Ricercatori indiani della città di Bangalore (Bengaluru) nel Karnataka, in India, hanno scoperto in un nuovo studio che la niacinamide o la vitamina B3 (niacina) possono essere utilizzate per potenziare un antivirale naturale negli esseri umani chiamato catelicidina (LL37) per distruggere la membrana del SARS-CoV-2, inibendone così la replicazione.
I risultati dello studio sono stati pubblicati su un server di prestampa e sono attualmente in fase di revisione paritaria. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.08.26.505399v1
Un esempio calzante è la pelle che esprime Ace2 nell’epidermide in vivo5 e cheratinociti in vitro (Fig S1A), ma tuttavia non è considerata una via primaria di infezione6. A sostegno di ciò, l’esposizione dei cheratinociti epidermici umani a SARS-CoV-2 non provoca un’infezione produttiva (Fig. S1B).
Pertanto, sebbene i cheratinociti epidermici siano competenti per l’infezione da SARS-CoV-2, possono possedere un meccanismo di difesa endogeno per inibire l’infezione virale. La pelle possiede un meccanismo di difesa basale dotato della secrezione costitutiva di peptidi antimicrobici (AMP)7.
In particolare, è stato dimostrato che la catelicidina umana AMP (LL37) ha come bersaglio varie classi di virus8,9, compresi i virus respiratori10. I cheratinociti cutanei mostrano un livello basale più elevato di secrezione di LL37 rispetto alle cellule epiteliali polmonari (Fig S1C), che potrebbe essere uno dei fattori che portano alla loro minore infettività da parte di SARS-CoV-2 (Fig S1B).
Per accertare se LL37 è efficace contro SARS-CoV-2, abbiamo incubato il virus con questo AMP e valutato la sua capacità di infettare una cellula epiteliale intestinale (Caco2) come reporter. Abbiamo osservato una diminuzione dose-dipendente dell’espressione genica virale dopo il trattamento con LL37 (Fig. 1A).
Questo effetto mediato da LL37 è stato osservato anche in altre varianti SARS-CoV-2 (alfa, kappa, delta e omicron) (Fig. 1B). Queste osservazioni sono state confermate dai saggi della dose infettiva di coltura tissutale (TCID50) (Fig S1D). Il lavoro precedente ha suggerito che LL37 può interagire con la proteina spike e il recettore ACE2 e possibilmente occludere la superficie di interazione tra di loro
11. Tuttavia, è stato anche dimostrato che LL37 interagisce e si aggrega sulle membrane12. Quindi, abbiamo ipotizzato che LL37 possa inibire l’infezione virale in modo indipendente da Spike/Ace2. Abbiamo quindi confrontato la capacità neutralizzante di LL37 contro virus di diverso tropismo, ovvero particelle di lentivirus pseudotipizzate VSV-G e S1. Abbiamo osservato una riduzione comparabile della trasduzione quando entrambe le particelle di lentivirus pseudotipiche sono state trattate con quantità crescenti di LL37 (Fig S1E).
Questi risultati sono coerenti con i rapporti secondo cui LL37, un peptide cationico, può svolgere la sua attività antimicrobica attaccando la membrana caricata negativamente di patogeni13. I virus avvolti come il coronavirus che assemblano i virioni germogliando dalla membrana del reticolo endoplasmatico hanno una membrana caricata negativamente a causa di un contenuto più elevato di fosfatidilserina (PS)14,15.
Per imitare la composizione della membrana di un coronavirus generico, abbiamo preparato tre diverse vescicole in cui la composizione del PS è stata variata in base all’intervallo pubblicato di virioni derivati da ER15 (Fig S1F). Abbiamo osservato che l’aumento della percentuale di PS ha comportato un aumento della carica superficiale negativa sulle vescicole (Fig S1F), che è stata neutralizzata dalla presenza di LL37 (Fig S1G).
Questi risultati suggeriscono che il peptide caricato positivamente può rivestire il lembo esterno del doppio strato mediante interazioni elettrostatiche. Per determinare la conseguenza dell’interazione di LL37 con le vescicole, abbiamo valutato se l’integrità della membrana fosse compromessa. Utilizzando un test di rottura della membrana basato sul trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) (mostrato schematicamente in Fig. S1H), abbiamo osservato una riduzione del FRET (recupero della fluorescenza a 530 nm) quando le vescicole sono state trattate con LL37 (Fig. 1C).
Questi risultati indicano che LL37 è più efficace nell’interazione e nell’interruzione delle membrane con una carica negativa più elevata (Fig S1F). Rapporti precedenti hanno anche indicato che l’interruzione delle membrane delle vescicole da parte di polimeri caricati positivamente porta all’aggregazione delle vescicole16. Abbiamo quindi studiato se l’interruzione degli pseudovirus e SARS-CoV-2 da parte di LL37 comporterebbe la loro aggregazione che porta ad un aumento della dimensione delle particelle misurata dalla diffusione dinamica della luce (DLS). Coerentemente con l’effetto riportato dei polimeri cationici sulle membrane caricate negativamente, abbiamo osservato un aumento della dimensione delle particelle di SARS-CoV-2 (Fig 1D) e del virus pseudotipato (VSV-G e Spike) (Fig S1I) dopo il trattamento con LL37 .
La gravità della malattia di diverse infezioni respiratorie virali è stata inversamente correlata ai livelli 17 di LL37. Poiché è stato dimostrato che il carico salivare di SARS-CoV-2 è correlato alla gravità della malattia nei pazienti 18, abbiamo confrontato i livelli di LL37 secreto nella saliva della SARS -Individui infetti e non infetti da CoV-2 (informazioni sul paziente in (Fig S1J). Gli individui sintomatici avevano in media circa 3 volte meno LL37 rispetto agli individui non infetti (Fig. 1E). È interessante notare che i pazienti asintomatici positivi avevano livelli equivalenti di LL37 come individui non infetti. Questi risultati suggeriscono che livelli più bassi di LL37 possono potenzialmente rendere gli individui più suscettibili a un’infezione sintomatica.
Figura 1. Attività antivirale di LL37 contro le varianti SARS-CoV-2 (A) Effetto dell’aumento delle concentrazioni di LL37 sulla neutralizzazione di SARS-CoV-2 (qRT-PCR) (n=3) (B) Effetto di LL37 sull’infettività
di varie varianti di SARS-CoV-2 (qRT-PCR) (n=3) (C) Saggio di rottura della membrana che utilizza virus come vescicole, imitando la membrana virale e la concentrazione di PS (FRET) (n=3) (D) Analisi della dimensione delle particelle di SARS-CoV-2 in presenza di LL37 (DLS) (n=3) (E) Misurazione di LL37 in varie coorti di pazienti (ELISA) (Un totale di 41 individui sono stati suddivisi in negativi (16), positivi sintomatici (13) , e coorti asintomatiche positive (12)) [L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando ANOVA a una via (A, D), ANOVA a due vie (B, C) e test di Kruskal Wallis (ANOVA non parametrica) (E), * p≤0,05, **p≤0,001, ***p≤0,0001]
Poiché livelli più bassi di LL37 sono associati al gruppo di pazienti sintomatici COVID-19 (Fig. 1E), abbiamo ipotizzato che l’aumento del livello di LL37 o il miglioramento dell’attività dell’LL37 esistente potrebbero servire come potenziale mezzo per combattere l’infezione da SARS-CoV-2 . Un metodo per migliorare l’attività di LL37 è diminuire la sua intrinseca autoaggregazione12 e quindi aumentare la sua biodisponibilità. Un approccio comune per prevenire l’aggregazione è attraverso l’uso di un idrotropo come la niacinamide (vitamina B3). È una sostanza generalmente considerata sicura (GRAS) utilizzata per aumentare la solubilità, e quindi l’attività, di vari farmaci19. In effetti, abbiamo osservato che LL37 integrato con niacinamide mostrava una maggiore potenza contro l’infezione da diverse varianti di SARS-CoV-2 (Fig. 2A, S2A).
Per comprendere il meccanismo dell’interazione di LL37 con le membrane lipidiche in presenza di niacinamide, abbiamo utilizzato simulazioni di dinamica molecolare atomistica (MD). Le nostre simulazioni supportano la solubilizzazione idrotropica di LL37 mediante una soluzione acquosa di niacinamide. Abbiamo scoperto che la niacinamide si associa transitoriamente principalmente ai residui idrofobici e non polari di LL37 (Fig S2B) mediante interazioni sia aromatiche-π che van der Waals. Questi includevano prevalentemente residui di fenilalanina (Phe5, Phe6, Phe17 e Phe27) e isoleucina (Ile20 e Ile24) (Figura 2B), che mediano l’autoaggregazione di LL-37 e l’attività ridotta20. Le nostre simulazioni suggeriscono che l’incapsulamento dei residui inclini all’aggregazione di LL37 da parte della niacinamide migliorerebbe probabilmente la biodisponibilità del peptide.
Inoltre, abbiamo impiegato la simulazione della dinamica molecolare per studiare le prime fasi dell’adsorbimento di LL37 su membrane simili a buste virali in presenza di niacinamide. Queste simulazioni dimostrano le catene aciliche lipidiche e i gruppi di testa che interagiscono con il peptide LL37 (immagine in alto Fig 2C). In accordo con la letteratura precedente21, queste interazioni trascinano il peptide nella membrana determinando un assottigliamento locale del doppio strato e, infine, una drammatica destabilizzazione della membrana (Fig.
2C in basso, Fig S2C), con una concomitante destabilizzazione dell’ordinamento dei lipidi (Fig S2D). Questa configurazione significava che i residui di amminoacidi carichi di LL37 si trovavano di fronte al solvente ed erano liberi di interagire con la niacinamide (S2E). Inoltre, questa simulazione prevede che anche la niacinamide penetri nella membrana (Fig 2D) e possa sinergizzarsi con LL37 per interrompere la membrana. Pertanto, concludiamo che la niacinamide ha una doppia attività: (i) aumentare idrotropicamente la solubilità acquosa di LL37, rendendola così più biodisponibile e; (ii) cooperare con il peptide per destabilizzare la membrana.
Per convalidare questi risultati computazionali, abbiamo eseguito un test di rottura della membrana basato su FRET utilizzando membrane virali artificiali (come descritto in Fig S1F, H) in presenza di LL37 e niacinamide. Coerentemente con le previsioni di simulazione, abbiamo osservato che l’interruzione della membrana dei liposomi da parte di LL37 è stata potenziata in combinazione con niacinamide (Figura 2E), mentre la niacinamide di per sé non era antivirale. Per verificare se l’effetto della niacinamide può essere riprodotto con AMP prodotti naturalmente, abbiamo analizzato il suo effetto sugli AMP che sono altamente secreti nella saliva22 e dalla pelle7.
Abbiamo scoperto che la saliva umana mostra attività antivirale contro SARS-CoV-2, che può essere potenziata con l’integrazione con niacinamide (Fig. 2F). Allo stesso modo, abbiamo anche osservato che gli scrub per la pelle integrati con niacinamide mostravano attività antivirale (Fig. S2C).
Il nostro corpo sintetizza naturalmente la niacinamide, ma è interessante notare che le vie biosintetiche e il precursore che portano alla produzione di niacinamide sono sottoregolati nei pazienti sintomatici di COVID-1923. Pertanto, la supplementazione esogena di niacinamide nei pazienti sintomatici può potenziare l’attività degli AMP prodotti naturalmente dagli epiteli del corpo.
Figura 2. Effetto della niacinamide sull’attività antivirale di LL37 (A) Espressione genica virale a diverse concentrazioni di LL37 in presenza di niacinamide (qRT-PCR) (n=3) (B) Contributo di ciascun residuo di LL37 all’interazione con niacianamide da simulazioni MD (media di 3 simulazioni indipendenti, errori propagati da ciascun replicato). I residui che contribuiscono > 1 kJ/mol sono etichettati (C) Il peptide LL37 viene profondamente incorporato nella membrana in 200 ns (in alto ). Lo spessore della membrana rappresentativo è stato mediato negli ultimi 20 ns di simulazioni MD in assenza e presenza del peptide LL37 ( rispettivamente in basso a sinistra ea destra ). La scala dei colori indica lo spessore della membrana in nm. (D) Istantanea rappresentativa (a sinistra) di niacinamide che penetra più in profondità dell’acqua nel nucleo idrofobico della membrana (LL37, peptide nero; catene aciliche lipidiche, linee grigie; niacinamide, riempimento dello spazio; acqua, arancio) che è quantificato a destra , mediando la densità molecolare (membrana, nero; niacinamide, verde; acqua, arancione) sull’intera traiettoria di 200 ns (5 replicati, media ± DS) (E) Saggio di rottura della membrana con aggiunta di LL37 e niacinamide (FRET) (n=3) (F) Effetto della niacinamide oltre alla saliva sulla neutralizzazione di SARS-CoV-2 (TCID50) (n=4) [L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t dello studente per (A), ANOVA a due vie per (E) e ANOVA a una via per (F ), *p≤0,05, **p≤0,001, ***p≤0,0001]
È stato riportato che le varianti che mostrano una maggiore trasmissibilità e gravità della malattia contengono mutazioni nel dominio di legame del recettore (RBD) della proteina spike24. Dato il loro ruolo chiave nella mediazione dell’ingresso virale nella cellula ospite, molti vaccini sono stati sviluppati con antigeni derivati dalla proteina spike e le mutazioni rappresentano un serio problema con la fuga del vaccino25. Inoltre, il pesante rivestimento di glicani delle proteine spike può essere un meccanismo per camuffarle dal sistema immunitario26. Un approccio per aggirare questi problemi consiste nel prendere di mira l’involucro virale che ha origine dalla cellula ospite ed è quindi conservato tra le diverse varianti.
Del tutto, mostriamo che l’AMP LL37 ha il potenziale per neutralizzare l’infezione virale SARS-CoV-2 prendendo di mira il suo involucro e la niacinamide migliora ulteriormente questa attività antivirale del peptide. I nostri dati sui campioni di pazienti sintomatici confermano ulteriormente questa ipotesi e sostengono un approccio che comporterebbe il miglioramento dell’efficacia dei peptidi antimicrobici per la protezione contro le infezioni virali.
Pertanto, la somministrazione esogena dell’AMP con niacinamide o altre strategie per aumentare la produzione endogena del peptide in combinazione con niacinamide potrebbero essere un metodo potente non solo per bloccare la trasmissione virale, ma potrebbe essere una terapia efficace per limitare la carica virale e la gravità della malattia di un paziente dopo l’infezione. I nostri dati sui campioni di pazienti sintomatici confermano ulteriormente questa ipotesi e sostengono un approccio che comporterebbe il miglioramento dell’efficacia dei peptidi antimicrobici per la protezione contro le infezioni virali.
Pertanto, la somministrazione esogena dell’AMP con niacinamide o altre strategie per aumentare la produzione endogena del peptide in combinazione con niacinamide potrebbero essere un metodo potente non solo per bloccare la trasmissione virale, ma potrebbe essere una terapia efficace per limitare la carica virale e la gravità della malattia di un paziente dopo l’infezione.
I nostri dati sui campioni di pazienti sintomatici confermano ulteriormente questa ipotesi e sostengono un approccio che comporterebbe il miglioramento dell’efficacia dei peptidi antimicrobici per la protezione contro le infezioni virali. Pertanto, la somministrazione esogena dell’AMP con niacinamide o altre strategie per aumentare la produzione endogena del peptide in combinazione con niacinamide potrebbero essere un metodo potente non solo per bloccare la trasmissione virale, ma potrebbe essere una terapia efficace per limitare la carica virale e la gravità della malattia di un paziente dopo l’infezione.
