Deformazione piastrinica indotta dalla proteina spike SARS-CoV-2

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Un nuovo studio condotto da ricercatori del National Heart, Lung, and Blood Institute, US National Institutes of Health, Stati Uniti, utilizzando la tomografia crioelettronica cellulare, ha chiaramente dimostrato che le proteine ​​​​spike del virus SARS-CoV-2 provocano la deformazione delle piastrine e provoca anche un’attivazione stocastica irreversibile che porta a coagulopatie.

La tomografia crioelettronica cellulare dettagliata ha rivelato decorazioni dense di proteina S sulla superficie piastrinica, inducendo la formazione di filopodi. Ipotizzando che la proteina S si leghi ai recettori dell’integrina che inducono la filopodia, il team di studio ha testato il legame con le integrine piastriniche che riconoscono il motivo RGD e ha scoperto che la proteina S riconosce l’integrina αvβ3.
 
I risultati dello studio sono stati pubblicati sulla rivista peer reviewed: Nature Communications.
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36279-5

SARS-CoV-2 ha mostrato sintomi patologici unici che possono portare a un’ampia gamma di eventi coagulopatici nei casi più gravi. Nel nostro studio, abbiamo sondato l’effetto diretto della proteina S sul cambiamento nella morfologia delle piastrine a livello molecolare e abbiamo visualizzato direttamente il legame della proteina S alla superficie piastrinica (riassunto in Fig. 6).

Abbiamo ipotizzato che il legame del SARS-CoV-2 sia mediato dai recettori dell’integrina sulla base dei seguenti motivi;

(1) l’attivazione delle piastrine è regolata dalla formazione di filopodi,

(2) la formazione di filopodi è iniziata dai recettori dell’integrina,

(3) i principali recettori sulle piastrine sono i recettori dell’integrina e

(4) La proteina S SARS-CoV-2 contiene una sequenza RGD nell’RBD, che è riconosciuta da un sottotipo di integrina, e quindi abbiamo testato l’interazione delle integrine espresse dalle piastrine con la proteina S.

Il nostro esperimento di inibizione dell’integrina utilizzando cilengitide e saggi di legame in fase solida in vitro supportano questa ipotesi, in particolare con la possibilità che la proteina S riconosca l’integrina αvβ3. Il legame della proteina S all’integrina era molto inferiore rispetto all’interazione delle integrine con i loro ligandi fisiologici e, curiosamente, non abbiamo rilevato il legame con la principale integrina piastrinica αIIbβ3.

In precedenza, è stato osservato un aumento del legame dell’anticorpo anti-integrina αIIbβ3 PAC-1 alle piastrine in presenza della proteina S21. Ciò può essere dovuto a un effetto inside-out, in cui la segnalazione outside-in è attivata dal legame diretto della proteina S all’integrina αvβ3 e, a sua volta, αIIbβ3 verrebbe attivata attraverso la segnalazione intracellulare (inside-out).

Supponiamo che la debole affinità della proteina S con i recettori dell’integrina piastrinica e il legame reversibile possano riflettere il fatto che i difetti di coagulazione del sangue osservati nei pazienti sono complicanze rare e si verificano in casi gravi di COVID-19.

Tuttavia, qui dovremmo anche notare che ci sono altri recettori sulle piastrine che possono anche essere responsabili dell’interazione con la proteina S33,53 e possono verificarsi anche effetti combinatori del legame della proteina S a più recettori.

In primo luogo, la proteina S si lega ai recettori sulla superficie piastrinica, provocando la deformazione e innescando l’attivazione. Le sporgenze si stanno formando come conseguenza del rimodellamento dell’actina. Ciò porta all’attivazione delle piastrine mediante la formazione di filopodi e la stabilizzazione della rete del citoscheletro. Lo schema è stato creato con Biorender.com.

SARS-CoV-2 si trova nel flusso sanguigno dei pazienti COVID-19 10 e una questione aperta è come possa portare a rari ma gravi difetti della coagulazione. Abbiamo dimostrato che la deformazione delle stesse piastrine non sempre altera la loro segnalazione intracellulare (Figura 1 supplementare) o induce l’attivazione.

Sembra piuttosto che le piastrine esposte alla proteina S siano innescate per l’attivazione su ulteriori stimoli, come l’attaccamento a una superficie di adesione. Sulla base di questa osservazione, ipotizziamo che la combinazione del legame diretto della proteina S con le piastrine e altri fattori di coagulazione identificati possa indurre un’attivazione sinergica e irreversibile delle piastrine, portando alla coagulazione.

Durante l’infezione da SARS-CoV-2, sono attivi molti altri attori procoagulanti, ad esempio la formazione di trappole extracellulari di neutrofili 18, il rilascio di TF23, livelli elevati di fibrinogeno 54 e il rilascio disregolato di citochine55, creando un ambiente ipercoagulante nel contesto di COVID- 19.

Nel nostro studio, abbiamo visualizzato l’attaccamento adattabile della proteina S alla membrana plasmatica piastrinica con un alto grado di flessibilità per l’impegno su superfici della membrana continuamente curve (Fig. 4D, E). Allo stesso modo, è stato riportato che il dominio del gambo della proteina S prossimale alla superficie della membrana virale contiene tre cerniere, presumibilmente consentendo al movimento flessibile della singola proteina S sulla superficie virale di adattarsi alle superfici curve delle cellule ospiti 50.

Questa doppia flessibilità probabilmente aumenta la probabilità che la proteina S si leghi a un recettore della cellula ospite, consentendo così un’azione efficiente della proteina S sulla superficie della membrana.


Per analizzare ulteriormente le densità delle proteine ​​​​S sulla superficie della membrana piastrinica, abbiamo selezionato ed estratto manualmente le densità da 8 tomogrammi e le abbiamo analizzate utilizzando approcci di media del sottotomogramma (Fig. 4A). Per facilitare un allineamento mirato della proteina decoratrice senza l’influenza della densità della membrana, il segnale della membrana è stato sottratto usando PySeg49. Abbiamo ottenuto una densità media 3D con una risoluzione di 13,8 Å (Fig. 4A, Fig. S3) che mostra una caratteristica forma trimerica di 15 nm di dimensione. La struttura ottenuta

concordato bene con la nostra struttura di risoluzione quasi atomica della proteina S utilizzando lo stesso lotto di proteine ​​​​per l’analisi di particelle singole (Fig. S3) e strutture precedentemente pubblicate25,30,46,50, (Fig. 4A, PDB 6vxx montato), convalidare l’identità delle decorazioni proteiche S. Inoltre, l’analisi delle particelle senza l’applicazione della simmetria C3 ha mostrato un sollevamento asimmetrico della punta della superficie S1 che si collega alla densità extra (Fig. 4A, a destra). Ciò dimostra che uno dei tre domini RBD della proteina S viene sollevato dal suo legame con i recettori della cellula ospite. La densità extra collegata alla proteina S rappresenta la densità della cellula ospite, probabilmente il recettore della superficie piastrinica riconosciuto dalla proteina S (Fig. 4I).

Per valutare come la proteina S riconosce la superficie piastrinica, i parametri di allineamento delle densità proteiche S analizzate individualmente sono stati applicati alla media 3D e riportati ai tomogrammi originali (Fig. 4B-H). L’analisi della distribuzione della vicina proteina S ha mostrato che la popolazione di picco aveva una distanza di 27,3 nm (mediana) l’una dall’altra, ma alcune molecole erano anche distribuite più scarsamente (Fig. 4B).

Questa misurazione corrisponde a una densità di una proteina S su un’area superficiale fino a 585 nm2 (una superficie radiale di 585 nm2 è ricoperta da una proteina S), sebbene non sia stata rilevata alcuna distribuzione periodica apparente. A giudicare dal diametro della proteina S (~ 17 nm), la proteina S vicina si trova l’una accanto all’altra. Proteina S legata alla membrana piastrinica a una distanza di 16 nm tra il centro della proteina S e la superficie della membrana (Fig. 4F) e interessante, con un’ampia gamma di distribuzione angolare (Fig. 4D-E) rispetto alla membrana superficie, indicando il suo attacco flessibile alla superficie piastrinica.

Inoltre, la proteina S si lega a una superficie della membrana leggermente più curva (Fig. 4G e 4H). Ciò può essere riflesso dal fatto che il legame della proteina S induce la formazione di filopodi con una sporgenza della membrana. Presi insieme, questi risultati indicano che la proteina S si avvicina alla superficie piastrinica da vari orientamenti geometrici per accogliere e migliorare l’aggancio alla superficie della membrana.

Allo stesso modo, è stata osservata un’ampia distribuzione angolare della proteina S dalla superficie virale, a causa di diversi punti attorcigliati nella regione del gambo46,50. Insieme alla nostra osservazione, suggerisce che gli aggiustamenti orientativi da entrambi i lati della proteina S, vale a dire la subunità S1 che lega il recettore e il lato staminale alla radice del virus, massimizzano l’efficienza dell’attaccamento della proteina S ai recettori della cellula ospite.

Coerentemente con la densità aggiuntiva osservata sul dominio RBD sollevato (Fig. 4A, a destra), alcuni dei tomogrammi hanno mostrato densità extra che si uniscono tra la membrana plasmatica e la proteina S (Fig. 4I, frecce rosse), presumibilmente quelle delle piastrine

recettori che riconoscono la proteina S. Tuttavia, l’analisi del subtomogramma ha prodotto solo una debole densità (Fig. 4A, a destra) senza caratteristiche, suggerendo anche un attaccamento flessibile della proteina S al suo recettore sulla superficie della membrana.

Deformazione piastrinica in presenza di particelle virali pseudotipizzate

Dopo aver caratterizzato gli effetti della proteina S sulle piastrine, abbiamo ipotizzato che la proteina S concentrata localmente su una superficie virale globulare sarebbe vantaggiosa per aumentare la concentrazione locale e valutato l’influenza delle particelle simili al virus SARS-CoV-2 (VLP) su deformazione piastrinica. Abbiamo generato o ottenuto VLP pseudotipizzati SARS-CoV-2 che sono entità simili a vescicole completamente intatte, come convalidato dalla colorazione negativa EM (Fig. S4A) e dalla loro capacità di infettare le cellule HEK-293T-hACE2 (cellule HEK-293T che esprimono costitutivamente Recettore ACE2, Fig. S4B-S4C). Il titolo virale determinato mediante citometria a flusso era di circa 104-106 particelle/ml, paragonabile alla preparazione riportata di pseudo VLP SARS-CoV-251, tuttavia, era basso rispetto ai lentivirus basati su VSV-G.

Questo basso titolo non ci ha permesso di rilevare prontamente i cambiamenti nelle morfologie piastriniche mediante imaging piastrinico dal vivo. Tuttavia, siamo stati in grado di trovare un esempio di una particella situata in prossimità di un filopodio piastrinico (Fig. S5B-S5F). La tomografia crioelettronica ha rivelato che la distanza più vicina tra questa particella e la superficie della membrana del filopodio era di 20 nm (Fig. S5G e S5H), simile a quella misurata per la sola proteina S (Fig. 4F 16 nm, dal centro di S proteina alla membrana).

Le viste in sezione trasversale della particella mostravano decorazioni di proteine ​​​​sulla superficie della membrana (Fig. S5I, punte di freccia rosse), suggerendo nel complesso che questa vescicola potrebbe essere un VLP legato. In confronto, abbiamo anche trovato esempi di vescicole extracellulari di forma e dimensioni simili (Fig. S5A) che sembravano provenire da vescicole intracellulari, cioè esosomi, contenenti granuli alfa (Fig. S5A, a sinistra) o germogliare dalla superficie concava di membrana plasmatica, invece di filopodi e indicativa del rilascio di vescicole attraverso la fusione di lisosomi e membrana plasmatica. Questi risultati confermano i nostri dati in vitro sulla proteina S purificata che induce cambiamenti morfologici nelle piastrine.

I recettori dell’integrina riconoscono la proteina SARS-CoV-2 S

È stato riportato che diversi recettori cellulari riconoscono la proteina S. Tuttavia, la presenza di ACE2, il principale recettore della proteina S, sulla superficie piastrinica è ancora inconcludente16,19,21. Pertanto, il

la rilevanza del recettore ACE2 per il malfunzionamento piastrinico è ancora una questione aperta. Al contrario, i recettori dell’integrina sono la principale classe di recettori espressi nelle piastrine. Considerando la nostra analisi strutturale (Fig. 4) e la possibilità che ACE2 non sia abbondantemente espresso sulle piastrine, abbiamo ipotizzato che la proteina S possa riconoscere direttamente i recettori dell’integrina. È interessante notare che il dominio RBD della proteina S contiene un tratto con un motivo “RGD”, che è un motivo comune tra i ligandi dell’integrina35 ed è stata dimostrata un’interazione diretta dell’integrina tissutale α5β1 e della proteina S SARS-CoV-239.

Abbiamo quindi testato il legame della proteina S ai noti recettori dell’integrina piastrinica αIIbβ3, αvβ3 e α5β1, arricchiti nel tessuto ma anche espressi sulle piastrine, riconoscendo tutti il ​​motivo del ligando RGD. Abbiamo utilizzato saggi di legame all’equilibrio in fase solida simili a ELISA per rilevare l’interazione della proteina S con le integrine (Fig. 5A). Abbiamo rilevato il legame dell’integrina α5β1 e αvβ3 alla proteina S, mentre l’integrina αIIbβ3 non ha un’apparente interazione con essa (Fig. 5B).

L’entità del legame è più evidente con l’integrina αvβ3, mentre l’integrina α5β1 ha mostrato solo un’interazione debole. Tuttavia, va notato che il legame osservato delle integrine testate era molto più debole (meno di 10 volte) rispetto a quello dei ligandi fisiologici delle integrine: vitronectina per αvβ3, fibrinogeno per αIIbβ3 e fibronectina per α5β1.

Incoraggiati dai nostri risultati, abbiamo testato l’effetto dell’attivazione piastrinica in presenza di cilengitide, un pentapeptide RGD ciclico52 che blocca il legame dell’integrina ai ligandi extracellulari contenenti motivo RGD, e in effetti l’attivazione è stata ridotta (Fig. 5C). Queste osservazioni generalmente concordano con una recente discussione sulla rilevanza del riconoscimento dell’integrina da parte di SARS-CoV-2 per la disregolazione vascolare38.

link di riferimento:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.11.22.517574v1.full.pdf+html

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