Precedenti infezioni virali, inclusa l’influenza H3N2, possono causare la gravità del COVID-19 a causa dell’interferenza antigenica

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I risultati di un nuovo studio indicano che l’interferenza antigenica o AIN da una precedente infezione virale potrebbe essere alla base di alcuni casi di gravità della malattia COVID-19.
 
I risultati dello studio sono stati pubblicati sulla rivista peer review: PLoS ONE. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0272163

I test hanno misurato i livelli di IgG e IgM αEp9 da pazienti con αEp9(+) il cui plasma è stato raccolto in vari momenti dell’esordio post-sintomo (PSO). Coerentemente con i segni distintivi di AIN che traccia una precedente infezione, i livelli di αEp9 IgG sono apparsi elevati già a un giorno di PSO in un paziente. Livelli di IgG simili sono stati osservati nella popolazione di pazienti per più di 4 settimane (ANOVA unidirezionale, p = 0,321); quindi, αEp9 IgG è iniziato alto ed è rimasto alto. Anche i livelli di αEp9 IgM tra i pazienti in vari momenti PSO erano simili (ANOVA unidirezionale, p = 0,613).

I segnali misurati per i livelli di αEp9 IgM erano significativamente inferiori ai livelli equivalenti di αEp9 IgG (t-test, p = 0,0181) (S1 Fig); questa differenza potrebbe riflettere una minore affinità, quantità o entrambe le IgM. Poiché lo studio si concentra sull’identificazione del legame dell’epitopo da parte di Abs sovraregolato nei pazienti positivi a SARS-CoV-2, non possiamo discernere tra un singolo Ab o una popolazione di Abs con lo stesso profilo di legame. Inoltre, l’osservazione che l’epitopo Ep9 è preso di mira da anticorpi IgG e IgM suggerisce che possono esistere più anticorpi con profili di legame simili nei pazienti SARS-CoV-2. Pertanto, ci riferiamo ai paratopi anti-Ep9 come appartenenti ad una popolazione di Abs in sieri.

Le ricerche di sequenze e omologhi strutturali di Ep9 utilizzando i database pBLAST [11] e VAST [12] hanno suggerito antigeni primari candidati. Sono stati identificati un omologo strutturale del betaherpesvirus 6A e altri 14 omologhi della sequenza Ep9. Inoltre, le regioni Ep9-ortologiche di sei coronavirus umani (SARS-CoV, MERS, OC43, HKU-1, NL63, 229E) sono state scelte per i saggi successivi (Fig. 1A e Tabella S1).

Per accelerare le misurazioni del legame, le potenziali regioni dell’epitopo AIN sono state subclonate in fagemidi che codificano le sequenze come fusioni con la proteina del mantello del batteriofago M13 P8. Il sequenziamento del DNA e gli esperimenti ELISA hanno dimostrato rispettivamente la clonazione di successo e la visualizzazione coerente dei fagi. Due epitopi non sono stati visualizzati sul fago e sono stati omessi dalle indagini successive (Tabella S2 e Fig S2A).

Fig 1. Potenziali epitopi di OAS per il legame di αEp9 Abs suggeriti dalla bioinformatica e testati mediante ELISA dei fagi.
(A) Cladogramma raffigurante l’omologia della sequenza della sequenza Ep9 da SARS-CoV-2 agli omologhi più vicini identificati dalla bioinformatica. Gli allineamenti di sequenza utilizzavano pBLAST e VAST e il cladogramma è stato generato da iTOL [13]. (B) Strutture del dominio di legame dell’RNA NP SARS-CoV-2 (PDB: 6M3M) e del virus dell’influenza (Infz) Una proteina NA H3N2 del 2014 (modellata da SWISS-Model [14]). SARS-CoV-2 NP evidenzia i residui Ep9 (blu chiaro e blu scuro) e la regione omologa della regione a EpNeu (blu scuro). Il modello raffigurato di Infz A 2014 H3N2 NA evidenzia l’antigene putativo EpNeu (rosa). (C) Gli ELISA hanno esaminato il legame di potenziali epitopi di OAS visualizzati dai fagi alle Ig totali da tre serie di plasma raggruppato da cinque pazienti αEp9(+) o cinque pazienti αEp9(-). Il plasma in pool di individui sani era un ulteriore controllo negativo. I colori della mappa termica rappresentano il segnale di legame medio normalizzato ai controlli negativi di sfondo fagico (segnale dal fago senza un peptide visualizzato). (D) L’espansione dei dati dal pannello C mostra i segnali ELISA dai singoli pool saggiati in modo indipendente mostra i risultati dai singoli pool (p <0,0001 per un’ANOVA a due vie che confronta il legame degli epitopi visualizzati dai fagi elencati nel pannello C a diversi gruppi di plasma raggruppato, test di Tukey ad hoc). (E) Allineamento della sequenza di amminoacidi degli omologhi Infz A NA strettamente correlati di EpNeu da pBLAST [11]. I residui blu e arancione rappresentano rispettivamente gli amminoacidi conservati e non corrispondenti rispetto all’Ep9. I residui in grassetto sono importanti per il riconoscimento degli epitopi da parte di αEp9 Abs. (F) Utilizzando EpNeu come modello di ricerca per generare sequenze omologhe (mostrate nel pannello E), gli ELISA hanno esaminato il legame degli omologhi EpNeu al plasma in pool da αEp9(+), αEp9(-) o individui sani. I dati sono rappresentati come descritto nel pannello C ( p <0, 0001 per epitopi a due vie ANOVA c visualizzati con fago, test ad hoc di Tukey e Dunnett come mostrato).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0272163.g001

Poiché i campioni dei pazienti sono stati raccolti in momenti diversi durante l’infezione dei pazienti, i livelli di Ab variavano significativamente tra i pazienti. Pertanto, i campioni dei pazienti sono stati raggruppati per i test iniziali per ridurre al minimo le concentrazioni anomale e catturare al meglio la popolazione media di Ab nei pazienti. I dati del campione raggruppato sono stati utilizzati per la prima volta per schermare la reattività crociata contro più possibili epitopi (Fig. 1C e 1F). Questi risultati sono stati quindi riesaminati con saggi di campioni di singoli pazienti (Fig. 2A).

In questi esperimenti, gli ELISA fagici hanno testato il legame degli omologhi Ep9 con αEp9 Abs. Una risposta media all’interno della popolazione di pazienti è stata valutata utilizzando plasma raggruppato da tre serie di cinque pazienti αEp9(+) e cinque αEp9(-) COVID-19 rivestiti su piastre ELISA. Il plasma proveniente da individui sani ha fornito un ulteriore controllo negativo. Confermando i risultati precedentemente riportati [10], SARS-COV-2 Ep9 e un epitopo omologo di SARS-CoV-1 (90% di somiglianza) si sono legati solo al plasma di pazienti αEp9(+). È improbabile che l’affinità αEp9 Ab per SARS-CoV-1 guidi SARS-CoV-2 AIN a causa della diffusione limitata del primo negli Stati Uniti [15]

Fig 2. Ab cross-reattivo che si lega sia a Ep9 che a EpNeu e alla previsione dell’epitopo di EpNeu.

(A) Phage ELISA utilizzando 29 pazienti con αEp9(+) COVID-19 precedentemente testati. L’ELISA ha dimostrato il legame del plasma del paziente Abs all’epitopo SARS-CoV-2, Ep9, o all’epitopo della neuraminidasi dell’influenza A, EpNeu. Plasma Abs da 16 pazienti su 29 pazienti Ep9(+) hanno mostrato un legame significativo con EpNeu. (****p<0,0001, ***p<0,001,p<0,01, *p<0,05, test di Tukey ad hoc ANOVA a due vie mostrato) Differenze significative nel legame dell’epitopo rispetto ai segnali fagici visualizzati senza peptidi sono indicati come blu per Ep9 e arancione per EpNeu. (B) Confrontando i livelli normalizzati di Ep9 e EpNeu visualizzati dai fagi che si legano ai pozzi rivestiti di plasma da singoli pazienti αEp9(+) (n = 29). Si osserva una forte correlazione, come mostrato dalle statistiche rappresentate. Ogni punto nei pannelli da A a C rappresenta i dati dei singoli pazienti. (C) Un diagramma schematico del sandwich ELISA per esaminare la reattività crociata di αEp9 Abs. Il test verifica il legame di Ab bivalente sia con Ep9 che con EpNeu. Il plasma in pool di cinque pazienti αEp9(+) o cinque pazienti αEp9(-) con altri αNP Abs è stato testato per il legame bivalente sia con Ep9 fuso con eGFP che con EpNeu visualizzato dai fagi. Il plasma di un paziente sano è stato utilizzato come controllo negativo. Per ulteriori controlli negativi, phage-FLAG ed eGFP-FLAG hanno sostituito rispettivamente Ep9 ed EpNeu (**p <0,0001 ANOVA unidirezionale, dimostrato il test ad hoc di Tukey e Dunnett, con plasma sano in presenza di EpNeu ed Ep9 come controllo negativo). Le barre di errore rappresentano SD. I singoli punti sul grafico a barre rappresentano repliche tecniche. (D) Gli strumenti di previsione dell’epitopo delle cellule B lineari e strutturali Bepipred 2.0 [16] e Discotope 2.0 [17] hanno suggerito una regione dell’epitopo lineare estesa dal virus dell’influenza A H3N2 2014 NA, inclusi gli otto residui di Ep9 Neu (azzurro) con altri dieci residui C-terminali (blu scuro). Questo epitopo esteso e previsto è chiamato EpPred. Le previsioni degli epitopi strutturali sono sottolineate. I residui su EpNeu che non sono allineati con Ep9 sono rappresentati in arancione. (E) Modello strutturale raffigurante l’influenza A H3N2 2014 NA. Il modello è stato generato utilizzando il modello SWISS basato sulla struttura NA dell’influenza A H3N2 Tanzania 2010 (PDB: 4GZS). La struttura NA evidenzia la regione EpNeu (azzurro), i residui estesi in EpPred (blu scuro), i potenziali siti di glicosilazione (rosa chiaro) e i residui S141 e K142 (rosso), che sono importanti per il riconoscimento di αEp9 Ab. (F) ELISA dose-dipendente che confronta il legame di αEp9 Abs con Ep9, EpNeu ed EpPred. Il plasma in pool di cinque pazienti αEp9(+) e cinque pazienti αEp9(-) sono stati testati in triplicati con concentrazioni variabili di epitopi fusi con eGFP. I dati dimostrano le interazioni più forti verificatesi tra αEp9 Abs ed Ep9 con una diminuzione di circa 2 volte dell’affinità di legame αEp9 Abs per EpNeu. EpPred legato leggermente più forte a αEp9 Abs rispetto a EpNeu; le differenze nelle linee di tendenza di EpNeu ed EpPred sono statisticamente significative (p<0,0001, Comparison of Fits). Le linee di tendenza rappresentano l’adattamento di regressione non lineare con l’analisi del pendio collinare.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0272163.g002

Il pannello di potenziali epitopi ha rivelato un epitopo candidato dalla proteina neuraminidasi (NA) di un ceppo di influenza A H3N2, che è circolato nel 2014 (A/Para/128982-IEC/2014, adesione n. AIX95025.1), qui denominato EpNeu. Il plasma di tre diversi pool di pazienti αEp9(+), ma non pazienti αEp9(-) né individui sani, ha legato EpNeu (p <0,0001, test Tukey ad hoc ANOVA a due vie) (Fig. 1C e 1D). Inoltre, le repliche tecniche combinate di due esperimenti indipendenti degli stessi campioni raggruppati dimostrano anche aumenti significativi del segnale di legame EpNeu da αEp9(+) plasma Abs, ma non nei pazienti αEp9(-) (EpNeu con p <0,0001, ANOVA a due vie test di Tukey ad hoc) (S1 Fig). Sebbene Ep9 ed EpNeu condividano una somiglianza della sequenza di amminoacidi del 38%,

Successivamente, è stata esplorata la specificità di αEp9 Abs che si lega a NA da diversi ceppi virali. EpNeu ha fornito un modello per ulteriori ricerche di omologhi nei database di sequenza. Le sequenze NA strettamente allineate isolate da ospiti umani, aviari e suini in Nord America sono state scelte per ulteriori analisi (Fig. 1E, Tabella S1). Le sequenze sono state visualizzate dai fagi come prima. Nonostante la loro stretta somiglianza con EpNeu (fino al 92,3% di somiglianza o solo una differenza di residuo), nessuno degli omologhi EpNeu si è legato ad Abs da pazienti αEp9(+) (Fig 1F). Una singola sostituzione dell’amminoacido EpNeu, K142N (numerazione da NA a lunghezza intera, numero di adesione AID57909.1) in un’influenza suina H1N2 (2016) ha ridotto drasticamente l’affinità di legame con Abs da pazienti αEp9(+) (p <0,0001 unidirezionale ANOVA ad hoc Turchia). Un epitopo del virus dell’influenza aviaria A H9N4 (2010) residuo mancante S141, ma includendo K142 conservato, anche notevolmente ridotto il legame con Abs da pazienti αEp9(+) (p <0,0001 ANOVA ad hoc Tukey) (Fig. 1E e 1F). Pertanto, S141 e K142 sono fondamentali per il legame con αEp9 Abs.

Esaminiamo ulteriormente se gli epitopi Ep9 ed EpNeu legano gli stessi Abs. I dati di 29 pazienti αEp9(+) hanno dimostrato una correlazione forte e altamente significativa tra i livelli di legame Abs agli epitopi Ep9 ed EpNeu nel plasma del paziente (Fig. 2A e 2B). La reattività crociata è stata confermata da un test in formato sandwich che richiede un legame bivalente e simultaneo sia con Ep9 fuso con eGFP che con EpNeu visualizzato con fago (Figure 2C, S4A e S4B). Ab cross-reattivo che lega entrambi gli epitopi Ep9 ed EpNeu nel plasma raggruppato da pazienti αEp9(+), ma non in pazienti αEp9(-) con altri αNP Abs o donatori sani è stato dimostrato. Pertanto, concludiamo che αEp9 Abs riconosce anche l’epitopo EpNeu. L’ELISA bivalente è stato condotto utilizzando il plasma del paziente in pool perché le concentrazioni di epitopi rivestite nei pozzetti della piastra per microtitolazione richiedevano l’ottimizzazione per adattarsi ai diversi livelli di Abs da ogni singolo paziente e per consentire il legame bivalente a ciascun tipo di epitopo (figura S4A). Pertanto, è stato ipotizzato che la quantità media di Abs in ciascun pool sarebbe stata simile e che non sarebbe stata necessaria l’ottimizzazione ripetuta (figura S4B).

Abbiamo quindi studiato se EpNeu potesse presentare un antigene vitale durante l’infezione con 2014 H3N2 (NCBI: txid1566483). L’analisi lineare dell’epitopo della proteina NA a lunghezza intera (Bepipred 2.0) [16] prevedeva un antigene candidato con otto residui di EpNeu, inclusi S141 e K142, e dieci residui aggiuntivi (146-155). Questa regione dell’epitopo prevista, denominata EpPred, include il residuo NA catalitico conservato D151 mirato alla neutralizzazione virale da parte del sistema immunitario [18] (Figure 2D e S5A). Una struttura del modello dell’H3N2 NA del 2014 da Swiss-Model [14, 19] e la previsione degli epitopi strutturali (Discotope 2.0) [17] ha anche identificato potenziali epitopi all’interno di EpPred (Figure 2D e 2E e S5B).

EpPred fuso con eGFP (Fig S2B) è stato analizzato con plasma raggruppato da cinque pazienti αEp9(+). I controlli includevano EpNeu ed Ep9 (positivo) e eGFP FLAG (negativo). L’αEp9 Abs si legava a Ep9 con un’affinità apparente ≈2 volte più forte rispetto a EpNeu (Fig. 2E). La maggiore forza di legame di Ep9 potrebbe derivare da ulteriori cicli di maturazione dell’affinità Ab dopo l’infezione primaria [3]. L’EpPred di lunghezza maggiore sembra migliorare leggermente dopo il legame di EpNeu con αEp9 Abs (Fig 2F). Pertanto, mentre αEp9 Abs può mirare a un epitopo più ampio di H3N2 2014 NA oltre le regioni omologhe a Ep9, il noto ostacolo alla sovraespressione di NA a lunghezza intera rende questa ipotesi difficile da testare [20]. Inoltre, gli epitopi sovraespressi battericamente analizzati qui non includono modifiche post-traduzionali. Presi insieme,

Sfortunatamente, le storie dei pazienti in genere non includono infezioni e vaccinazioni influenzali. Isolato da Para, Brasile, il ceppo H3N2 2014 ha una diffusione sconosciuta in Nord America. Tuttavia, nel 2014 è stata registrata una grave epidemia di influenza A [21, 22]. Dal momento che solo l’emoagglutinina è stata sequenziata per l’identificazione del ceppo nel 2014 [22], il ceppo AIN candidato dall’attuale indagine non può essere efficacemente rintracciato poiché era disponibile solo la sua sequenza NA. In particolare, l’omologo EpNeu del ceppo vaccino H3N2 del 2014 (identico all’influenza A 2015 H3N2 NA, numero di adesione ANM97445.1) non lega αEp9 Abs (Fig. 1E e 1F). Pertanto, αEpNeu Abs deve essere stato generato contro un’infezione primaria da virus dell’influenza, non il vaccino.

Successivamente, abbiamo analizzato il legame di Ep9 ed EpNeu da parte di αEp9 IgG rispetto ai giorni PSO (figura S6A). Le IgG αEp9 cross-reattive sono state osservate entro un giorno PSO. L’osservazione è coerente con l’ipotesi dell’imprinting, per cui le IgG mature di una precedente infezione sarebbero presenti all’inizio del corso dell’infezione. Sebbene bassi livelli di IgG αEp9 precoci legate senza reattività crociata di EpNeu siano stati osservati in un paziente a un giorno PSO, questa osservazione potrebbe derivare dal legame di EpNeu al di sotto del livello di rilevamento; αEp9 Ab si lega ad affinità inferiori a EpNeu, per esempio.

L’analisi della reattività crociata αEp9 IgG e della gravità della malattia ha dimostrato che sono stati osservati anticorpi cross-reattivi in ​​pazienti che presentavano tutti i livelli di gravità (asintomatici, ambulatoriali, ricoverati, ricoverati in terapia intensiva o deceduti) (figura S6B). Mentre il legame di EpNeu nella maggior parte dei pazienti era drasticamente inferiore rispetto al legame con Ep9, un sottogruppo di pazienti ospedalizzati o ricoverati in terapia intensiva ha dimostrato il legame di αEp9 Abs con EpNeu ed Ep9 a livelli comparabili (>50%). Tali livelli di legame Ab simili sia a Ep9 che a EpNeu non sono stati osservati in pazienti con esiti meno gravi (cioè, pazienti che erano asintomatici o avevano solo visite ambulatoriali). Tuttavia, l’86% dei campioni testati in questo studio proveniva da pazienti ricoverati in ospedale e ricoverati in terapia intensiva. Livelli simili di legame Ab sia a Ep9 che a EpNeu nel sottogruppo di pazienti ospedalizzati e ricoverati in terapia intensiva potrebbero suggerire una ridotta maturazione dell’affinità nei pazienti con esiti più gravi. È stato precedentemente dimostrato che la maturazione dell’affinità Ab alterata è correlata alla gravità del COVID-19 [23, 24]. Mentre molteplici fattori possono portare alla gravità della malattia durante COVID-19, i nostri risultati suggeriscono che la dipendenza da alti livelli di Abs influenzati da un sottogruppo di pazienti COVID-19 potrebbe essere indicativo di una risposta immunitaria meno efficace e di conseguenza di esiti della malattia più gravi.

Questo rapporto suggerisce un possibile meccanismo molecolare per AIN alla base dell’alto tasso di grave COVID-19 nei pazienti αEp9(+). In particolare, dimostriamo il legame cross-reattivo tra αEp9 Abs e un epitopo NA previsto da un ceppo di virus dell’influenza A del 2014. Studi futuri potrebbero esaminare la correlazione tra il tasso di un paese del virus dell’influenza H3N2 2014 e il grave COVID-19. Inoltre, la correlazione potrebbe essere testata utilizzando sistemi sanitari che registrano le infezioni influenzali. L’esame della conservazione dell’epitopo e della reattività crociata di Ab potrebbe prevedere le risposte immunitarie basate sull’AIN e gli esiti della malattia nelle infezioni future. L’identificazione di percorsi AIN dannosi, benigni o benefici potrebbe anche guidare la progettazione del vaccino.

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