SARS-CoV-2 altera l’RNA dell’ospite umano per migliorare l’attività virale

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I risultati dello studio dei ricercatori dell’Agenzia per la scienza, la tecnologia e la ricerca di Singapore (A*STAR), la Duke-NUS Medical School di Singapore e la Yong Loo Lin School of Medicine della National University di Singapore hanno scoperto in modo allarmante che la SARS- Il coronavirus CoV-2 è in grado di destabilizzare e anche alterare l’RNA dell’ospite umano per consentirgli di migliorare la propria idoneità virale.

Il team di studio ha studiato la struttura dell’RNA e le interazioni RNA-RNA di SARS-CoV-2 di tipo selvatico (WT) e mutante (Δ382) nelle cellule utilizzando piattaforme Illumina e Nanopore.
 
Il team ha identificato dodici elementi strutturali potenzialmente funzionali all’interno del genoma SARS-CoV-2 e ha osservato che gli RNA subgenomici possono formare strutture diverse e che i genomi del virus WT e Δ382 si piegano in modo diverso.
 
Utilizzando il sequenziamento della legatura di prossimità, il team di studio ha identificato centinaia di interazioni RNA-RNA all’interno del genoma del virus e tra il virus e gli RNA dell’ospite.
 
Il team ha scoperto che il genoma SARS-CoV-2 si lega fortemente agli RNA mitocondriali e ai piccoli nucleolari ed è ampiamente 2′-O-metilato.

I siti di 2′-O-metilazione sono arricchiti nelle regioni virali non tradotte, associati ad un aumento delle interazioni a coppie di virus e sono diminuiti negli mRNA dell’ospite dopo l’infezione da virus, suggerendo che il virus sequestra il macchinario di metilazione dagli RNA dell’ospite verso il suo genoma.
 
I risultati dello studio sono stati pubblicati sulla rivista peer review:  Nature Communications . https://www.nature.com/articles/s41467-021-25357-1
 
Il team di studio ha sostanzialmente mappato le interazioni tra l’RNA del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave e l’RNA dell’ospite.

Il team ha scoperto che il nuovo coronavirus metila pesantemente il suo genoma utilizzando il meccanismo di metilazione dell’RNA ospite, portando a un miglioramento dell’idoneità virale. Nel processo gli RNA dell’ospite umano vengono destabilizzati e anche alterati.
 
Il coronavirus SARS-CoV-2, l’agente patogeno eziologico della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), è un virus a RNA con involucro, senso positivo, a singolo filamento con una dimensione del genoma di circa 30 kb. Il genoma virale codifica quattro proteine ​​strutturali, comprese le proteine ​​dell’involucro, della membrana, del nucleocapside e della punta, necessarie per il germogliamento virale e i processi di ingresso delle cellule ospiti.
 
È importante sottolineare che il genoma del virus codifica più proteine ​​accessorie che sono vitali per mantenere il ciclo di vita virale all’interno delle cellule ospiti. In particolare, la replicazione dell’RNA virale mediata da proteine ​​accessorie porta alla generazione di un genoma virale completo e di più RNA subgenomici (sgRNA). L’RNA e gli sgRNA virali a lunghezza intera interagiscono con le proteine ​​e gli RNA della cellula ospite per regolare la propagazione virale all’interno delle cellule infette.   
 
Dal suo debutto a Wuhan in Cina nel dicembre 2019, SARS-CoV-2 ha acquisito più di 12.000 mutazioni, portando all’emergere di più varianti virali. Sebbene le mutazioni spike siano predominanti nel  genoma SARS-CoV-2, alcune mutazioni di delezione nella regione ORF8 sono state identificate in molti paesi, tra cui Singapore, Australia, Bangladesh, Taiwan e Spagna.
 
È stato riscontrato che, in particolare a Singapore, è stata trovata una delezione di 382 nucleotidi (Δ382) nel genoma virale, che causa il troncamento di ORF7 e la delezione di ORF8. Rispetto al SARS-CoV-2 di tipo selvatico, le varianti contenenti 382 inducono infezioni relativamente lievi nei pazienti infetti.
 
Tuttavia, nonostante le infezioni lievi, i danni che provoca all’ospite umano a lungo termine e anche le condizioni mediche che possono insorgere nel tempo non sono state ancora stabilite né studiate in dettaglio.

La destabilizzazione e le alterazioni degli RNA dell’ospite umano sono destinate a provocare l’insorgere di condizioni mediche a lungo termine.
 
Per lo studio, i ricercatori hanno studiato le interazioni RNA-RNA tra il mutante SARS-CoV-2 di tipo selvatico e il mutante Δ382 all’interno delle cellule ospiti. Inoltre, hanno esaminato le interazioni ospite-virus per identificare gli elementi funzionali nel genoma virale.
 
In particolare, hanno utilizzato varie tecniche di RNA ad alto rendimento per esaminare le strutture secondarie all’interno del genoma virale. Inoltre, il team di studio aveva condotto il sequenziamento della legatura di prossimità per identificare le interazioni RNA dell’ospite – RNA virale all’interno delle cellule infette.
 
I risultati osservati hanno indicato che sia il virus di tipo selvatico che il mutante Δ382 mantengono una struttura genomica altamente stabile e coerente con un ripiegamento alternativo limitato all’interno delle cellule ospiti. 

Dodici elementi funzionali e strutturali sono stati identificati all’interno del genoma virale. Inoltre, sono state identificate un totale di 21 regioni a singolo filamento che potrebbero essere potenzialmente utilizzate per il trattamento di COVID-19 utilizzando approcci di targeting per siRNA.
 
Per quanto riguarda le interazioni a coppie attraverso il genoma virale, il team di ricerca ha identificato 237 e 187 interazioni intramolecolari rispettivamente nel virus di tipo selvatico e nel mutante Δ382.
 
È importante sottolineare che la maggior parte di queste interazioni erano interazioni a lungo raggio formate in modo transitorio (> 1 kb). Con ulteriori analisi, è stato osservato che i siti di pausa ribosomiale contengono più interazioni a coppie, indicando che le strutture dell’RNA svolgono un ruolo vitale nella regolazione della traduzione del genoma virale.
 
Attraverso un’analisi dettagliata e confrontando i genomi del virus di tipo selvatico e del mutante Δ382, è stato osservato che queste interazioni a coppie sono disposte in modo differenziale in due virus. Inoltre, sono state osservate differenze strutturali nell’RNA genomico e nell’sgRNA tra il virus di tipo selvatico e il mutante Δ382.
 
Anche l’analisi di sequenziamento a lettura lunga condotta nello studio ha rivelato che gli sgRNA hanno strutture diverse dall’RNA genomico a lunghezza intera e che diversi sgRNA potrebbero ottenere disposizioni strutturali diverse nonostante condividano le stesse sequenze.
 
Tra i vari sgRNA, lo sgRNA ORF7b ha mostrato il più alto single-stranded sia nel virus di tipo selvatico che nel mutante Δ382.
 
È anche importante prendere nota del fatto che sono stati identificati un totale di 374 e 334 RNA dell’ospite che hanno interagito con i genomi del virus di tipo selvatico e del mutante Δ382, rispettivamente.
 
È stato riscontrato che le interazioni più elevate sono state osservate tra l’RNA virale e gli RNA mitocondriali dell’ospite e i piccoli RNA nucleari. Dopo l’infezione da SARS-CoV-2, sono state osservate una traduzione preferenziale e una stabilizzazione di forti interattori.
 
Significativamente tra i piccoli RNA nucleari identificati, SNORD27 ha mostrato l’interazione più forte con l’RNA virale. Questo RNA è noto per regolare la 2′-O-metilazione dell’RNA ribosomiale 18 S. Come osservato nello studio, l’interazione tra SNORD27 e l’RNA virale ha determinato un’estesa 2′-O-metilazione del genoma virale, che era 19 volte superiore alle modifiche osservate negli mRNA dell’ospite.
 
Gli RNA dell’ospite umano che hanno interagito con l’RNA virale hanno mostrato una metilazione più elevata, mentre non è stata osservata alcuna modifica nei siti che si trovavano lontano. Ciò indica che il virus sequestra il meccanismo di metilazione dagli RNA dell’ospite verso il suo genoma. 

A causa di una perdita generalizzata di 2′-O-metilazione sull’RNA dell’ospite, è stata osservata una riduzione dell’RNA cellulare durante l’infezione virale.
 
In modo allarmante, lo studio evidenzia l’importante osservazione che SARS-CoV-2 cattura gli enzimi di metilazione dell’RNA delle cellule ospiti per destabilizzare l’RNA ospite e ridurne l’abbondanza. Questi cambiamenti nelle cellule ospiti facilitano successivamente la replicazione virale e migliorano l’idoneità virale.
 
Ulteriori studi dettagliati sono necessari urgentemente per sapere come le “interruzioni” in queste cellule ospiti umane influenzeranno le condizioni di salute a lungo termine.
 
Le implicazioni per Long COVID e le gravi condizioni mediche che possono insorgere a lungo termine sono estremamente preoccupanti.


Sono stati riportati test PCR positivi continui o ricorrenti per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in campioni prelevati da pazienti settimane o mesi dopo il recupero da un’infezione iniziale (1-17). Sebbene sia stata recentemente segnalata una reinfezione in buona fede con SARS-CoV-2 dopo il recupero (18), studi di coorte con soggetti tenuti in stretta quarantena dopo essersi ripresi da COVID-19 hanno suggerito che almeno alcuni casi “ripositivi” non erano causata da reinfezione (19, 20).

Inoltre, nessun virus competente per la replicazione è stato isolato o diffuso da questi pazienti positivi alla PCR (1-3, 5, 6, 12, 16) e la causa della produzione prolungata e ricorrente di RNA virale rimane sconosciuta. SARS-CoV-2 è un virus a RNA a filamento positivo. Come altri beta-coronavirus (SARS-CoV-1 e coronavirus correlato alla sindrome respiratoria mediorientale), SARS-CoV-2 impiega una RNA polimerasi RNA-dipendente per replicare il suo RNA genomico e trascrivere gli RNA subgenomici (21-24).

Una possibile spiegazione per la continua rilevazione dell’RNA virale SARS-CoV-2 in assenza di riproduzione del virus è che, in alcuni casi, copie di DNA di RNA virali subgenomici possono integrarsi nel DNA della cellula ospite mediante un meccanismo di trascrizione inversa. La trascrizione delle copie integrate del DNA potrebbe essere responsabile di test PCR positivi molto tempo dopo che l’infezione iniziale è stata eliminata.

Infatti, sequenze di virus a RNA non retrovirali sono state rilevate nei genomi di molte specie di vertebrati (25, 26), con diverse integrazioni che mostrano segnali coerenti con l’integrazione di copie di DNA di mRNA virali nella linea germinale tramite retrotrasposoni di antichi elementi nucleari intercalati (LINE) (rivisto in rif. 27).

Inoltre, i virus a RNA non retrovirali come il virus della stomatite vescicolare o il virus della coriomeningite linfocitica (LCMV) possono essere retrotrascritti in copie di DNA da una trascrittasi inversa endogena (RT) e le copie di DNA delle sequenze virali hanno dimostrato di integrarsi nel DNA dell’ospite cellule (28⇓-30). Inoltre, è stato dimostrato che gli RNA cellulari, ad esempio i trascritti di APP umani, sono retrotrascritti dalla RT endogena nei neuroni con i risultanti frammenti di APP integrati nel genoma ed espressi (31).

Gli elementi LINE1 umani (∼17% del genoma umano), un tipo di retrotrasposoni autonomi, che sono in grado di retrotrasporre se stessi e altri elementi non autonomi come l’Alu, sono una fonte di RT endogeno cellulare (32-34). È stato dimostrato che gli elementi endogeni di LINE1 sono espressi nei tessuti umani invecchiati (35) e la retrotrasposizione somatica mediata da LINE1 è comune nei pazienti oncologici (36, 37). Inoltre, l’espressione di LINE1 endogeno e di altri retrotrasposoni nelle cellule ospiti è comunemente up-regolata in caso di infezione virale, inclusa l’infezione da SARS-CoV-2 (38-40).

In questo studio, dimostriamo che le sequenze SARS-CoV-2 possono integrarsi nel genoma della cellula ospite mediante un meccanismo di retroposizione mediato da LINE1. Forniamo la prova che le sequenze virali integrate possono essere trascritte e che, in alcuni campioni di pazienti, la maggior parte delle trascrizioni virali sembra derivare da sequenze virali integrate.

link di riferimento: https://www.pnas.org/content/118/21/e2105968118

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