europaea L. cv. Chemlali dalla Tunisia che possiede anche una bassa attività rispetto al BHT [70], perché i componenti principali erano α-pinene e 2,6-dimetilottano, cioè composti non fenolici.
Tuttavia, ci sono altri autori che ritengono sufficiente testare utilizzando un solo metodo (DPPH) quando si riscontrano buoni valori di attività antiossidante [62,66,67,68,70]. Ad esempio, gli autori in [62] hanno riscontrato elevate attività antiossidanti degli oli essenziali di Eucalyptus camaldulensis Dehnh. allo stato spontaneo in diverse località della Sardegna (Italia). Le attività cambiavano in base alla composizione chimica, comunque generalmente costituita da p-cimene, 1,8-cineolo, β-fellandrene, spathulenol e critone in proporzioni diverse a seconda del luogo e del periodo di raccolta.
L’olio essenziale di Majorana hortensis L. aveva un’apprezzabile attività antiossidante probabilmente ascrivibile al carvacrolo con sinergia positiva con altri componenti [66]. Citrus maxima Burm. e Citrus sinensis (L.) Osbeck avevano anche notevoli attività antiossidanti, nonostante le differenze chimiche dei loro oli essenziali. Mentre gli oli di Citrus sinensis erano costituiti prevalentemente da limonene, nell’olio di Citrus maxima, diversi componenti potrebbero essere identificati in quantità significative nell’olio (limonene, E-citrale, Z-citrale e 3,3-dimetil-1-esene [67].
Heracleum pastinacifolium e Heracleum persicum sono stati descritti come dotati di moderata attività antiossidante, i cui componenti principali erano rispettivamente miristicina e trans-ametolo [68]. Tre Lippia graveolens messicani Kunth. oli con diversa composizione chimica e le loro microcapsule sono stati valutati in termini di attività antiradicalica. Gli autori hanno concluso che la microincapsulazione ha aumentato l’attività antiradicalica da quattro volte a otto oro [69]. Oli vari ottenuti da Origanum vulgare L. subsp. glandulosum (Desf.) raccolti in diverse località della Tunisia hanno mostrato capacità diverse ma sempre buone per lo scavenging dei radicali DPPH. Tali risultati dipendevano dalla percentuale di composti fenolici (timolo) presenti negli oli [71]. Nonostante alcuni autori ritengano che gli oli floreali di Retama raetam (Forssk.)
Il Webb coltivato in Tunisia ha presentato una buona attività antiossidante, misurata attraverso il metodo DPPH, l’unico metodo utilizzato dagli autori, per cui il valore IC50 era quaranta volte superiore a quello del BHT di riferimento, tuttavia l’apparente buona attività relativa riportata dagli autori potrebbe essere attribuito alla percentuale relativamente alta di monoterpeni presenti negli oli essenziali [72]. Una buona attività è stata trovata da Saei-Dehkordi et al. (2010) [74] per l’olio di radice di Ridolfia segetum (L.) Moris dalla Tunisia, perché i valori di IC50 erano vicini a quelli del BHT. Tale attività antiradicalica potrebbe essere attribuita alle elevate quantità di due fenil-propanoidi, dillapiole e miristicina [60].
Il metodo DPPH è stato anche l’unico utilizzato da [63], sebbene gli autori abbiano eseguito anche il metodo DPPH ma accoppiato alla TLC (cromatografia su strato sottile), che consente di determinare quali composti sono responsabili dell’attività antiossidante. Utilizzando due test basati sullo stesso principio ma utilizzando metodologie diverse (spettrofotometro e TLC), gli autori sono stati in grado di trovare i composti responsabili di tali attività dopo la separazione mediante TLC.
Gli autori hanno individuato nell’1,8-cineolo e nel metil eugenolo i componenti responsabili della moderata attività antiossidante degli oli essenziali di Myrtus communis L.. La stessa procedura è stata seguita da altri autori [64] per gli oli di Aniba panurensis (Meisn. ) Mez, Aniba rosaeodora Ducke e Licaria martiniana (Mez) Kostern., dal Brasile. I valori di IC50 erano generalmente >1.000 μg/mL, sostanzialmente superiori a quelli della quercetina, riferimento utilizzato dagli autori. Tale bassa attività è stata attribuita all’assenza o alle bassissime concentrazioni di alcuni composti responsabili dell’attività antiossidante – -cariofillene insieme ai composti fenolici. Ancora una volta, e come riportato sopra, tali risultati potrebbero essere sufficienti per consentire agli autori di decidere di non eseguire altri test.
Saleh et al. (2010) [65] hanno condotto una valutazione comparativa delle proprietà antiossidanti di 248 oli essenziali mediante il metodo spettrofotometrico di DPPH insieme a DPPH/TLC. Solo 17 specie possedevano un’efficace attività antiossidante, appartenenti principalmente alla famiglia delle Lamiaceae. I composti attivi rilevati con il metodo DPPH/TLC includevano fenoli, non fenoli, composti ossigenati o non ossigenati.
Nonostante alcuni autori scelgano un solo metodo per valutare l’attività antiossidante, la grande maggioranza preferisce controllare almeno due saggi. Le combinazioni possono includere saggi per valutare la capacità di inibire la perossidazione lipidica attraverso i metodi sopra riportati e altri non inclusi in questo testo e prove riguardanti la capacità di eliminare i radicali liberi.
Alcuni degli autori che avevano valutato la capacità degli oli essenziali di prevenire la perossidazione lipidica con il metodo TBARS, avevano valutato anche la capacità di scavenging dei radicali liberi, utilizzando il saggio DPPH [44,54,51,52,53,56,57] .
Non sempre la migliore attività riscontrata nel saggio TBARS corrisponde anche alla migliore capacità di eliminare i radicali DPPH. Tale è stato trovato [44,51]. Gli oli essenziali di Ageratum conyzoides o Amomum tsao ko hanno presentato una migliore capacità di prevenire la perossidazione lipidica rispetto a eliminare i radicali liberi. Ageratum conyzoides estratti metanolici che
t aveva una bassa capacità di prevenire l’ossidazione dei lipidi, nel test DPPH si è rivelato essere più efficace dell’olio essenziale [51]. D’altra parte Lindera pulcherrima, Dodecadenia grandiflora e Dodecadenia gamblei hanno presentato la migliore inibizione della perossidazione lipidica determinata attraverso il metodo TBARS e nel test di sbiancamento del -carotene, ma nel metodo DPPH, solo Dodecadenia grandiflora era un potente scavenger di radicali DPPH [44]. Un altro esempio è quello riportato [52] per gli oli di Thymus vulgaris ed Eugenia caryophyllus.
In questo saggio, gli autori hanno scoperto che l’olio di Thymus vulgaris aveva la migliore attività contro l’ossidazione dei lipidi, mentre nel metodo DPPH, gli autori hanno scoperto che l’olio di Eugenia caryophyllus era il più potente scavenger dei radicali liberi DPPH, anche meglio dell’acido ascorbico standard e BHT. Gli stessi autori hanno utilizzato anche il test Rancimat, e in quella sede l’olio migliore è stato quello di Origanum vulgare, anche se peggiore di quello del BHT di riferimento.
La frazione apolare e l’olio essenziale di Hymenocrater longiflorus possedevano una grande capacità di inibire lo sbiancamento del -carotene, tuttavia i risultati differivano quando veniva utilizzato il metodo DPPH. In questo caso, l’olio essenziale era l’unico che aveva la peggiore capacità di eliminare questi radicali liberi [47]. Indipendente dalla parte vegetale di Myrtus communis var. italica L. utilizzato e il metodo antiossidante utilizzato, le frazioni metanoliche sono sempre state antiossidanti migliori degli oli essenziali [46]. Questo è un esempio in cui in entrambi i metodi i risultati si sono mantenuti in contrasto con quelli riportati fino ad ora.
Come già riportato sopra, ci sono ricercatori che preferiscono valutare l’attività antiossidante degli oli essenziali attraverso la loro capacità di eliminare i radicali liberi. Ci sono diversi radicali liberi che possono essere usati; tuttavia i principi fondamentali coinvolti possono essere gli stessi.
3.2.2. Capacità antiossidante equivalente Trolox® (TEAC) o ABTS [2,2-Azinobis(3-etilbenzo-tiazolin-6 acido solfonico)]
Questo metodo si basa sulla riduzione del radicale cationico blu-verde di ABTS+•, misurando la riduzione di il catione radicale come percentuale di inibizione dell’assorbanza a 734 nm. L’assorbanza della miscela di reazione di ABTS e un antiossidante viene confrontata con quella dello standard Trolox® e i risultati sono espressi in termini di capacità antiossidante equivalente di Trolox® (TEAC) [59].
Come riportato per il metodo DPPH, ci sono anche alcuni autori che hanno utilizzato solo il metodo ABTS per valutare l’attività antiossidante degli oli essenziali [75,76]. Ennajar et al. (2010) [75] hanno studiato l’influenza dell’organo, della stagione e del metodo di essiccazione sulla composizione chimica e la capacità di eliminazione dell’ABTS di Juniperus phoeniceae L. Hanno trovato le attività più alte e più basse nella stessa parte della pianta (bacche). Considerando il metodo di essiccazione utilizzato, l’essiccazione in forno era il metodo migliore per ottenere un’attività importante per gli oli di foglie e bacche, seguita da oli essenziali essiccati al sole e campioni essiccati all’ombra.
Tale variabilità sembrava essere correlata alla composizione chimica degli oli, i quali avendo un profilo simile, i componenti principali erano presenti in proporzioni diverse (α-pinene, δ-3-carene, α-terpineolo, β-mircene, tra gli altri componenti ). Anche Rosa canina L. possedeva capacità di scavenging ABTS, tuttavia il luogo di raccolta era determinante in tale attività, che sembrava essere correlata alla presenza di alte percentuali di vitispirane [76].
Tuttavia e generalmente troviamo che altri test vengono utilizzati insieme all’ABTS per valutare la capacità di scavenging dei radicali liberi. Ad esempio, Satureja intricata Lange aveva la capacità di eliminare sia DPPH che ABTS, mentre Satureja obovata Lag. non possedeva tale capacità [77]. Questo comportamento potrebbe essere attribuito alla presenza di timolo e dei suoi precursori p-cimene e γ-terpinene, insieme al borneolo in Satureja intricata. Gli oli essenziali di Artemisia herba-alba già riportati sopra come dotati di scarsa capacità di inibire la perossidazione lipidica [45], quando valutati in termini di scavenging dei radicali liberi, gli oli hanno continuato ad avere una debole attività. In questo caso e contrariamente ad altri lavori [44,51], l’olio essenziale di Artemisia herba-alba non è risultato efficace né contro l’ossidazione dei lipidi né come scavenger di radicali liberi.
L’olio di lavanda (Lavandula angustifolia), come riportato sopra, era il più efficace contro la perossidazione lipidica [42]. Per quanto riguarda l’attività di eliminazione dei radicali liberi, l’olio essenziale di lavanda ha anche mostrato la più alta attività di eliminazione del DPPH, tuttavia nell’attività di eliminazione dell’ABTS, gli oli migliori sono stati quelli di Mentha x piperita L e Boswellia carteri Birdw. Nel metodo DPPH, il limonene aveva un’attività simile a quella della Lavandula angustifolia, sebbene il linalolo e l’acetato di linalile costituissero i componenti principali di questo olio essenziale. Limonene predominante nel Citrus x limon (L.) Burm. F. l’olio non corrispondeva alla migliore attività.
3.2.3. Saggio di potere riducente/antiossidante ferrico (FRAP)
Quando un complesso Fe3+-TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) viene ridotto alla forma Fe2+ da un antiossidante in condizioni acide, si sviluppa un colore blu intenso con un massimo di assorbimento a 593 nm. L’effetto antiossidante (capacità riducente) può essere valutato monitorando la formazione di un complesso Fe2+-TPTZ con uno spettrofotometro [59].
L’attività antiossidante della Pistacia atlantica Desf. gli oli di foglie di diverse origini algerine hanno mostrato una debole capacità di eliminare i radicali liberi DPPH, almeno se confrontati con quelli di riferimento (BHT e BHA). Al contrario, gli stessi oli avevano una capacità antiossidante più elevata rispetto all’antiossidante dell’acido ascobico di riferimento quando misurato attraverso il saggio FRAP [78]. Nello stesso saggio, gli autori hanno anche riportato diverse attività a seconda del luogo di raccolta. La migliore attività è stata riscontrata nell’olio ottenuto da Laghouat, costituito principalmente da α-pinene + α-tujene, canfene e spathulenol.
Confrontando l’attività antiossidante misurata mediante l’eliminazione dei radicali DPPH e il potere riducente ferrico (FRAP) degli oli di Zingiber officinale Roscoe e Cuminum cyminum L., El-Ghorab et al. (2010) [79] hanno riportato tendenze quasi simili in entrambi i metodi. Cuminum cyminum, costituito principalmente da cuminal, γ-terpinene, pinocarveol,, carotolo, α-pinene, sabinene, β-terpineol e linalool, ha presentato la migliore attività.
Eugenia caryophyllus (chiodi di garofano) ha mostrato la più alta capacità riducente ferrica in termini di concentrazioni di Trolox®, come nel metodo DPPH, in contrasto con il metodo TBARS, in cui Thymus vulgaris si è dimostrato più efficace [52]. Secondo gli stessi autori, è stata osservata una significativa correlazione lineare tra i valori di FRAP e il contenuto fenolico totale degli oli essenziali analizzati, ad eccezione dell’olio essenziale di Thymus vulgaris.
L’olio di Amomum tsao-ko con bassa attività antiossidante misurata con il metodo TBARS [70], come riportato sopra, aveva anche una debole capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e un basso potere riducente ferrico, principalmente a causa del basso contenuto fenolico degli oli [56] .
La misurazione dell’antiossidante mediante metodi DPPH e FRAP ha mostrato che l’olio essenziale di Eugenia caryophyllus ha mostrato un’attività maggiore rispetto alla frazione aglicone volatile ottenuta dopo idrolisi enzimatica con -glucosidasi dalle mandorle amare dell’estratto e ulteriore estrazione dallo strato acquoso con n-pentano [ 80]. Nel metodo DPPH, l’attività antiossidante dell’olio di chiodi di garofano era superiore alla frazione aglicone volatile, sebbene entrambi i campioni abbiano un alto contenuto di eugenolo.
Questa minore attività potrebbe essere attribuita e secondo gli autori all’antagonismo tra altri costituenti presenti in piccole quantità in questa frazione. La capacità riducente dell’olio essenziale era anche superiore a quella della frazione volatile aglicone. Tuttavia in questo saggio l’eugenolo di riferimento aveva debole capacità, mentre nel metodo DPPH possedeva una notevole attività. Tale differenza potrebbe essere spiegata dalla diversa polarità del metodo FRAP rispetto al metodo DPPH. I solventi “simili all’acqua” inducono una drastica diminuzione della capacità di donare atomi di idrogeno rispetto all’alcol etilico utilizzato nel metodo DPPH [80].
Sono state osservate differenze qualitative e quantitative stagionali nella composizione e nelle attività antiossidanti degli oli essenziali di foglie maschili e femminili di Pistacia atlantica. I componenti principali dell’olio essenziale di foglie maschili erano α-pinene/α-tujene, spathulenol e biciclogermacrene. Il componente principale dell’olio essenziale di foglie femminili era il -3-carene. La variazione stagionale ha mostrato che la maggior parte dei componenti principali degli oli ha raggiunto i valori massimi nel mese di settembre. La più alta capacità antiossidante di eliminare i radicali liberi DPPH è stata raggiunta nel mese di giugno per gli oli maschili e durante i mesi di settembre – ottobre per gli oli femminili. L’alto potere riducente per l’olio maschile è stato rilevato nel mese di giugno e per l’olio femminile nel mese di agosto.
3.2.4. Potere riducente
Un altro metodo per valutare la capacità antiossidante si basa sulla riduzione di Fe3+ a Fe2+ in cui il colore giallo della soluzione in esame cambia in varie tonalità di verde e blu, a seconda del potere riducente di ciascun campione. La presenza di agenti riducenti provoca la conversione del complesso Fe3+/ferricyanide nella forma ferrosa che può essere seguita a 700 nm a causa della formazione del blu di Prussia di Perl Fe4[Fe(CN)6]3.
L’aumento dell’assorbanza a 700 nm indica un aumento della capacità riduttiva [44]. Diversi autori insieme ad altri saggi di attività antiossidante hanno anche testato il potere riducente degli oli essenziali delle specie di Lauraceae dell’Himalaya [44], Myrtus communis var. italica [46], Hymenocrater longiflorus [47], Origanum onites L. [82] e Psammogeton canescens [49]. In questo caso, l’attività antiossidante misurata dai test di sbiancamento del -carotene e DPPH ha mostrato un’attività debole. Gli autori hanno attribuito tale attività alla bassa concentrazione di composti fenolici presenti negli oli essenziali, tuttavia il potere riducente degli stessi campioni è simile a quello dell’acido ascorbico di riferimento, principalmente a concentrazioni più elevate [49].
3.2.5. Attività chelante
Uno dei possibili meccanismi dell’azione antiossidante è la chelazione dei metalli di transizione. Gli ioni dei metalli di transizione possono stimolare la perossidazione lipidica partecipando alla generazione di specie iniziatrici e accelerando la perossidazione, decomponendo gli idroperossidi lipidici in altri componenti che sono in grado di estrarre idrogeno, perpetuando la catena di reazione della perossidazione lipidica [52].
Un metodo solitamente utilizzato per la determinazione dell’attività chelante utilizza ferrozina, che può quantitativamente da complessi con Fe2+. In presenza di altri agenti chelanti, la formazione del complesso viene interrotta, dando luogo ad una diminuzione del colore rosso del complesso ferrozina-Fe2+. La misurazione del tasso di riduzione del colore consente quindi di stimare l’attività chelante del chelante coesistente [46].
Gli oli essenziali di Myrtus communis, Thymus marschallianus e Thymus proximus generalmente non presentavano attività chelante [46,54]. L’unica eccezione erano gli oli essenziali di fiori di mirto. Gli autori [46] hanno spiegato questa attività alla presenza di eugenolo e metil eugenolo nel suo olio essenziale, mentre questi due componenti appartengono solo a una frazione minore degli oli essenziali di foglie e stelo. Questi composti diidrossilati sarebbero necessari per formare Fe2+ chelato. Gli oli di foglie e di stelo avevano come componenti principali l’1,8-cineolo e il terpinen-4-olo, composti monoidrossilati che non sarebbero in grado di chelare gli ioni ferrosi [46]. Per quanto riguarda gli oli essenziali delle piante speziate utilizzate in una dieta mediterranea, tutti sono stati in grado di chelare Fe2+ e lo hanno fatto in modo concentrazione-dipendente [52]. A tutte le concentrazioni saggiate Rosmarinus officinalis L. e gli oli essenziali di Salvia officinalis hanno mostrato i valori più alti per la chelazione di Fe2+. Tutti gli oli studiati erano migliori chelanti del Fe2+ rispetto all’acido ascorbico e al BHT, usati come riferimenti [52].
3.2.6. Scavenging dei radicali idrossilici
Tra i radicali dell’ossigeno, l’idrossile è il più reattivo, in quanto induce gravi danni alle biomolecole ausiliarie. Esistono diversi modi per accertare la capacità di formare radicali idrossili. Uno di questi è il test del desossiribosio. Questo metodo include una miscela di cloruro ferrico (FeCl3) e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), che in presenza di acido ascorbico forma Fe2+-EDTA e forma ossidata di acido ascorbico. Dopo l’aggiunta di perossido di idrogeno (H2O2), si formano Fe3+-EDTA e HO•.
Questa è la cosiddetta reazione di Fenton, che genera il radicale idrossile altamente reattivo (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO− + HO•). I radicali idrossilici che non vengono eliminati da alcun componente della miscela attaccano il desossiribosio e lo degradano in diversi frammenti. Alcuni di questi frammenti sono in grado di reagire con l’acido tiobarbiturico dopo riscaldamento ea pH acido, originando un pigmento rosa che può essere quantificato mediante spettrofotometria [5]. Esistono altri metodi che non utilizzano desossiribosio ma altri componenti come l’acido benzoico o la safranina. Utilizzando questi metodi diversi autori hanno valutato la capacità di scavenging dei radicali idrossilici degli oli essenziali [51,53,54,57,83,84].
La capacità di eliminare i radicali idrossilici degli oli essenziali di Thymus marschallianus e Thymus proximus è stata valutata utilizzando il metodo della safranina e gli autori hanno riferito che quest’ultimo olio era più efficace del primo. L’attività di entrambi gli oli era dose-dipendente ed erano costituiti principalmente da timolo, p-cimene e -terpinene [54].
Patil et al. (2010) [51] hanno confrontato due metodi (desossiribosio e acido benzoico) sulla capacità di abbattimento dei radicali idrossilici di Ageratum conyzoides, costituiti principalmente dai cromeni fenolici precocene I e precocene II, ottenendo risposte diverse a seconda del metodo utilizzato. Nel metodo di idrossilazione dell’acido benzoico, l’olio essenziale ha presentato una migliore attività rispetto al metodo del desossiribosio. Gli autori hanno spiegato tali risultati alla relativa reattività del radicale idrossile verso i substrati desossiribosio e acido benzoico.
Tra le specie di Thymus portoghesi raccolte in diversi luoghi di questo paese, Thymus camphoratus Hoffmanns. & Link, Thymus caespititius Brot. e Thymus capitellatus Hoffmanns. Gli oli & Link di origini diverse sono risultati significativamente più efficaci nell’eliminare i radicali idrossilici rispetto ai campioni rimanenti. Borneolo, canfora, α-terpineolo, 1,8-cineolo, canfene, α-pinene e p-cimene costituivano i principali composti di questi oli essenziali in quantità relative differenti. Gli oli in cui predominavano timolo o carvacrolo non presentavano attività significative, che secondo gli autori [53] indicavano che questi composti fenolici non erano determinanti nella capacità di eliminare i radicali idrossilici.
Gli oli delle foglie giovani e mature di Ageratum scoparia Waldst. & Kit. mostrato un alto grado di attività di scavenging dei radicali idrossilici. Tuttavia, l’attività di lavaggio dei costituenti principali, -mircene e p-cimene, era molto inferiore rispetto a quella degli oli. Gli stessi autori [83] hanno anche valutato l’attività antiossidante dei campioni con il metodo DPPH e hanno anche riportato una minore attività dei principali costituenti degli oli rispetto agli oli essenziali, tuttavia gli oli di foglie maturi erano più efficaci come antiossidanti rispetto agli oli di foglie giovani.
I frutti maturi di Athamanta turbith ssp. hungarica e Athamanta turbith ssp. haynaldii sono ricchi di oli essenziali, la miristicina è il componente principale di entrambi gli oli [84]. È stata valutata la capacità di eliminare i radicali idrossilici e gli autori hanno scoperto che entrambi gli oli avevano capacità simili. Quando l’attività è stata valutata con il metodo DPPH, gli autori hanno riferito che Athamanta turbith ssp. hungarica è risultata la più efficace, anche se con meno capacità rispetto ai riferimenti utilizzati (quercetina e acido ascorbico) [84].
La capacità degli oli essenziali ottenuti dalle parti aeree o dai frutti di Foeniculum vulgare di eliminare i radicali ossidrili è stata sempre inferiore al 50%, alle concentrazioni saggiate (100-2.000 mg/mL) [57]. Il mannitolo, il riferimento utilizzato in questo test, ha mostrato una percentuale di scavenging simile a 2.000 mg/mL. Solo le concentrazioni più elevate hanno presentato percentuali >50%.
3.2.7. Attività di scavenging dell’anione superossido
La xantina ossidasi è un enzima deidrogenasi che trasferisce elettroni alla nicotinammide adenina dinucleotide (NAD+), riducendola a NADH e ossida la xantina o l’ipoxantina in acido urico. Tuttavia, in condizioni di stress, la deidrogenasi viene convertita in un enzima ossidasi e, in queste condizioni, l’enzima riduce l’ossigeno invece di NAD+. In questo modo si ha una riduzione del diossigeno ad anione superossido e perossido di idrogeno. L’anione superossido può essere generato da questo sistema (l’ipoxantina – xantina ossidasi) o utilizzando una reazione non enzimatica. In questo caso, l’anione superossido viene generato attraverso la reazione del metosolfato di fenazina in presenza di NADH e diossigeno. In entrambi i casi, l’anione superossido riduce il tetrazolio nitro-blu (NBT) in formazano che viene seguito spettrofotometricamente [5].
L’attività di scavenging dell’anione superossido degli oli di timo portoghese è stata valutata dal sistema enzimatico ipoxantina/xantina ossidasi [53]. Dei 28 oli essenziali valutati, solo Thymus zygis ssp. sylvestris e Thymus capitellatus raccolti in diversi luoghi del Portogallo hanno mostrato un’attività di scavenging dell’anione superossido >50%. In Thymus zygis ssp. sylvestris prevaleva il timolo o il carvacrolo, mentre negli oli di Thymus capitellatus dominavano il borneolo e l’1,8-cineolo. Tali risultati sembrano indicare che i composti fenolici non sono gli unici in grado di eliminare l’anione superossido, come già riportato per l’eliminazione dei radicali idrossilici [53].
Oli essenziali come agenti
antinfiammatori L’ infiammazione è una normale risposta protettiva indotta da lesioni o infezioni tissutali e funziona per combattere gli invasori nel corpo (microrganismi e cellule non autonome) e per rimuovere le cellule ospiti morte o danneggiate [85].
Nella risposta infiammatoria vi è un aumento della permeabilità delle cellule del rivestimento endoteliale e degli afflussi di leucociti del sangue nell’interstizio, burst ossidativo e rilascio di citochine [interleuchine e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α)]. Allo stesso tempo, c’è anche un’induzione dell’attività di diversi enzimi (ossigenasi, ossido nitrico sintasi, perossidasi) e il metabolismo dell’acido arachidonico. Nel processo infiammatorio c’è anche l’espressione di molecole di adesione cellulare, come la molecola di adesione intercellulare (ICAM) e la molecola di adesione cellulare vascolare (VCAM) [22].
Oltre alla capacità di alcuni oli essenziali di eliminare i radicali liberi, vi sono anche prove che alcuni oli essenziali possiedono attività antinfiammatoria. Ad esempio, l’olio essenziale di camomilla è stato usato per secoli come antinfiammatorio e anche per alleviare i sintomi associati a eczema, dermatiti e altre irritazioni pronunciate [17]. Tuttavia, ci sono altri esempi di oli essenziali (eucalipto, rosmarino, lavanda, millefolia) insieme ad altre piante (pino, chiodi di garofano e mirra) che sono state utilizzate come formulazioni miste come agenti antinfiammatori [86].
L’edema della zampa di topo indotto dalla carragenina viene spesso utilizzato per determinare l’attività antinfiammatoria di diversi composti bioattivi come estratti vegetali e oli essenziali [87,88,89,90,91,92,93,94,95]. Se questo metodo consente lo screening dell’antinfiammatorio dei campioni, vengono fornite pochissime informazioni sul suo meccanismo.
L’attività antinfiammatoria degli oli essenziali può essere attribuita non solo alle loro attività antiossidanti ma anche alle loro interazioni con le cascate di segnalazione che coinvolgono citochine e fattori di trascrizione regolatori e sull’espressione di geni proinfiammatori.
4.1. Effetti sul metabolismo arachidonico
L’acido arachidonico è un acido grasso polinsaturo che viene rilasciato dalle membrane cellulari dalla fosfolipasi A2 sotto lo stimolo di diversi fattori associati all’infiammazione. Lo stesso acido grasso viene metabolizzato dalle vie della cicloossigenasi (COX) e della lipossigenasi (LOX) in diversi eicosanoidi come le prostaglandine (PG) e i leucotrieni (LT) in diverse cellule e il trombossano A2 nelle piastrine [22]. Sono state riportate due isoforme di COX, COX-1 e COX-2. La COX-1 è un enzima costitutivo, mentre la proteina COX-2 è espressa solo leggermente nella maggior parte dei tessuti dei mammiferi normali in risposta a stimoli fisici, chimici e biologici, tra cui l’esposizione alla luce UV, la diossina e l’insulto LPS (lipopolisaccaride) [96].
Le prostaglandine, in particolare la prostaglandina E2 (PGE2), amplificano il meccanismo del dolore e migliorano la permeabilità vascolare mentre i leucotrieni contraggono la muscolatura liscia dei vasi sanguigni, migliorano la permeabilità vascolare e mediano le risposte proinfiammatorie e allergiche [97].
La Figura 1 rappresenta i siti in cui gli oli essenziali oi loro componenti principali sono stati rilevati come agenti antinfiammatori ad azione.
Oli essenziali e loro principali componenti nella modulazione della risposta antinfiammatoria. I percorsi sono descritti nel testo insieme agli esempi di oli essenziali e componenti.
Aloe vera (Aloe barbadensis Miller), anice stellato (Illicium verum Hook f.), bergamotto (Citrus aurantium subsp. bergamia (Risso) Wight & Arn.), foglia di cannella (Cinnamomum zeylanicum Blume.), eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.) , bacca di ginepro (Juniperus communis L.), lavanda (Lavandula officinalis Chaix & Kitt), timo (Thymus vulgaris L.) e ylang-ylang [Cananga odorata (Lam.) Hook. F et Thomson] oli essenziali, in cui predominavano limonene, linalil acetato, β-trans-cariofillene, 1,8-cineolo, p-cimene, timolo ed eugenolo, hanno mostrato forti effetti inibitori della lipossigenasi [43].
Altri esempi di inibitori della 5-lipossigenasi includevano alcuni oli essenziali di Salvia dal Sud Africa. Gli autori hanno attribuito tali attività alla presenza di 1,8-cineolo, α-pinene e β-cariofillene negli oli essenziali [98]. È stato riportato che gli stessi componenti principali presenti negli oli essenziali di quattro specie indigene di elicriso sudafricano inibiscono la 5-lipossigenasi [99]. Il camazulene e l’α-bisabololo sono esempi di altri componenti, presenti nell’olio essenziale di camomilla, con attività antinfiammatoria in parte dovuta all’inibizione della sintesi dei leucotrieni poiché sembrano essere buoni inibitori della 5-lipossigenasi [17]. Gli oli essenziali di foglie e rizomi di Alpinia murdochii Ridl., Alpinia scabra (Blume) Náves e foglie di Alpinia pahangensis Ridl. hanno anche dimostrato di essere buoni inibitori della 5-lipossineasi. -pinene,
Gli oli Torreya nucifera Siebold et Zucc. l’olio, costituito principalmente da limonene, δ-3-carene e α-pinene, era un inibitore selettivo della COX-2 con significativi effetti inibitori sulla produzione di PGE2 [101]. È stato dimostrato che l’1,8-cineolo, un ossido terpenico, presente in molti oli essenziali, inibisce i leucotrieni (LTB4) e le prostaglandine (PGE2), entrambe le vie del metabolismo dell’acido arachidonico [102].
4.2. Effetti sulla produzione di citochine
L’interleuchina-1β (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) sono due importanti citochine proinfiammatorie con un ruolo rilevante nei disturbi infiammatori. La principale fonte di TNF-α sono le cellule della linea dei monociti/macrofagi, sebbene anche i linfociti T, i neutrofili e i mastociti producano questa citochina pro-infiammatoria. IL-1β è prodotta da una varietà di tipi di cellule, inclusi monociti, macrofagi, fibroblasti e cellule endoteliali [103]. La produzione delle citochine proinfiammatorie può essere indotta dal lipopolisaccaride (LPS) che è un’endotossina localizzata sulle pareti cellulari dei batteri Gram negativi in grado di attivare i macrofagi, stimolando la produzione di citochine infiammatorie [104]. Tuttavia, i batteri Gram-positivi possono anche contribuire alla stimolazione nella produzione di citochine.
L’olio essenziale di Cheistocalyx operculatus, la cui composizione chimica non è stata determinata, ha inibito significativamente la secrezione indotta da lipopolisaccaridi (LPS) di citochine IL-1β e TNF-α nelle cellule RAW 264.7, una linea cellulare simile a un macrofago di topo [103]. Tuttavia, e alcuni anni prima, alcuni autori avevano già riferito che l’olio dell’albero del tè (Melaleuca alternifolia Cheel.), principalmente il suo componente principale (terpinen-4-olo), era in grado di sopprimere la produzione in vitro di TNF-α e IL- 1β, così come IL-8, IL-10 e PGE2 da monociti del sangue umano attivati da LPS [106].
Sei anni dopo, Caldefie et al. (2006) [107] hanno anche riportato la capacità dell’olio essenziale di quella specie di sopprimere la citochina pro-infiammatoria IL-2 e di stimolare la secrezione delle citochine IL-4 e IL-10 antinfiammatorie nelle cellule mononucleate del sangue periferico umano ( monociti e linfociti) stimolati dalla lectina fitoemoagglutinina (PHA) da Phaseolus vulgaris L.. Usando anche PHA da Phaseolus vulgaris per stimolare le cellule mononucleate, Hammer et al. (2000) [108] hanno riportato che gli oli essenziali di Taxandria fragrans (JR Wheller & NG Marchant) JR Wheeler & NG Marchant, comb. nov., costituita principalmente da 1,8-cineolo, α-pinene e linalolo, ha diminuito la produzione delle citochine TNF-α e IL-6.
La capacità di inibire la produzione di IL-1β e IL-6 ma non di TNF-α è stata attribuita a 1,8-cineolo, santolina, spathulenol e ossido di cariofillene, i principali costituenti dell’olio essenziale di Cinnamomum osmophloeum Kaneh. foglie [109]. L’olio di Rosmarinus officinalis L., costituito principalmente da 1,8-cineolo insieme ad α-pinene, canfora e p-cimene, è stato in grado di ridurre la produzione proinfiammatoria di IL-6 solo nel colon di topo in cui la colite è stata indotta da 2, Acido 4,6-trinitrobenzensolfonico (TNBS), non sopprime IL-1β [110].
È stato riportato che la cinnamaldeide, isolata da un olio essenziale prodotto dalle foglie di Cinnamomum osmophloeum, inibisce la secrezione di IL-1β e TNF-α all’interno di LPS o dei macrofagi murini J774A.1 stimolati dall’acido lipoteicoico (LTA). La cinnamaldeide ha anche soppresso la produzione di queste citochine da monociti del sangue umano stimolati da LPS derivati da macrofagi primari e monociti umani THP-1 [111].
L’olio essenziale di Cordia verbenacea DC ha ridotto significativamente i livelli di TNF-α ma non la produzione di IL-1β nel tessuto sottocutaneo della zampa di ratto iniettata con carragenina [112]. Alcuni autori hanno dimostrato che dall’olio essenziale di Cordia verbenacea, solo l’α-humelene era in grado di ridurre significativamente l’aumento dei livelli di TNF-α e IL-1β nel tessuto sottocutaneo della zampa di ratto dopo trattamento con LPS [113] o in carragenina- ratti iniettati, mentre (-)-trans-cariofillene diminuiva solo il rilascio di TNF-α [114].
Studiando l’effetto dell’olio essenziale di Cryptomeria japonica D. Don sulle cellule RAW 264.7 trattate con LPS, attraverso un test immunoenzimatico, alcuni ricercatori hanno riportato la notevole inibizione di IL-1β, IL-6 e TNF-α da parte di quell’olio [115]. In questo olio essenziale prevalevano kaurene, elemol, -eudesmol e sabinene.
α-Tujone, β-tujone, canfora e cariofillene erano i componenti principali dell’olio di Artemisia fukudo in grado di inibire il rilascio di TNF-α, IL-1β e IL-6 nelle cellule RAW 264.7 trattate con LPS [116] .
La miscela di stereoisomeri geraniale (isomero E) e nerale (isomero Z), noto come citrale, costituisce i principali componenti di Cymbopogon citratus (DC) Stapf. (citronella) olio essenziale. Questo olio essenziale si è rivelato in grado di sopprimere IL-1β e IL-6 nei macrofagi peritoneali stimolati da LPS di topi normali [117]. Gli stessi autori hanno attribuito proprietà simili all’eugenolo, il principale componente presente nell’olio essenziale di Syzygium aromaticum (L.) Merr. et Perry (chiodo di garofano) [118].
Altri autori hanno anche scoperto che l’eugenolo sui macrofagi umani (U937) sotto la stimolazione di LPS bloccava il rilascio di IL-1β, TNF-α e PGE2 [119]. Se alcuni oli essenziali sono in grado di inibire la produzione di citochine proinfiammatorie come il TNF-α, alcuni di essi, in particolare citronella, geranio e menta verde e i loro componenti principali (citrale, geraniolo, citronellolo e carvone), possono anche sopprimere il TNF Risposte di aderenza dei neutrofili indotte da α [120]. Secondo questi autori, quegli oli essenziali o i loro componenti principali non influenzano il TNF-α ma influenzano la funzione dei neutrofili per sopprimere la loro adesione. Pertanto e per quanto riguarda la citronella e il citrale e come riportato sopra, possono anche sopprimere le citochine pro-infiammatorie IL-1β e IL-6 [117]. In altri lavori, Lin et al. (2008) [121] ha rivelato che citrale,
Alcuni tra i 21 [pimento (Pimenta officinalis Lindl.), Cardamomo (Elettaria cardamomum Maton.), Carvi (Carum carvi L.) e gardenia (Gardenia jasminoides Ellis), Cumino (cumino Cynin L.), Trifoglio [Diospyros aromatic (50 .) Uomini. LM Perry], alloro (Laurus nobilis L.), coriandolo (Coriandrum sativum L.), fieno greco (Trigonella foenum-graecum L.), cannella (Cinnamomum zeylonica Blume), salvia (Salvia officinalis L.), semi di sedano (prezzemolo graveolens) L.), timo (Thymus vulgaris L.), Chenp (Citrus unshiu Markov.), noce moscata (Myristica fragrans Hout), anice stellato (Illicium verum Hook f.), paprika (Capsicum annuum L.), finocchio (Foeniculum vulgare Mill .), pepe nero (Piper nigrum L.), menta giapponese (Mentha arvensis Linn. var. piperascens Holm) e rosmarino (Rosmarinus officinalis L. )] studiati da alcuni autori per valutare la loro attività epatoprotettiva alimentando ratti con danno epatico causato da LPS più D-galattosamina (D-GalN), solo la miristicina, il componente principale dell’olio di noce moscata, presentava una potente attività epatoprotettiva sopprimendo LPS/D -GalN ha indotto il potenziamento delle concentrazioni sieriche di TNF-α e la frammentazione del DNA epatico nei topi. Pertanto, secondo gli stessi autori, l’attività epatoprotettiva della miristicina potrebbe essere, almeno in parte, dovuta all’inibizione del rilascio di TNF-α dai macrofagi [122].
Animali (topi) pretrattati con Pterodon emarginatus Vogel. l’olio ha presentato una marcata riduzione dei livelli di IL-1 e TNF-α dopo essere stato sottoposto a una singola iniezione intrapleurica di carragenina [123]. trans-cariofillene, β-elemene e germacrene D erano i principali componenti presenti nel presente olio.
Gli effetti antinfiammatori di diverse combinazioni di oli di timo (p-cimene e timolo come componenti principali) e origano (carvacrolo come componente principale) su topi con colite indotta da TNBS hanno mostrato che alcune combinazioni hanno ridotto le quantità di IL-1β e IL- 6 citochine [124].
L’effetto inibitorio di alcuni degli oli essenziali sulla produzione di citochine proinfiammatorie riportato in questo capitolo sembra essere mediato dalla soppressione dell’espressione genica di queste citochine. Tale è stato descritto da alcuni autori perché hanno scoperto che gli oli essenziali studiati sopprimevano significativamente l’espressione di proteine e mRNA delle citochine nelle cellule stimolate, assumendo quindi che l’effetto inibitorio di questi oli essenziali sull’espressione delle citochine proinfiammatorie si verifica principalmente a livello trascrizionale [103,116,123,124]. L’olio essenziale di timo, costituito principalmente da p-cimene e timolo, solo ad alte concentrazioni (5.000 mg/L) ha inibito significativamente l’espressione di IL-1β dell’mRNA totale nel colon di topo in cui la colite è stata indotta da TNBS, non inibendo significativamente l’espressione di IL-6 [125].
4.3. Modulazione dell’espressione genica
proinfiammatoria L’ossido nitrico (NO), le prostaglandine e le citochine partecipano agli eventi infiammatori. L’NO sintasi (NOS) e la cicloossigenasi (COX) catalizzano rispettivamente la formazione di NO e prostaglandine. COX-2 e NOS inducibile sono considerati forme inducibili di questi enzimi.
Esistono tre isoforme di NOS: costitutiva (cNOS), endoteliale (eNOS) e l’altra è NOS inducibile da citochine (iNOS). I mediatori dell’infiammazione come IL-1, TNF-α o LPS stimolano l’espressione di iNOS nei macrofagi dei roditori in vitro. La produzione di NO e/o l’espressione di iNOS sono anche indotte da mediatori dell’infiammazione in un’ampia varietà di cellule di mammifero, producendo grandi quantità di NO per periodi di tempo prolungati [25]. iNOS catalizza la produzione di grandi quantità di NO dalla L-arginina e dall’ossigeno molecolare, è principalmente innescato e regolato da una serie di vie di segnalazione tra cui il fattore di trascrizione del fattore nucleare-κB (NF-κB) e le proteine chinasi attivate da mitogeni (MAPK) [ 116].
L’inibizione dell’attività o dell’espressione della COX-2 da parte di alcuni antinfiammatori è dovuta all’interferenza con i meccanismi di segnalazione che regolano il gene COX-2. In questo gene, sono stati identificati quattro fattori di trascrizione tra cui NF-κB, proteina legante CCAAT/enhancer (C/EBP), proteina attivatore 1 (AP-1) e proteina legante CRE (CREB) come regolatori della trascrizione COX-2. [22,126]. NF-κB e MAPK sono di interesse attuale in quanto potenziali bersagli nelle terapie formano diversi sintomi infiammatori.
NF-κB è un regolatore trascrizionale costituito da omo ed eterodimeri di proteine (p65 o RelA, p50/p105, c-Rel, p52/p100 e RelB). NF-κB è mantenuto come forma latente nel citoplasma delle cellule dove è complessato alla proteina inibitrice IκB. Sono stati identificati sette membri della famiglia di proteine IκB e comprende IκB-α. All’attivazione di NF-κB, IκB-α viene fosforilata dalle IκB chinasi (IKK) portando alla degradazione proteasoma-dipendente di IκB, che consente una rapida traslocazione di NF-κB nel nucleo dove si lega al DNA. Il dimmer NF-κB attivato più predominante è p65:p50. La traslocazione di p65:p50 nel nucleo porta alla trascrizione di diversi geni proinfiammatori, come le citochine (TNF-α, IL-1β, IL-6) e gli enzimi inducibili (iNOS e COX-2) [127,128].
Nei macrofagi e in altri tipi di cellule, LPS attiva tre sottoclassi di MAPK: chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK), chinasi c-Jun-terminale (JNK) e p38. Gli studi hanno rivelato che alcuni composti sono in grado di sopprimere le citochine proinfiammatorie e NF-κB, di inibire l’espressione di COX-2 e iNOS inibendo alcuni di questi MAPKS [129,130,131].
I recettori attivati dal proliferatore dei perossisomi (PPAR) sono fattori di trascrizione attivati dal ligando che appartengono alla superfamiglia dei recettori ormonali nucleari, che comprende anche i recettori per la vitamina D, la vitamina A, l’ormone tiroideo, gli acidi biliari e gli ormoni steroidei. La sottofamiglia PPAR comprende tre isotipi, PPARα, PPARβ/δ e PPARγ, che svolgono vari ruoli nel metabolismo dei lipidi e dei carboidrati, nella proliferazione e differenziazione cellulare e nell’infiammazione [132,133].
Le attività antinfiammatorie dei PPAR sono parzialmente effettuate dall’inibizione di NF-κB. I PPAR sono in grado di attenuare la funzione di NF-κB interferendo con la capacità di attivazione della trascrizione del complesso NF-κB o regolando i geni che sopprimono l’attivazione di NF-κB. Per interazione fisica con i componenti del complesso NF-κB, PPARα altera il legame di NF-κB al DNA e la successiva attivazione dei geni infiammatori. In secondo luogo, l’attivazione di PPARα determina un aumento dell’espressione di IκB, la proteina inibitoria che impedisce il trasferimento di NF-κB al nucleo [134,135]. Inoue et al. (2000) [136] considerano che l’espressione di COX-2 è regolata da un circuito di feedback negativo, mediato da PPARγ, specialmente nei macrofagi, indicando che PPARγ partecipa al controllo specifico del tipo cellulare dell’espressione di COX-2.
Solo gli oli essenziali di Teucrium brevifolia Schreber e Teucrium montbretii Benth. ssp. heliotropiifolium (Barbey) Davis da un gruppo di quattro studi ha effettivamente inibito la produzione di NO indotta da LPS nella linea cellulare di macrofagi RAW 264.7. Spathulenol e δ-cadinene predominavano in Teucrium brevifolia mentre carvacrolo e cariofillene ossido dominavano in Teucrium montbretii. Tali componenti si sono rivelati di grande importanza sull’inibizione della produzione di NO e, quindi, sull’inibizione dell’infiammazione, poiché i componenti principali delle restanti specie di Teucrium erano cariofillene e 4-vinil guaiacolo in Teucrium flavum L., e carvacrolo e cariofillene in Teucrium polium sp. capitatum (L.) Arcangeli [137].
Gli oli essenziali di Fortunella japonica var. margarita (GumGyul) e Citrus sunki (JinGyul), che il limonene predominava in entrambi i tipi di oli, hanno anche inibito notevolmente la produzione di NO indotta da LPS nelle cellule RAW 264.7 in modo dose-dipendente, indicando che avevano effetti antinfiammatori, secondo gli autori [138].
Incubazione di cellule RAW 264.7 con Origanum ehrenbergii Boiss. olio, in cui predominavano timolo e p-cimene, ha indotto un significativo effetto inibitorio sulla produzione di NO indotta da LPS. Origanum syriacum L. composto prevalentemente da carvacrolo e timolo non ha mostrato tale capacità [139]. Tuttavia, possono essere riportati più esempi di inibizione di NO, ad esempio la produzione di NO è stata inibita anche dall’olio essenziale di scarto di scorza di agrumi nei macrofagi RAW 264.7 attivati da LPS [140], o dall’olio di Distichoselinum tenuifolium (Lag.) Garcia Martin & Silvestre, composto principalmente da mircene, che inibisce significativamente la produzione di NO stimolata da LPS nei macrofagi, dimostrando, quindi, proprietà antinfiammatorie in vitro [141].
PGE2 è stato inibito solo dalle cellule J774.A1 dei macrofagi stimolati da LPS quando trattato con alte concentrazioni di (-)-linalolo. Lo stesso è stato osservato per l’espressione di COX-2. Lo stesso monoterpene ha inibito il rilascio di NO ma non ha inibito l’aumento dell’espressione di iNOS, indicando che l’attività inibitoria del linalolo è stata principalmente attribuita all’attività dell’enzima iNOS [142].
Oltre all’effetto dell’olio essenziale di Cryptomeria japonica sulle cellule RAW 264.7 trattate con LPS, che presentavano una notevole inibizione di IL-1β, IL-6 e TNF-α, come riportato sopra, gli autori hanno anche rilevato un’inibizione della produzione di NO riducendo l’espressione della proteina iNOS e dell’mRNA iNOS nonché una diminuzione della PGE2 dovuta alla riduzione della proteina COX-2 e dell’espressione dell’mRNA COX-2 [115].
Gli effetti inibitori dell’olio essenziale di Silberlocke di Abies koreana Horstmann, costituito principalmente da acetato di bornile, limonene e α-pinene, sui mediatori proinfiammatori (NO e PGE2) erano correlati alla modulazione dell’espressione di iNOS e COX-2, poiché l’espressione di iNOS e COX-2 mRNA e le proteine iNOS e COX-2 sono stati ridotti [143].
Kim et al. (2008) [144], con una concomitante inibizione dell’espressione di iNOS e COX-2 mRNA, potrebbe spiegare l’attività antinfiammatoria di questo olio. Gli stessi autori in un altro lavoro, e utilizzando l’olio essenziale di Illicium anisatum L., costituito principalmente da 1,8-cineolo, hanno anche dimostrato la sua capacità di inibire la produzione di NO e PGE2 in cellule RAW 264.7 stimolate da LPS, insieme alla diminuzione di Proteine iNOS e COX-2 ed espressione dell’mRNA di iNOS e COX-2 [145].
Dopo l’iniezione di carragenina nella zampa di ratto, il trattamento sistemico con α-humulene e (-)-trans-cariofillene ha inibito notevolmente l’espressione sia di COX-2 che di iNOS. I possibili meccanismi coinvolti non sono stati eseguiti dagli autori [114].
α-umulene e trans-cariofillene, i principali costituenti di Cordia verbenacea, inibiscono l’attivazione di NF-kB indotta da LPS e la migrazione dei neutrofili nella zampa di ratto, tuttavia non sono in grado di inibire l’attivazione della chinasi MAP indotta da LPS [113].
Gli oli essenziali di diverse specie di Pimpinella e i loro isolati sono stati in grado di inibire la trascrizione di NF-kB indotta dal forbolo miristato acetato (PMA) nelle cellule SW1353. Tuttavia, non presentavano attività simili. L’attività più notevole è stata riportata per tre specie di Pimpinella e cinque composti puri: Pimpinella corymbosa Boiss., Pimpinella tragium Vill. ssp. polyclada (Boiss. et Heldr. Tutin), Pimpinella rhodanta Boiss. oli e 4-(2-propenil)fenilangelato, 4-(3-metil-ossiranil)feniltiglato, 4-metossi-2-(3-metilossiranil)fenil isobutirrato, 4-metossi-2-(3-metil-ossiranil)fenillangelato e epossipseudoisoeugenol-2-metilbutirrato [146]. Questi risultati hanno anche indicato l’importanza di una struttura comune (parte epossifenilpropanoide) presente in alcuni di questi composti puri per la migliore attività antinfiammatoria.
Inibizione della produzione di citochine mediata dalla cinnamaldeide trovata da Chao et al. (2008) [111], e sopra riportato, può essere, almeno in parte, dovuto alla riduzione del rilascio di ROS così come di quelli di JNK ed ERK all’interno dei macrofagi J774A.1 stimolati da LPS.
Gli oli essenziali di frutta di Cinnamomum insularimontanum Hayata e citrale hanno dimostrato di possedere significativi effetti inibitori sulla produzione di NO nelle cellule RAW 264.7 stimolate da LPS. Citrale ha mostrato un’attività inibitoria nell’espressione della proteina iNOS indotta da LPS, non trovata per COX-2. Gli autori hanno studiato l’effetto del citrale sulla via NF-kB per illuminare il meccanismo dell’inibizione mediata dal citrale della trascrizione di iNOS. Gli autori hanno concluso che il citrale potrebbe prevenire la degradazione di IκBα nell’infiammazione indotta da LPS e ridurre i livelli di p50 NF-κB nelle frazioni nucleari [121]. In un altro studio, è stato riportato che nelle cellule U937 simili ai macrofagi umani, il citrale sopprime sia l’mRNA della COX-2 indotta da LPS che l’espressione della proteina, in modo dose-dipendente. Inoltre, il citrale ha indotto l’espressione dell’mRNA del PPARα e del PPARγ, suggerendo che il citrale attiva PPARα eγ e regola l’espressione di COX-2 [147]. Lo stesso comportamento è stato osservato per il carvacrolo. Nelle cellule U937 simili ai macrofagi umani, il carvacrolo ha soppresso l’espressione dell’mRNA e della proteina della COX-2 indotta da LPS, suggerendo che il carvacrolo regola l’espressione della COX-2 attraverso il suo effetto agonistico su PPARγ [132]. Tuttavia, questa proprietà del carvacrolo non era così notevole come quella del citrale [147].
L’olio essenziale di Artemisia fukudo Makino, costituito principalmente da α-tujone, β-tujone, canfora e cariofillene, attenua l’infiammazione indotta da LPS sopprimendo l’attivazione di NF-κB e MAPK nei macrofagi RAW 264.7. L’olio essenziale nell’infiammazione indotta da LPS agisce attraverso la riduzione della fosforilazione di IκBα e il blocco di NF-κB e la traslocazione delle unità p50 e p65 nel nucleo. Lo stesso olio ha anche soppresso l’attivazione indotta da LPS della fosforilazione di ERK, JNK e p38 MAPK [116].
Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr e Perry oil non solo hanno inibito significativamente la secrezione indotta da LPS di citochine pro-infiammatorie, TNF-α e IL-1b, nelle cellule RAW 264.7, come riportato sopra, ma hanno anche soppresso l’espressione di mRNA di TNF- a e IL-1b, nonché l’attivazione trascrizionale indotta da LPS bloccata di NF-κB e la traslocazione nucleare della subunità p65 [103].
In un breve rapporto, Chainy et al. (2000) [148] hanno descritto che anetolo, eugenolo e isoeugenolo inibiscono l’attivazione di NF-κB indotta da TNF-α nelle cellule ML1-a. Gli stessi autori hanno anche riferito che l’anetolo ha inibito la degradazione di IκBα, bloccando la sua fosforilazione nelle cellule ML1-a stimolate dal TNF. Nelle stesse cellule e con la stimolazione del TNF, l’anetolo non ha indotto la fosforilazione della MAP chinasi. Oltre a NF-κB e MAP chinasi, l’anetolo ha anche bloccato JNK e AP-1 indotti da TNF.
Il fattore di risposta alla crescita precoce-1 (Erg-1) è un fattore di trascrizione che svolge un ruolo regolatore nell’espressione di molti importanti geni dell’infiammazione (citochine, molecole di adesione cellulare e immunorecettori). La linea cellulare monocitaria umana THP-1 viene spesso utilizzata come modello per i macrofagi tissutali. Zhou et al. (2007) [149] hanno mostrato che l’1,8-cineolo ha inibito la sintesi di Egr-1 e la localizzazione nucleare indotta da LPS nelle cellule THP-1 ma non ha influenzato l’espressione di NF-κB indotta da LPS nei nuclei. Pertanto, gli autori hanno concluso che l’1,8-cineolo può bloccare preferenzialmente l’effetto di Egr-1 inibendo la sintesi di Egr-1 e prevenendo l’internalizzazione nucleare di Egr-1 invece dell’inibizione di NF-κB [149]. Alcuni autori hanno riferito che l’α-pinene ha chiaramente inibito la traslocazione della proteina NF-κB/p65 nei nuclei delle cellule THP-1 stimolate da LPS,
L’olio essenziale delle foglie di Juniperus oxycedrus L. della flora iberica, costituito principalmente da α-pinene, ha mostrato una grande inibizione della produzione di NO indotta da IL-1 nella linea cellulare condrocitica umana C-28/12. Lo stesso olio e una frazione ricca di α-pinene hanno ridotto notevolmente la degradazione e la fosforilazione di IκBα indotte da IL-1, l’attività di legame di NF-κB-DNA e la produzione di NO [152].
collegamento di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6259136/
Maggiori informazioni: Minoli Aponso et al, Gli effetti ansiolitici degli oli essenziali possono coinvolgere la regolazione antiossidante degli effetti pro-ossidanti dell’acido ascorbico nel cervello, Neurochemistry International (2021). DOI: 10.1016/j.neuint.2021.105153
