COVID-19: il farmaco camostat mesilato previene la perdita dell’olfatto e del gusto

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La perdita dell’olfatto e del gusto – un sintomo caratteristico del COVID-19 – non era nella mente di un gruppo di ricercatori della Yale School of Medicine quando hanno intrapreso uno studio nella primavera del 2020.

Gli scienziati, guidati da Joseph Vinetz, MD, specialista in malattie infettive, erano interessati a scoprire se un farmaco orale usato per trattare la pancreatite potesse ridurre la carica virale (la quantità di virus nel corpo) di SARS-CoV-2 e migliorare sintomi nelle persone con nuova diagnosi di COVID-19.

Lo studio, che è disponibile su un sito di prestampa e non è stato ancora pubblicato su una rivista peer-reviewed, è stato condotto da giugno 2020 ad aprile 2021.

Ha dimostrato che il farmaco, chiamato camostat mesilato, ha fatto poco per ridurre la carica virale. Ma, con sorpresa dei ricercatori, ha portato un diverso tipo di beneficio. “I pazienti che hanno ricevuto il farmaco non hanno perso l’olfatto o il gusto. Questo è stato un fattore ‘wow'”, afferma il dottor Vinetz.

Questo è importante perché la perdita dell’olfatto, nota come anosmia, e la perdita del gusto sono sintomi comuni di COVID-19. Per molti, i sensi ritornano quando l’infezione svanisce. Ma per altri, l’effetto persiste in vari gradi. (Con la variante omicron, questi sintomi possono ancora verificarsi, ma non così spesso come con altre varianti.)

Come è stata scoperta la scoperta della “sorpresa” sulla perdita del gusto e dell’olfatto

Il dottor Vinetz afferma di essere stato originariamente motivato a esaminare il mesilato di camostat dopo aver visto uno studio dell’aprile 2020 pubblicato su  Cell  che mostrava come questo medicinale potrebbe impedire a SARS-CoV-2 di entrare nelle cellule.

Il Dr. Vinetz ha reclutato diversi colleghi per collaborare, tra cui Anne Spichler Moffarah, MD, Ph.D., specialista in malattie infettive, e Gary Desir, MD, presidente del Dipartimento di Medicina Interna. Geoffrey Chupp, MD, direttore dello Yale Center for Asthma and Airways Disease, ha condotto la sperimentazione clinica.

Lo studio randomizzato di Fase II ha arruolato 70 partecipanti risultati positivi al COVID-19 entro tre giorni dall’inizio dello studio. I partecipanti hanno assunto la medicina quattro volte al giorno per sette giorni.

Sebbene lo studio sia stato interrotto una volta che è stato chiaro che l’obiettivo principale di ridurre la carica virale non si stava verificando, i ricercatori ritengono che i risultati a sorpresa sulla perdita dell’olfatto e del gusto giustifichino ulteriori studi.

“Mia figlia ha avuto il COVID un anno fa e ha ancora problemi a annusare e ad assaggiare le cose”, afferma il dottor Desir. “Questo farmaco sembra essere in grado di modulare quella perdita dell’olfatto e del gusto. Ha pochissimi effetti collaterali ed è stato ampiamente studiato. Questo potrebbe essere il tipo di trattamento che viene somministrato a qualcuno con COVID all’inizio dell’infezione”.

Se il farmaco dovesse essere approvato per questo scopo, i medici ritengono che potrebbe essere un punto di svolta. “Non sarebbe un farmaco costoso. La nostra idea era che tutti l’avrebbero presa se fosse stata diagnosticata perché è difficile prevedere chi perderà l’olfatto o il gusto, ed è meglio prevenirlo piuttosto che aspettare che accada”, afferma il dottor Desir.

Ulteriori vantaggi trovati per le persone con COVID-19

C’erano anche altri benefici di questo farmaco, poiché lo studio ha mostrato che coloro che lo hanno ricevuto hanno riportato notevoli miglioramenti legati alla fatica, rispetto a coloro che hanno ricevuto un placebo.

“Le persone che hanno ricevuto camostat mesilato durante lo studio hanno iniziato a sentirsi meno stanche e in generale meglio dopo il quarto giorno, il che era statisticamente diverso dal gruppo placebo”, afferma il dottor Vinetz. “E non ci sono stati essenzialmente effetti avversi nel gruppo del mesilato camostat”.

Non è noto se il mesilato di camostat possa aiutare a ripristinare il senso del gusto o dell’olfatto in qualcuno che lo ha perso, aggiunge. “Più studi ci aiuterebbero in questo”, afferma il dottor Chupp.

Affinché il camostat mesilato diventi disponibile per l’uso nella prevenzione della perdita del gusto o dell’olfatto correlata al COVID-19, sarebbe necessario uno studio clinico di Fase III e una domanda presentata alla Food and Drug Administration (FDA) per l’uso di emergenza autorizzazione. Tutto ciò richiederebbe del tempo, spiega il dottor Chupp.

Tuttavia, i medici sperano che la loro scoperta a sorpresa possa avere un impatto positivo sulla lotta contro il COVID-19. “Un farmaco come il camostat mesilato rappresenta un’opportunità”, afferma il dottor Chupp.


 Il metabolita Camostat mesilato GBPA mostra una ridotta inibizione del TMPRSS2 ricombinante

Numerosi studi mostrano che Camostat mesilato viene rapidamente convertito nel suo metabolita attivo, acido 4-(4-guanidinobenzoilossi)fenilacetico (GBPA) negli animali e nell’uomo, seguito da un’ulteriore conversione di GBPA nel metabolita inattivo acido 4-guanidinobenzoico (GBA) [18 , 19, 20,[50]] (Fig. 6a).

Tuttavia, la capacità della GBPA di inibire l’attività enzimatica di TMPRSS2 non è stata esaminata. Per rispondere a questa domanda, abbiamo confrontato l’inibizione del TMPRSS2 ricombinante da parte di Camostat mesilato, GBPA e GBA. Per questo, abbiamo utilizzato FOY-251, un metansolfonato di GBPA, che è prontamente disponibile in commercio.

Abbiamo scoperto che FOY-251 esercitava una capacità ridotta di 10 volte di inibire TMPRSS2 rispetto a Camostat mesilato, sebbene entrambi i composti sopprimessero completamente l’attività di TMPRSS2 a 1 µM o superiore (Fig. 4). Al contrario, GBA era meno attivo (Fig. 4). Pertanto, FOY-251 blocca l’attività di TMPRSS2 ma con un’efficienza ridotta rispetto al mesilato di Camostat.

Fig 4
Fig. 4 Camostat mesilato e FOY-251 inibiscono l’attività del ricombinante TMPRSS2. L’incubazione del TMPRSS2 ricombinante con il substrato peptidico Boc-Gln-Ala-Arg-MCA porta alla scissione del substrato e al rilascio del fluoroforo AMC(7-Amino-4-metilcumarina), risultando in un segnale fluorescente. I dati sono stati normalizzati rispetto ai segnali di fluorescenza ottenuti in assenza di composti in esame (Camostat mesilato, FOY-251, GBA). I dati concentrazione-risposta per ciascun composto in esame sono stati tracciati e modellati da un adattamento logistico a quattro parametri per determinare la concentrazione efficace del 50% (EC 50) valore. È stata visualizzata l’attività inibitoria di Camostat mesilato (blu), FOY-251 (azzurro) e GBA (rosso) contro la proteina ricombinante TMPRSS2 e l’adattamento della curva è stato eseguito utilizzando GraphPad Prism. Viene mostrata la media di due replicati biologici, ciascuno eseguito con quattro (Camostat mesilato e FOY-251) o due replicati tecnici (GBA). I valori di EC 50  erano 4 nM (Camostat mesilato), 70 nM (FOY-251), >10 µM (GBA). (PPT)

Al fine di ottenere informazioni sulla ridotta attività inibitoria di FOY-251, abbiamo studiato l’inibizione di TMPRSS2 da parte di GBPA a livello molecolare. Per questo, abbiamo utilizzato una combinazione di ampie simulazioni di dinamica molecolare (MD) di tutti gli atomi e la modellazione di Markov del complesso TMPRSS2-GBPA [[32]].

I farmaci contenenti guanidinobenzoato come Camostat mesilato e GBPA inibiscono TMPRSS2 formando prima un precomplesso non covalente che viene poi catalizzato per formare un complesso covalente di lunga durata che è la principale fonte di inibizione [[32]]. Tuttavia, la popolazione del precomplesso di breve durata è direttamente correlata all’attività inibitoria [[32]].

Calcolando la cinetica di legame TMPRSS2-GBPA [[32]], troviamo che (i) il complesso TMPRSS2-GBPA non covalente è metastabile, il che lo rende adatto a formare un complesso inibitorio covalente e (ii) la sua popolazione è del 40% inferiore rispetto a Camostat a pari concentrazioni di farmaco, coerentemente con la constatazione che FOY-251 è un inibitore vitale ma meno potente (Fig. 4). Strutturalmente, troviamo che GBPA si lega allo stesso modo di Camostat (Fig. 5, [[32]]).

La principale interazione stabilizzante è il suo gruppo guanidinio che si lega alla tasca S1 di TMPRSS2, che è stabilizzata da un ponte salino transitorio con Asp-435. Il gruppo estere GBPA può interagire con il catalitico Ser-441, rendendolo incline alla catalisi e alla formazione del complesso catalitico. La stabilità leggermente inferiore del GBPA rispetto al complesso Camostat mesilato-TMPRSS2 è coerente con la coda più corta del GBPA, che ha meno possibilità di interagire con il cerotto idrofobico sul sito di legame TMPRSS2 mostrato in Fig. 5, pannello di sinistra.

Fig 5
Fig. 5 Dominio della proteasi TMPRSS2 e interazione GBPA. Un modello di struttura TMPRSS2 è mostrato nel pannello di sinistra, il sito attivo è evidenziato in ciano e i residui della triade catalitica sono mostrati in nero. La struttura rappresentativa della GBPA legata a TMPRSS2 in un complesso reattivo è mostrata nel pannello di destra. La testa di guanidinio GBPA forma un ponte salino con Asp-435 all’interno della tasca S1. Questo complesso transitorio, che è simile per Camostat, tende a essere catalizzato dal legame estere che interagisce con Ser-441, portando a un complesso covalente con TMPRSS2 inibito.

 Camostat mesilato e FOY-251 inibiscono l’infezione da SARS-CoV-2 con efficienza comparabile

Abbiamo infine confrontato l’attività antivirale di Camostat mesilato e FOY-251, il metansolfonato di GBPA, nella coltura cellulare. La ridotta capacità di FOY-251 di bloccare l’attività enzimatica del TMPRSS2 ricombinante rispetto a Camostat mesilato suggerirebbe che il composto dovrebbe anche esercitare una ridotta attività antivirale. D’altra parte, l’analisi dell’attività antivirale comprende la preincubazione delle cellule bersaglio con Camostat mesilato per 2 ore in presenza di FCS, che consente la conversione di Camostat mesilato in GBPA, come dimostrato sopra.

In effetti, esperimenti di titolazione con pseudotipi VSV e cellule polmonari Calu-3 come bersagli hanno rivelato che l’inibizione dell’ingresso da parte di FOY-251 era solo leggermente ridotta rispetto a Camostat mesilato, con valori di EC 50  di 107 nM (Camostat mesilato) e 178 nM (FOY- 251) (Fig. 7). Inoltre, non sono state osservate differenze marcate nell’inibizione dell’infezione delle cellule Calu-3 con SARS-CoV-2 autentico (Fig. 8a).

Infine, sia Camostat mesilato che FOY-251, così come un altro promettente inibitore della serina proteasi per il trattamento delle infezioni da SARS-CoV-2, Nafamostat mesilato, hanno inibito l’infezione da SARS-CoV-2 di fette di polmone tagliate di precisione (PCLS) ex vivo, e ancora una volta non sono state osservate differenze sostanziali nell’efficienza di inibizione tra Camostat mesilato e FOY-251 (Fig. 8B). Pertanto, nelle condizioni scelte, Camostat mesilato e GBPA hanno esercitato un’attività antivirale all’incirca comparabile, probabilmente a causa della conversione di Camostat mesilato in GBPA.

Fig 7
Fig. 7Camostat mesilato e FOY-251 inibiscono l’ingresso di cellule guidate da SARS-2-S con efficienza comparabile. Le cellule Calu-3 sono state pre-incubate con diverse concentrazioni di Camostat mesilato (pannello di sinistra), FOY-251 (pannello di destra) o DMSO (controllo, indicato da linee tratteggiate) per 2 ore, prima di essere inoculate con particelle di pseudotipo recanti VSV-G (rosso) o SARS-2-S (blu). In alternativa, al fine di analizzare i potenziali effetti negativi di Camostat mesilato e FOY-251 sulla vitalità cellulare (barre grigie), le cellule hanno ricevuto un mezzo invece di particelle di pseudotipo e sono state ulteriormente incubate. A 16 ore dall’inoculazione, l’ingresso dello pseudotipo e la vitalità cellulare sono stati analizzati misurando l’attività della luciferasi codificata dal virus nei lisati cellulari o nei livelli intracellulari di adenosina trifosfato (test CellTiter-Glo), rispettivamente. I dati sono stati ulteriormente normalizzati e l’efficienza di ingresso/la vitalità cellulare in assenza di Camostat mesilato e FOY-251 è stata impostata al 100%. Vengono mostrati i dati medi (medi) ottenuti da tre repliche biologiche, ciascuna eseguita con quattro repliche tecniche. Le barre di errore indicano SEM. Il significato statistico delle differenze nell’efficienza di ingresso/vitalità cellulare in Camostat mesilato – o cellule trattate con FOY-251 rispetto alle cellule trattate con controllo è stato analizzato mediante ANOVA a due vie con il posttest di Dunnett (Valori P  , da sinistra a destra: Camostat/VSV-G [0,9999; 0,9999; 0,9996; 0,9733; 0,9986]; Camostato/SARS-2-S [0,0001; 0,0001; 0,0001; 0,0001; 0,0001]; Camostato/Vitalità cellulare [0,9999; 0,9999; 0,9999; 0,9998; 0,9810]; FOY-251/VSV-G [0,9997; 0,9730; 0,8867; 0,8838; 0,0326]; FOY-251/SARS-2-S [0,0001; 0,0001; 0,0001; 0,0001; 0,0001]; FOY-251/Vitalità cellulare [0,9986; 0,9765; 0,9455; 0,9460; 0,9612]).
Fig 8
Fig. 8 Camostat mesilato e FOY-251 inibiscono l’infezione da SARS-CoV-2 con efficienza comparabile. ( a) Le cellule Calu-3 sono state pre-incubate per 2 ore con doppia concentrazione di Camostat mesilato o FOY-251 come indicato. Le cellule trattate con DMSO sono servite come controllo. Successivamente, le cellule sono state infettate da SARS-CoV-2. Dopo 1 ora di incubazione, l’inoculo è stato rimosso e le cellule sono state lavate con PBS, prima dell’aggiunta del mezzo di coltura contenente inibitore o DMSO. I supernatanti di coltura sono stati raccolti a 24 ore dopo l’infezione e sottoposti a un test di formazione della placca standard. I titoli virali sono stati determinati come unità formanti placca per ml (pfu/ml). Vengono presentati i dati di un singolo esperimento eseguito con triplicati tecnici e i risultati sono stati confermati in un esperimento separato con un altro isolato SARS-CoV-2. Le barre di errore indicano la deviazione standard. ( b) Le fette polmonari tagliate con precisione (PCLS) di quattro donatori sono state pretrattate con 0,5 o 5 µM di Camostat mesilato, FOY-251 o Nafamostat mesilato prima di essere inoculate con SARS-CoV-2. PCLS trattato con DMSO fungeva da controllo. Dopo 1 ora di incubazione, l’inoculo è stato rimosso e il PCLS è stato lavato con PBS, prima che fosse aggiunto il mezzo di coltura contenente il rispettivo inibitore (o DMSO). I supernatanti di coltura sono stati raccolti a 24 ore dopo l’infezione e sottoposti a un test di formazione della placca standard. Vengono presentati i dati di quattro repliche biologiche, ciascuna eseguita con quattro (donatore 1) o tre (donatore 2-4) repliche tecniche. Le barre di errore indicano il SEM. Per l’analisi statistica è stata utilizzata l’ANOVA unidirezionale con il posttest di Dunnett. P valori, da sinistra a destra: 0,5 µM Camostat [0,1551]; 0,5 µM FOY-251 [0,9919]; 0,5 µM Nafamostat [0,0006]; 5 µM camostato [0,0003]; 5 µM FOY-251 [0,0010]; 5 µM Nafamostat [0,0001]).

link di riferimento: https://www.thelancet.com/journals/ebiom/article/PIIS2352-3964(21)00048-7/fulltext


Ulteriori informazioni:  Geoffrey Chupp et al, Uno studio randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo di fase 2 di Camostat mesilato orale per il trattamento precoce dei pazienti ambulatoriali COVID-19 ha mostrato un decorso di malattia più breve e un’attenuazione della perdita di olfatto e gusto (2022). DOI: 10.1101/2022.01.28.22270035

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