Italia: i ricercatori hanno riscontrato la prevalenza di SARS-CoV-2 nei molluschi bivalvi provenienti dalle aree di raccolta della regione Campania

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Le autorità italiane e i ricercatori del Dipartimento di Coordinamento per la Sicurezza Alimentare-Istituto Zooprofilattico Sperimentale, del Dipartimento di Sicurezza Alimentare, Nutrizione e Sanità Pubblica Veterinaria-Istituto Superiore di Sanità e del Dipartimento di Ambiente e Salute-Istituto Superiore di Sanità hanno riscontrato in un nuovo studio allarmante la prevalenza del virus SARS-CoV-2 attivo nei frutti di mare, compresi i molluschi bivalvi nelle aree di raccolta intorno alle coste di Francia e Spagna.

I molluschi bivalvi sono prontamente contaminati da agenti patogeni umani presenti nelle acque interessate dalle acque reflue municipali e la rilevazione di SARS-CoV-2 nelle feci di pazienti infetti e nelle acque reflue ha attirato l’attenzione sulla possibile presenza del virus nei bivalvi.

Lo scopo di questo studio era di raccogliere dati sulla prevalenza di SARS-CoV-2 nei molluschi bivalvi provenienti dalle aree di raccolta della regione Campania. Un totale di 179 campioni sono stati raccolti tra settembre 2019 e aprile 2021 e sono stati testati utilizzando RT-PCR digitale a goccia (dd RT-PCR) e RT-PCR in tempo reale. Combinando i risultati ottenuti con diversi saggi, la presenza di SARS-CoV-2 è stata rilevata in 27/179 (15,1%) dei campioni.

Una concentrazione virale mediana di 1,1 × 102 e 1,4 × 102 gc/g è stata ottenuta utilizzando rispettivamente Orf1b nsp14 o RdRp/gene E. I risultati positivi sono stati distribuiti in modo non uniforme tra le aree di raccolta e nel tempo, i campioni positivi sono stati più frequenti dopo gennaio 2021.

Il sequenziamento parziale della regione della punta è stato ottenuto per cinque campioni, uno dei quali mostrava mutazioni caratteristiche della variante Alpha (lignaggio B.1.1.7). Questo studio conferma che i molluschi bivalvi possono bioaccumulare SARS-CoV-2 a livelli rilevabili e che possono rappresentare un approccio prezioso per monitorare SARS-CoV-2 nei corpi idrici e per monitorare le tendenze delle epidemie e la diversità virale.

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Figura 1.  ( A ) Percentuale di campioni positivi per SARS-CoV-2 in base ai siti di campionamento. ( B ) Distribuzione dei siti di campionamento nel Golfo di Napoli (regione Campania, Italia).

Tabella 3.  Rilevazione di SARS-CoV-2 in campioni di molluschi bivalvi in ​​base al sito di campionamento.

Sito di campionamentoPosizione sulla costaRilevamento SARS-CoV-2
N° di campioni positivi% di positivi nel sito% di positivi sul totale
VarcaturoNord9/22415.0
BacoliNord4/27152.2
Monte di ProcidaNord1/1470.6
PozzuoliNord0/800
NisidaNord0/1000
Subtotale Nord14/81177.8
Rada Santa LuciaCentro4/16252.2
Subtotale Centro4/16252.2
Torre del GrecoSud2/3261.1
Torre AnnunziataSud1/7140.6
Castellammare di StabiaSud1/1470.6
Subtotale Sud4/5382.2
Altre origini0/200
Raccolta illegale2/3671.1
Origine sconosciuta3/24131.7
Totale27/17915.1%

Discussione

Lo scopo del presente studio era l’indagine della presenza di SARS-CoV-2 nei molluschi bivalvi della regione Campania, al fine di accertare la prevalenza e la concentrazione del virus e indagare sul possibile utilizzo dei molluschi per il monitoraggio della diffusione del SARS-CoV-2. L’ambiente costiero è soggetto alla contaminazione da un’ampia varietà di virus umani provenienti dalle acque reflue, che possono essere bioaccumulati da specie di molluschi filtratori.

Alcuni autori hanno ipotizzato una possibile contaminazione da SARS-CoV-2 delle acque costiere e di altri comparti ambientali, come estuari e habitat marini, così come la possibilità di utilizzare i molluschi come sentinelle del loro ambiente [12,17]. 

Sebbene il monitoraggio di SARS-CoV-2 negli scarichi fognari debba essere considerato la prima scelta per il biocontrollo, i bivalvi potrebbero essere utilizzati come strumento di sorveglianza, soprattutto in caso di sorgenti non puntuali, scarichi diretti di acque reflue in piccoli estuari e difficoltà nel campionamento [31].

Inoltre, la continua attività di filtraggio dei molluschi bivalvi, modellando la loro capacità di bioaccumulare contaminanti chimici e microbici, può aiutare a superare i limiti dell’analisi delle acque reflue derivanti dalla bassa concentrazione del bersaglio virale e dalla limitata sensibilità analitica. Alcune specie come le cozze (Mytilus spp.) sono già ampiamente utilizzate come bioindicatori per il monitoraggio dell’inquinamento delle acque costiere [32]. Per questi motivi, i bivalvi hanno buone caratteristiche per essere considerati sentinelle per la rilevazione del SARS-CoV-2 nell’ambiente costiero.

Va notato che l’esistenza di molecole di RNA che si legano con matrici di biofilm fornisce una prolungata persistenza di RNA nell’ambiente (eRNA) e contribuisce alla conservazione dell’eRNA nell’ambiente marino molto più a lungo del previsto [33,34], supportandone l’uso di analisi ambientale per tracciare la diffusione virale e la variabilità genetica.

Tuttavia, in una prospettiva di valutazione del rischio, si dovrebbe considerare che mentre l’RNA SARS-CoV-2 può essere stabile nelle acque fluviali e marine, la presenza di RNA da solo non correla il virus infettivo [14,35,36]. Uno studio precedente su SARS-CoV-2 nei molluschi bivalvi di Polo et al. (2021) [12] utilizzando saggi di vitalità PCR, hanno mostrato che il rilevamento in tempo reale dell’RNA SARS-CoV-2 nelle vongole e nei sedimenti non corrispondeva a capsidi intatti e, quindi, a particelle virali infettive, e hanno concluso che il rischio di la salute pubblica associata a SARS-CoV-2 nei molluschi bivalvi è estremamente bassa, per cui i molluschi non dovrebbero essere percepiti in modo inappropriato come un rischio o un vettore di SARS-CoV-2.

Inoltre, sebbene sia stata confermata la presenza di SARS-CoV-2 RNA negli affluenti delle acque reflue, l’infettività virale dei campioni positivi nelle colture cellulari non è stata finora dimostrata [37]. Le goccioline e gli aerosol respiratori possono contenere titoli elevati di particelle virali [38,39,40] e l’infettività SARS-CoV-2 viene mantenuta per oltre 3 ore negli aerosol prodotti sperimentalmente [41].

Al contrario, è stata messa in dubbio la presenza di virus infettivi nelle feci e nelle urine: il rilevamento di SARS-CoV-2 nelle feci umane (rivisto in Foladori et al. 2020 [42]) è infatti una caratteristica comune nei soggetti infetti, ma l’isolamento di virus infettivo da questo campione clinico è stato ottenuto in un numero limitato di casi [43,44,45,46], mentre altri studi non sono riusciti a farlo [47,48,49].

Pertanto, si può ipotizzare che le feci e l’urina contengano probabilmente bassi livelli o nessuna particella infettiva di SARS-CoV-2 e che, sulla base delle basse abbondanze previste e della limitata sopravvivenza ambientale, la probabilità di trasmissione di SARS-CoV-2 anche se contaminata dalle acque reflue acqua o molluschi bivalvi è estremamente bassa o trascurabile [50].

In questo studio abbiamo scelto di applicare l’attuale metodo raccomandato ISO15216-1:2019 per la rilevazione di Norovirus ed epatite A nei molluschi, adattandolo a SARS-CoV-2, date le prove esistenti per una maggiore concentrazione di questo virus nell’apparato digerente tessuto di molluschi bivalvi [17].

In assenza di un metodo di riferimento per il test SARS-CoV-2 negli alimenti, diversi approcci analitici (dd RT-PCR e RT-PCR in tempo reale) e protocolli basati su diversi target genetici (regione Orf1b nsp14, RdRp, gene E, e il gene N) sono stati inclusi nello studio, per fornire una migliore stima della prevalenza di SARS-CoV-2. 

Inoltre, per confermare inequivocabilmente il rilevamento di SARS-CoV-2 ed eseguire la caratterizzazione molecolare, tutti i risultati positivi ottenuti mediante dd RT-PCR o RT-PCR in tempo reale sono stati sottoposti a RT-PCR nidificata convenzionale seguita dal sequenziamento.

Complessivamente, la presenza di SARS-CoV-2 è stata rilevata in 27/179 (15,1%) dei campioni, con una concentrazione virale mediana nei campioni positivi di ~102 gc/g, indipendentemente dal dosaggio applicato. Questi risultati confermano, sebbene con una prevalenza significativamente inferiore, lo studio di Polo et al. (2021) [12] sulla presenza di SARS-CoV-2 nelle vongole e nei sedimenti raccolti dalle aree degli estuari in Galizia (Spagna) tra maggio e luglio 2020, in cui l’RNA SARS-CoV-2 è stato rilevato in 9/12 vongole e 3/ 12 campioni di sedimenti. Al contrario, un’indagine simile condotta su ostriche prelevate tra aprile e agosto 2020 da diverse aree delle coste francesi non ha riportato alcun rilevamento di SARS-CoV-2 in oltre 180 campioni [17].

I risultati di questi studi, tuttavia, dovrebbero essere considerati tenendo conto della concentrazione del bersaglio virale nella matrice dei molluschi. La concentrazione virale nei molluschi bivalvi può essere significativamente influenzata dalla carica virale nelle acque di crescita, che è una funzione sia dell’input virale attraverso lo scarico delle acque reflue che della dispersione del virus nelle acque marine a causa dell’effetto di diluizione e della circolazione dell’acqua.

I due studi intrapresi in Francia e Spagna sono stati condotti su campioni raccolti nella primavera e nell’estate 2020, in corrispondenza della cosiddetta prima ondata della pandemia di COVID-19. Il nostro studio comprendeva un periodo di osservazione più lungo (da settembre 2019 ad aprile 2021) ed evidenzia che, anche se SARS-CoV-2 era rilevabile da febbraio 2020 (cioè all’inizio della pandemia di COVID-19 in Italia) ed è rimasto stabile durante il nell’intero 2020, il numero dei campioni positivi è aumentato da gennaio 2021, a seguito della cosiddetta seconda ondata dell’epidemia.

Questo risultato riflette probabilmente un aumento delle scariche virali nelle acque reflue, e di conseguenza nelle acque di mare, associato all’aumento dei casi di infezione nella popolazione della regione Campania, come indicato dalle tendenze riportate dal sistema nazionale di sorveglianza per il COVID-19.

Lo scarico delle acque reflue, tuttavia, può avere un impatto diverso sulle aree di raccolta dei molluschi bivalvi, in base alla dispersione delle particelle virali nell’acqua di mare (distanza dalla fonte di contaminazione, effetti di diluizione, corsi d’acqua, effetti delle maree, ecc.). 

Nel nostro studio sono state incluse le aree di produzione lungo l’intero litorale della regione Campania (90 km) ed è stata osservata una significativa variabilità nella rilevazione di SARS-CoV-2 tra aree relativamente vicine della parte settentrionale del litorale, dove il virus è stato rilevato in 41 % di campioni provenienti dal sito ‘Varcaturo’ (il sito più vicino ai maggiori impianti di depurazione della regione), nel 15% di quelli prelevati a ‘Bacoli’, e mai rilevati nei siti ‘Pozzuoli’ e ‘Nisida’. SARS-CoV-2 è stato rilevato anche in una quota significativa di campioni raccolti nel sito ‘Rada Santa Lucia’, il più vicino al centro urbano di Napoli.

In effetti, i siti di campionamento in cui è stato rilevato SARS-CoV-2 nei molluschi bivalvi rappresentano i punti di incontro di più sistemi fognari. La positività rilevata su “Rada Santa Lucia”, ad esempio, è da attribuire al contributo di una vasta area ad alta densità abitativa. In questo sito le acque reflue trattate provenienti da due sistemi fognari contribuiscono insieme a generare l’esposizione sui mitili.

Il virus è stato invece rilevato in una minoranza di campioni raccolti nei tre siti nella parte meridionale della costa. Questi risultati evidenziano che ci si può aspettare un’elevata variabilità per il rilevamento di SARS-CoV-2 a seconda delle caratteristiche dei siti di campionamento e possono far luce sulle differenze nella prevalenza e concentrazione di SARS-CoV-2 nel nostro studio, eseguito principalmente sui mitili (Mytilus galloprovincialis) coltivato in aree situate a circa 3 km dalla costa, rispetto all’opera di Polo et al. (2021) [12], che hanno testato vongole (Ruditapes philippinarum) coltivate in argini situati in piccoli estuari influenzati dalle maree e relativamente vicini a impianti di trattamento delle acque reflue o stazioni di pompaggio delle acque reflue.

Oltre alle variabili associate alla concentrazione di SARS-CoV-2 nelle acque in crescita, problemi analitici possono influenzare il rilevamento di SARS-CoV-2 in matrici alimentari complesse come i molluschi bivalvi. Nel nostro studio, la concentrazione virale era, con poche eccezioni, inferiore a 1 gc/µL di RNA testato, quindi in un intervallo di concentrazione vicino al limite di rilevabilità dei test molecolari, un fattore che, a causa della probabilità statistica, può influenzare il rilevamento del bersaglio.

Questo effetto, insieme alla variabilità intrinseca dell’efficienza di amplificazione dei diversi saggi PCR, spiega in parte l’incoerenza dei risultati ottenuti con i diversi protocolli e il fatto che solo una minoranza di campioni (5 su 19 considerando i risultati dd RT-PCR) erano positivi da due o più saggi.

È interessante notare che, nonostante la bassa concentrazione target, l’amplificazione mediante RT-nested-PCR e la caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento parziale del gene spike è stata ottenuta in cinque campioni. In tutti questi casi, l’amplificazione è stata ottenuta utilizzando saggi PCR per frammenti corti (ID PCR 973 e 975, ~ 320 bps) ma non con il saggio progettato per amplificare ~ 1600 bps del gene spike (ID PCR 980).

Questo risultato non è sorprendente, poiché l’amplificazione di frammenti lunghi in matrici complesse come alimenti o campioni ambientali è spesso impegnativa, a causa della bassa concentrazione target e della frammentazione degli acidi nucleici. Significativamente, le amplificazioni ottenute hanno mostrato un’identità di sequenza del 100% al ceppo prototipo SARS-CoV-2 (sequenza di Wuhan) in quattro campioni raccolti tra gennaio e aprile 2021, ma hanno anche mostrato due mutazioni (N501Y e A570D) tipiche del cosiddetto ‘UK variant’, poi ribattezzata ‘Alpha variant’ secondo la nomenclatura dell’OMS (https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/, consultato il 5 settembre 2021), in un campione raccolto a marzo 2021, cioè a meno di tre mesi dal primo isolamento, a dicembre 2020, di questa Variante d’interesse (VOC) in Italia (https://press.regione.puglia.

collegamento di riferimento: https://www.mdpi.com/1660-4601/19/2/943/htm

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