Scoperta la presenza del DNA residuo nei vaccini mRNA contro il Covid-19

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Il rapido sviluppo e distribuzione dei vaccini contro il Covid-19 ha segnato un momento cruciale nello sforzo globale per combattere la pandemia. Pfizer-BioNTech e Moderna, due pionieri nella corsa ai vaccini, hanno utilizzato una tecnologia rivoluzionaria nota come RNA messaggero (mRNA) per creare i loro vaccini.

Tuttavia, con l’aumento della domanda globale di questi vaccini, sono emerse domande sulla presenza di DNA residuo all’interno dei vaccini, sollevando preoccupazioni sulla loro sicurezza e qualità. In questo articolo esploriamo i processi di produzione, il rilevamento del DNA residuo e le potenziali implicazioni per i destinatari del vaccino.

Processi produttivi: dal RCT alla produzione su larga scala

Sia Pfizer-BioNTech che Moderna hanno utilizzato processi simili per produrre i loro vaccini mRNA contro il COVID-19. Inizialmente, per gli studi clinici randomizzati (RCT) , Pfizer ha utilizzato un processo (Processo 1) per produrre il materiale mRNA. Successivamente, sono passati a un processo più efficiente (Processo 2) simile a quello di Moderna. Il nucleo di questo processo di produzione prevede la clonazione della sequenza del picco SARS-CoV-2 in un plasmide, contenente un’origine batterica di replicazione (ori) attiva nell’Escherichia coli (E. coli).

Il plasmide è progettato per un’efficiente replicazione batterica e include un gene dell’aminoglicoside fosfotransferasi (Neo/Kan) che consente la replicazione in un brodo contenente kanamicina. Questo processo determina un rapido raddoppio del numero di copie del plasmide ogni 30 minuti a 37°C.

Le cellule di E. coli vengono raccolte, lisate e il DNA viene estratto e linearizzato con un enzima di restrizione. Questo DNA lineare funge quindi da modello per la trascrizione in vitro (IVT) utilizzando la T7 RNA polimerasi in presenza di N1-metil-pseudouridina. Dopo l’IVT, il DNA viene idrolizzato, riducendo così la sua prevalenza nel prodotto farmaceutico finale.

Preoccupazioni sul DNA residuo

La presenza di DNA residuo nei vaccini mRNA è motivo di preoccupazione, poiché potrebbe potenzialmente influire sulla sicurezza e sull’efficacia dei vaccini. Documenti trapelati dall’Agenzia europea per i medicinali (EMA) hanno evidenziato variazioni nei livelli di DNA residuo nei prodotti a base di mRNA realizzati utilizzando i processi di produzione sopra descritti.

La ricerca condotta da McKernan et al. hanno utilizzato il sequenziamento dell’RNA di nuova generazione per rilevare il DNA derivato dai plasmidi di espressione utilizzati durante la produzione e i loro risultati sono stati inaspettati. Il team ha inoltre sviluppato un metodo quantitativo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) per quantificare la contaminazione del DNA. Inoltre, hanno scoperto le sequenze segnale promotore-potenziatore-ori SV40 e poliA SV40 nei vaccini Pfizer.

Generalizzabilità dei risultati

Per valutare la generalizzabilità di questi risultati, uno studio ha ottenuto e analizzato 24 fiale scadute e non aperte di vaccini Pfizer e Moderna, insieme ai resti dei vaccini Moderna XBB.1.5 COVID-19 distribuiti in Ontario, Canada. Utilizzando la fluorometria Qubit® e la qPCR, i ricercatori hanno preso di mira sequenze specifiche come il picco, il plasmide ori e il promotore-potenziatore-ori SV40 per rilevare il DNA residuo.

Segnalazione di eventi avversi e di sicurezza

Oltre ad indagare la presenza di DNA residuo, questo studio mirava a valutare eventuali eventi avversi (AE), inclusi AE gravi (SAE), associati ai lotti di vaccini esaminati.

Queste informazioni sono state raccolte dal Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS), uno strumento di sorveglianza fondamentale per monitorare la sicurezza dei vaccini.

Comprendere il confezionamento del DNA nelle nanoparticelle lipidiche (LNP)

Inoltre, lo studio ha approfondito la distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA e la sensibilità alla DNasi I del vaccino. Queste analisi miravano a determinare se il DNA residuo è impacchettato all’interno delle nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzate per incapsulare l’mRNA.

Discussione

La presenza di DNA residuo nei vaccini mRNA contro il COVID-19 è oggetto di notevole preoccupazione e i risultati del nostro studio fanno luce sulla portata di questo problema. Nel nostro esame di 27 fiale di vaccino, abbiamo osservato che tutte contenevano DNA residuo, con concentrazioni variabili. Questi risultati sottolineano la necessità di una comprensione completa delle implicazioni della contaminazione del DNA nei vaccini a mRNA.

Coerenza e affidabilità dei test

Il nostro studio ha rilevato carichi consistenti di DNA residuo in più fiale degli stessi lotti di vaccino. Ciò dimostra l’affidabilità, la riproducibilità e la coerenza dei nostri test. I nostri risultati sono coerenti anche con i rapporti non sottoposti a revisione paritaria di McKernan, Buckhaults e König, evidenziando ulteriormente la presenza di contaminazione del DNA nei vaccini a mRNA.

Moderna vs Pfizer: variazioni nella concentrazione del DNA

Il vaccino di Moderna ha mostrato la concentrazione di DNA più bassa quando valutato utilizzando qPCR, ma la concentrazione più alta quando analizzato utilizzando Qubit. Questa discrepanza tra i due metodi di quantificazione può essere attribuita alle differenze nella dimensione e nella natura dei frammenti di DNA presenti.

Le fiale di Moderna hanno mostrato una distribuzione straordinariamente uniforme dei livelli di DNA, suggerendo un processo di produzione più standardizzato e robusto. In particolare, nei vaccini Moderna, la sequenza ori ha mostrato carichi di DNA inferiori rispetto alla sequenza spike in tutte le fiale tranne il lotto AS0467D. Ciò potrebbe indicare che l’RNA modificato omologo presente nei vaccini ostacola la digestione del DNA modello mediante ibridazione.

Fiale con tappo viola di Pfizer e cambio di formulazione

Due lotti di fiale monovalenti con tappo viola di Pfizer, che richiedono la diluizione prima della somministrazione, hanno mostrato le concentrazioni di DNA più elevate. Questi lotti sono stati associati al maggior numero di eventi avversi (AE) ed eventi avversi gravi (SAE) riportati nel Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS) .

Il cambiamento nella formulazione con un tampone Tris/saccarosio per altri vaccini Pfizer è stato autorizzato dalla FDA statunitense il 29 ottobre 2021. Questo cambiamento di formulazione mirava a migliorare la stabilità e semplificare i requisiti di conservazione, offrendo una formulazione pronta all’uso. È essenziale notare che i lotti Pfizer con la parte superiore viola non sono stati inclusi in questo cambiamento di formulazione ed erano collegati a un aumento degli eventi avversi.

Analisi esplorativa del DNA e dei SAE

La nostra analisi preliminare ha suggerito una relazione dose-risposta positiva tra la quantità di DNA residuo stimata mediante qPCR e SAE per i lotti Pfizer. Al contrario, sono state osservate relazioni diverse per i lotti Moderna, sia nei dati qPCR che nelle stime basate sulla fluorometria. Queste variazioni possono derivare da differenze nel contenuto di DNA, nella distribuzione dimensionale dei frammenti di DNA, nella composizione del vettore plasmidico e nella composizione delle nanoparticelle lipidiche tra i due prodotti.

Potenziali impurità e impatti sulla sicurezza dei vaccini

La presenza di impurità e contaminanti, come mRNA frammentato, RNA a doppio filamento (dsRNA) e lipopolisaccaridi, può influenzare la sicurezza del vaccino. Queste impurità possono innescare reazioni immunoinfiammatorie e contribuire a eventi avversi, comprese condizioni come la miocardite. Sono necessari un campionamento più ampio e ulteriori ricerche per comprendere più dettagliatamente le relazioni tra la contaminazione del DNA e gli eventi avversi, compresi esiti gravi come la morte.

Potenziatore SV40 e potenziali impatti

Sebbene l’integrazione genomica dei frammenti di DNA nei vaccini mRNA COVID-19 non sia stata dimostrata, la presenza di DNA potrebbe portare a risposte immunitarie innate ingiustificate, effetti protrombotici e potenzialmente contribuire alle malattie ischemiche. La presenza di sequenze di DNA, come il potenziatore di SV40, con potenziale di targeting nucleare può introdurre nuove considerazioni sulla sicurezza del vaccino.

Sfide di quantificazione

Quantificare il DNA residuo nei vaccini non è privo di sfide. La qPCR ha una capacità limitata di rilevare molecole più piccole della dimensione dell’amplicone (105-114 bp), il che potrebbe portare a una sottostima del contenuto totale di DNA. Le grandi discrepanze osservate tra le quantificazioni qPCR e Qubit evidenziano la necessità di metodi coerenti e standardizzati nella valutazione del DNA residuo. Anche l’uso di coloranti fluorimetrici specifici in campioni con elevate concentrazioni di modRNA N1-metil-pseudouridina può introdurre incertezze nella quantificazione.

Linee guida e chiarezza metodologica

Le linee guida stabilite dalla FDA statunitense e dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) raccomandano di limitare il DNA residuo al di sotto di 10 ng/dose per le inoculazioni parenterali e di limitare le dimensioni dei frammenti di DNA al di sotto della dimensione di un gene funzionale (~200 paia di basi). Queste linee guida sono state concepite prima dell’era della trasfezione efficiente utilizzando nanoparticelle lipidiche (LNP). La presenza di DNA negli LNP può portare a una persistenza più lunga del DNA e a una maggiore efficienza di trasfezione, cosa che le linee guida non hanno considerato.

Dosaggio cumulativo e considerazioni future

Il dosaggio cumulativo di vaccini che utilizzano lo stesso plasmide e la stessa piattaforma modRNA basata su LNP per diverse infezioni presenta una nuova preoccupazione. Le linee guida in vigore potrebbero non affrontare adeguatamente i rischi associati alla somministrazione di dosi multiple, a volte con brevi intervalli, e il potenziale accumulo di DNA nel tempo. Una rivalutazione completa delle linee guida è necessaria per garantire la sicurezza di tali pratiche.

Implicazioni e trasparenza

Le implicazioni dei nostri risultati sono di vasta portata. Garantire la sicurezza e l’efficacia dei vaccini, soprattutto quelli sviluppati attraverso tecnologie innovative come l’mRNA, è di fondamentale importanza. La presenza di DNA residuo in questi vaccini, in quantità così elevate, mette in discussione le linee guida esistenti stabilite dalle agenzie di regolamentazione.

La trasparenza e la divulgazione aperta della composizione del vaccino e dei processi di produzione sono fondamentali per la fiducia del pubblico. Il principio di precauzione dovrebbe guidare il processo decisionale, in particolare quando si tratta di tecnologie emergenti che potrebbero avere conseguenze impreviste.

Ulteriori ricerche e repliche

Il nostro studio è preliminare e limitato nella dimensione del campione e, pertanto, i suoi risultati dovrebbero essere visti come un punto di partenza per ulteriori ricerche. La replica in condizioni forensi controllate è essenziale per convalidare i nostri risultati e approfondire le implicazioni del DNA residuo nei vaccini a mRNA.

Insomma

La presenza di DNA residuo nei vaccini mRNA contro il COVID-19 è motivo di preoccupazione che merita un’indagine approfondita e una rivalutazione delle linee guida esistenti. Le grandi quantità di DNA presenti in questi vaccini, le potenziali implicazioni per la sicurezza dei vaccini e il dosaggio cumulativo di vaccini utilizzando la stessa piattaforma richiedono tutti un’attenta considerazione.

Le agenzie di sanità pubblica, gli organismi di regolamentazione e l’industria farmaceutica devono lavorare insieme per garantire la continua sicurezza ed efficacia dei vaccini. Mentre il mondo è alle prese con le continue sfide della pandemia di COVID-19 e le future minacce alla salute, è fondamentale un approccio trasparente e basato sull’evidenza allo sviluppo e alla sicurezza dei vaccini. Ciò non solo rafforzerà la fiducia del pubblico, ma promuoverà anche l’uso responsabile delle tecnologie vaccinali emergenti.


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