I ricercatori usano VirScan per scoprire come il virus COVID-19 influenza il sistema immunitario

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I ricercatori del Blavatnik Institute della Harvard Medical School e del Brigham and Women’s Hospital stanno adattando uno strumento di rilevazione degli anticorpi per studiare le conseguenze delle infezioni causate dal nuovo coronavirus che sta causando l’attuale pandemia globale.

Lo strumento, chiamato VirScan, rileva gli anticorpi nel sangue delle persone che indicano infezioni attive e passate da virus e batteri.

È stato sviluppato nel 2015 da Stephen Elledge, il professore di genetica e medicina di Gregor Mendel presso HMS e Brigham and Women’s, e due dottorandi nel laboratorio, George Xu e Tomasz Kula.

Poiché una persona impiega dai 5 ai 10 giorni per sviluppare anticorpi, Elledge ha sottolineato che VirScan non verrebbe utilizzato per fornire diagnosi in tempo reale di infezione da SARS-CoV-2 , il virus che causa COVID-19 .

Piuttosto, l’obiettivo è analizzare i campioni di sangue delle persone che si riprendono dall’infezione per scoprire come il virus influenza il sistema immunitario e l’epidemiologia della malattia.

Una volta avviato, lo sforzo si unirà ad altri in tutto il mondo nel tentativo di studiare campioni di sangue post-infezione.

I risultati potrebbero portare a migliori stime della reale infezione e dei tassi di mortalità catturando casi che potrebbero non essere stati individuati e potrebbero informare lo sviluppo di vaccini. Potrebbero anche rivelare nuove intuizioni sui fondamenti dell’immunità umana.

“La situazione in questo momento è estremamente difficile, ma è bello essere in grado di applicare tutti questi nuovi metodi a un importante problema di salute umana”, ha affermato Elledge.

Come funziona VirScan? 

In cosa differisce dai test diagnostici?

Da una singola goccia di sangue, VirScan verifica la presenza di anticorpi contro più di 1.000 diversi ceppi di virus e batteri che potrebbero aver infettato una persona, sia durante i test che decenni prima.

Ciò differisce dai tipici esami del sangue noti come analisi ELISA, che cercano un patogeno alla volta.

Si differenzia anche dai test attualmente utilizzati per diagnosticare COVID-19 .

Questi test si basano su tamponi di muco dal naso e dalla gola e cercano acidi nucleici che segnalano che il virus SARS-CoV-2 è contenuto nel campione.

“Il CDC e altre strutture di test stanno cercando la presenza del virus, che è fondamentale”, ha affermato Elledge.

“Il nostro test è in grado di rilevare se il sistema immunitario di qualcuno ha coinvolto il virus. Possiamo dire quando qualcuno ha ospitato il virus ma non ce l’ha più ”.

Per creare VirScan, Elledge, Kula e Xu hanno creato una libreria di epitopi: brevi frammenti proteici derivati ​​dalle superfici dei virus.

Se una persona ha riscontrato un particolare ceppo virale, il suo sistema immunitario ha generato anticorpi contro di esso.

Tali anticorpi riconosceranno quindi l’epitopo nella libreria VirScan e si legheranno ad esso, dando un risultato positivo.

Il laboratorio di Elledge includeva epitopi di diversi coronavirus nella collezione originale VirScan. Il team sta ora aggiungendo epitopi dal nuovo coronavirus e tutti gli altri coronavirus noti non già inclusi.

Profilatura sierologica VirScan del viroma umano

Il viroma umano, o l’intero spettro di virus che infettano l’uomo, non è ancora del tutto noto. Tuttavia, molti diversi virus umani, insieme alle corrispondenti sequenze di DNA e proteine, sono già stati caratterizzati.

Nonostante queste informazioni disponibili, gli attuali metodi basati su anticorpi per documentare le infezioni virali in genere comportano il test di alcune proteine ​​virali da un numero limitato di virus alla volta.

Un nuovo strumento di profilazione provvisoria, VirScan, è in grado di testare contemporaneamente centinaia di proteine ​​virali. Anziché essere utilizzato come strumento diagnostico, VirScan può esaminare ampiamente la storia attuale e storica dell’infezione virale di un individuo [46] .

Questo metodo si basa su un sistema di batteriofago T7, in cui sequenze di polipeptidi relativamente brevi vengono visualizzate su superfici di batteriofagi e catturate da anticorpi immobilizzati (Figura 1). Per VirScan, 206 diversi virus noti per infettare le cellule umane sono stati prima analizzati bioinformaticamente e utilizzati per generare un set di dati della sequenza di proteine ​​virali di riferimento.

Utilizzando una piattaforma microsintetica programmabile del DNA, sono stati sintetizzati 93.904 oligonucleotidi a 200 mer, codificando 56 peptidi di aminoacidi che comprendevano ogni sequenza proteica di tutti i 206 virus di riferimento.

Questo grande pool di oligonucleotidi è stato quindi clonato in un vettore T7 fagico, permettendo a questa enorme libreria di peptidi virali di essere espressa individualmente sulla superficie delle particelle di fagi.

Per analizzare le risposte sierologiche, la libreria dei fagi virali viene utilizzata in un formato di immunoprecipitazione con campioni di siero umano. Gli anticorpi antivirali presenti nei campioni di siero vengono incubati con fagi che esprimono i peptidi virali, permettendo ai complessi immunitari anticorpo-antigene di essere catturati da sfere magnetiche di proteina A / G immobilizzate .

Dopo un lavaggio rigoroso, i batteriofagi corrispondenti vengono eluiti e analizzati direttamente mediante sequenziamento del DNA ad alto rendimento.

La successiva analisi bioinformatica viene quindi utilizzata per abbinare e assemblare le sequenze di ciascun virus e, infine, chiarire i virus presenti in un determinato individuo. Questa tecnica offre il vantaggio di identificare eventualmente le risposte umorali a centinaia di virus diversi contemporaneamente per determinare l’intera gamma di virus che hanno infettato un determinato individuo.

In un’applicazione, VirScan ha mostrato un’elevata sensibilità di rilevamento e specificità per l’identificazione di individui con infezione da HCV e HIV [46] .

Ciò non è inaspettato, poiché è noto che entrambi i virus inducono solide risposte umorali. Tuttavia, VirScan ha anche rivelato che le persone con infezione da HIV non trattata hanno mostrato un numero maggiore di peptidi HIV arricchiti rispetto ai soggetti con infezione da HIV trattata, dimostrando ulteriori informazioni riguardanti i peptidi immunoreattivi.

Altre intuizioni di VirScan sono derivate dalla catalogazione e dal confronto della sieroprevalenza di più virus presenti in diverse popolazioni umane. Il confronto tra individui non infetti e soggetti con infezione da HIV ha rivelato una sieroprevalenza molto più elevata di anticorpi nei pazienti con HIV contro KSHV, HSV-2, CMV e altri virus, in linea con studi precedenti [47 , 48] .

L’analisi sierologica di VirScan nei bambini rispetto agli adulti ha dimostrato che gli adulti presentavano una sieroprevalenza più elevata di anticorpi virali per EBV, influenza A e influenza B, HSV-1 e HSV-2, mentre i bambini presentavano una sieroprevalenza più elevata per Rhinovirus-A [43] .

La minore sieroprevalenza del Rhinovirus-A negli adulti probabilmente riflette la perdita nel tempo delle risposte delle cellule B in assenza di stimolazione da parte di questi antigeni virali. VirScan ha anche fornito prove del fatto che la prevalenza di diversi virus era geograficamente diversa tra Perù, Sudafrica, Tailandia e Stati Uniti.

Ad esempio, quasi il 100% delle persone in Perù aveva un’infezione da HSV-1, contro l’85% in Sudafrica e solo il 50% in Tailandia e negli Stati Uniti. Allo stesso modo, anticorpi contro il relativo virus dell’herpes, CMV erano presenti in quasi il 100% delle persone in Perù e in Sudafrica, ma solo il 50% delle persone negli Stati Uniti.

Il confronto tra VirScan e le tecnologie esistenti ha mostrato che aveva una sensibilità elevata, ma non perfetta per la rilevazione di individui con infezione da HIV1, HSV1 e HSV2 [46] .

VirScan ha mostrato una sensibilità limitata per il rilevamento di altre infezioni virali. Ad esempio, ha sottovalutato la prevalenza dell’infezione da VZV (solo il 25% di prevalenza rispetto alla quasi effettiva prevalenza del 100%), probabilmente dovuta all’incapacità della tecnica di rilevare anticorpi diretti contro gli epitopi conformazionali delle proteine ​​virali.

È anche importante sottolineare che è stato pubblicato un solo rapporto con VirScan, quindi sono necessari ulteriori studi per convalidare i risultati e la tecnologia. Tuttavia, l’uso diffuso della tecnologia VirScan sarà probabilmente ostacolato dal requisito per i componenti altamente complessi che comprendono centinaia di bersagli virali (cioè derivati ​​da 93.904 200 mers) che rendono difficile la produzione e quindi la riproduzione indipendente da altri laboratori.

Inoltre, VirScan è una procedura complessa di immunoprecipitazione, sequenziamento del DNA e analisi bioinformatica, che probabilmente dovrà essere eseguita in un laboratorio dedicato. Nonostante questi problemi, VirScan ha chiaramente il potenziale per essere un potente strumento per districare i ruoli dell’infezione virale nella salute generale e nelle malattie complesse.

Uno degli aspetti più interessanti della tecnologia VirScan è la sua capacità di determinare il numero e i tipi di infezioni virali riscontrate in una determinata persona. Questa linea di indagine su 569 donatori umani ha rivelato tassi abbastanza eterogenei di esposizione e infezione da virus.

In media, VirScan ha rilevato anticorpi sierici contro dieci diversi virus per persona [43] . Sono state rilevate risposte anticorpali contro 62 delle 206 specie di virus presenti in biblioteca in almeno cinque individui, evidenziando la complessità dell’infezione virale osservata in alcuni individui. Sorprendentemente, due individui hanno mostrato anticorpi contro 84 specie di virus nella biblioteca.

Sarebbe altamente istruttivo in studi futuri utilizzare VirScan per studiare individui con malattie complesse per determinare se specifiche infezioni virali o il numero di agenti infettivi possono essere associati o sono fattori trainanti della malattia. L’analisi del ruolo dei virus non patogeni nella salute umana, come quella del profilo dei batteri mutualistici, può persino rivelare interazioni benefiche [49] .

Catalogando nel tempo l’esposizione virale nei sottogruppi di malattie, VirScan può fornire nuove informazioni sulle infezioni virali associate alla protezione o alla suscettibilità a molte malattie croniche, tra cui il cancro, le malattie neurodegenerative e autoimmuni, dove attualmente non sono noti i fattori di rischio e la patologia.

Figura 1. Panoramica di VirScan. (A) Una libreria virale completa di fagi T7 che codificano ed esprimono individualmente i
peptidi virali sulla loro superficie sono incubati con campioni di siero contenenti anticorpi anti-virali. (B) I
complessi immunitari contenenti peptidi virali fagici sul fagiolo T7 sono legati da anticorpi sierici e catturati su
microsfere di proteina AG immobilizzate , seguite dalla rimozione di fagi non legato mediante lavaggio rigoroso. (C) L’amplificazione e il
sequenziamento ad alto rendimento del DNA dell’inserto del fagi T7 legato all’anticorpo rivelano le sequenze di DNA dei
peptidi virali legati . L’analisi bioinformatica viene quindi utilizzata per assemblare le identità dei virus corrispondenti al
fagi catturato, fornendo così un profilo virale completo per ogni dato individuo.

VirScan può essere utilizzato per verificare se le persone hanno attualmente COVID-19?

Per diversi motivi, incluso il fatto che ci vuole almeno una settimana per generare risultati, VirScan non può essere utilizzato come test diagnostico in tempo reale.

“Non è fattibile come test point-of-care”, ha detto Elledge. Tuttavia, ha aggiunto che il suo team potrebbe essere in grado di utilizzare le informazioni acquisite per generare una versione più veloce di VirScan.

Quando il progetto sarà avviato, sarà fondamentale garantire che i campioni di sangue vengano prelevati solo da persone che si sono completamente riprese dalle infezioni SARS-CoV-2, in modo che i flaconcini non contengano particelle di coronavirus attive quando entrano in laboratorio.

“Non vogliamo infettare i nostri ricercatori”, ha affermato Elledge.

In che modo il lavoro può migliorare le stime dei tassi di infezione e mortalità?

Finora, i test limitati hanno significato che un numero sconosciuto di persone negli Stati Uniti e oltre sono state infettate con SARS-CoV-2 ma non sono state contate.

Alcuni potrebbero non aver avuto sintomi. Alcuni sintomi potrebbero essere stati attribuiti ad altre cause. Ciò non solo lascia le persone interrogandosi sulla loro infezione e sullo stato di immunità, ma oscura anche il vero tasso di infezione in tutta la popolazione.

E senza sapere quante persone sono state infettate, è impossibile calcolare il tasso di mortalità – quanto è probabile che il nuovo coronavirus uccida una persona che infetta.

L’esecuzione di analisi VirScan sul sangue o sul siero da un ampio segmento della popolazione può fornire “una stima attendibile” di quante persone sono state infettate in una determinata area geografica, ha affermato Elledge.

Riferimenti incrociati con la documentazione medica di coloro che sono risultati positivi e deceduti, che le informazioni possono illuminare il vero tasso di mortalità del virus.

“Perché in questo momento dicono” sono arrivate molte persone e si sono dimostrate positive “e” sono morte molte “, ma se ci sono molte persone che non sono abbastanza malate da andare in ospedale e che non vengono sottoposte a test , rende il virus più letale di quanto potrebbe essere “, ha detto Elledge.

In che modo VirScan può informare lo sviluppo del vaccino?

VirScan promette di aiutare Elledge e colleghi a identificare a quali parti del virus risponde il sistema immunitario.

Un recente lavoro del suo gruppo suggerisce che le persone di tutto il mondo infettate da un particolare virus producono anticorpi contro le stesse proteine ​​- “anche gli stessi aminoacidi” – su quel virus, ha detto Elledge.

È sorprendente, considerando quanti epitopi hanno i virus e quanti anticorpi si trovano nell’arsenale del corpo, ha detto Elledge.

I risultati lo hanno portato a sospettare che alcuni epitopi siano, in effetti, esche e quindi che non tutti gli anticorpi abbiano l’effetto neutralizzante desiderato.

“Il sistema immunitario potrebbe inviare tutti questi anticorpi come sparare con un fucile e sperare che parte dello spray colpisca il bersaglio, neutralizzando una parte critica del virus”, ha detto.

In linea di principio, ha affermato Elledge, VirScan potrebbe indicare quali epitopi sono bersagli utili contro il nuovo coronavirus e quali sono solo rumore.

Quindi i ricercatori potrebbero eliminare quelli inutili dai vaccini che stanno sviluppando.

In quale altro modo il laboratorio lavora per assistere gli sforzi del vaccino?

Gli anticorpi non sono gli unici oggetti nel corpo che attaccano gli invasori. Le cellule immunitarie chiamate cellule T reagiscono anche a epitopi specifici, non sui virus, ma sulla superficie delle cellule infette.

Allertati al pericolo da questi epitopi, le cellule T possono uccidere le cellule infette da virus e limitare il numero di virus prodotti nel corpo.

Nel 2005, il laboratorio di Elledge ha costruito uno strumento, T-Scan, in grado di rilevare questi epitopi. Vorrebbe ora insegnare a T-Scan per rilevare gli epitopi creati quando le cellule sono infettate dal nuovo coronavirus.

Ma poiché le cellule infettate da diversi virus e batteri spuntano epitopi diversi, deve prima sapere come sono gli epitopi per le infezioni da questo coronavirus.

Ciò richiederebbe l’ottenimento non solo di sangue ma anche di cellule T da persone che si riprendono dall’infezione da SARS-CoV-2.

questo è covid19

Il nuovo coronavirus .. L’immagine è accreditata a NIH / NIAID.

L’obiettivo: identificare gli epitopi che innescano gli attacchi delle cellule T in modo che i ricercatori che lavorano per sviluppare vaccini COVID-19 possano includerli nella miscela.

“Gli epitopi delle cellule T sono spesso importanti attori nei vaccini e nella prevenzione delle infezioni virali”, ha affermato Elledge. “Vuoi incoraggiare le cellule T a uccidere le cellule infette.”

In che modo VirScan può illuminare ciò che SARS-CoV-2 fa al sistema immunitario?

L’anno scorso, il team ha utilizzato VirScan per aiutare a rivelare come l’infezione da morbillo cancella la memoria del sistema immunitario delle infezioni passate da altri virus e batteri.

VirScan potrebbe allo stesso modo chiarire se le persone sviluppano immunità al nuovo coronavirus, per quanto tempo rimangono immuni e se l’infezione provoca un danno più diffuso al sistema immunitario come fa il morbillo.

Oppure il virus potrebbe avere altre sorprese in serbo, ha affermato Elledge.

Che dire della probabilità che ci siano diversi ceppi del nuovo coronavirus?

Sebbene fino ad oggi molte mutazioni nel virus siano state documentate in tutto il mondo, queste variazioni “non influenzerebbero molto gli anticorpi”, quindi i risultati di VirScan dovrebbero ancora essere applicati, ha affermato Elledge.

Di chi saranno analizzati i campioni?

Per lo studio iniziale, Elledge prevede di raccogliere campioni da circa 100 volontari che si sono ripresi da COVID-19. Lo scenario migliore sarebbe avere campioni da persone prima e dopo l’infezione, ha detto, anche se riconosce che sarebbe difficile da organizzare.

“Molte persone in laboratorio hanno fornito campioni in passato, quindi se qualcuno si ammala, avremo un prima e un dopo, ma ovviamente speriamo che ciò non accada”, ha detto.

Quando sarà tutto pronto?

La maggior parte dei laboratori HMS è passata al lavoro remoto seguendo le linee guida istituzionali volte a contenere la diffusione del virus, ma ad alcuni è stato concesso il permesso di continuare il lavoro in loco per progetti relativi a COVID-19, inclusa una parte del laboratorio di Elledge.

Elledge prevede che VirScan potrebbe essere distribuito per analizzare campioni a metà aprile. Quindi si tratterebbe di ottenere le approvazioni del comitato di revisione istituzionale per la ricerca umana e di organizzare la logistica della raccolta dei campioni.

Elledge è attualmente in trattativa con i contatti attraverso l’HMS e le più ampie comunità di Boston.

Cos’altro c’è nelle opere?

Allo stesso tempo, il team di Elledge sta lavorando per rilevare gli anticorpi contro il nuovo coronavirus con una sensibilità ancora maggiore utilizzando uno strumento sviluppato nel 2014 chiamato PLATO.

Mentre VirScan utilizza frammenti di proteine ​​lineari corti, PLATO utilizza proteine ​​a lunghezza intera note come frame di lettura aperti o ORF, che hanno una struttura 3D più sviluppata. (PLATO sta per ParalleL Analysis of Translated ORFs.)

Chi finanzia questo lavoro?

Elledge è un investigatore del Howard Hughes Medical Institute.


Tabella 1. Tecnologie diagnostiche virali emergenti.
TecnologiaVantaggi e limitazioni
Diagnostica basata su CRISPRVantaggi: la versione più recente, SHERLOCKv2, è in grado di rilevare virus con sensibilità attomolare utilizzando un formato distribuibile sul campo. Altamente adattabile a diversi virus utilizzando RNA guida specifici per virusRilevazione visiva semplice con sistema cartaceo. Reagenti liofilizzati a basso costo e stabiliLimitazioni: ancora nelle prime fasi di sviluppo. Ulteriore convalida e la standardizzazione necessari prima di adattamento per regolare clinica l’uso. Richiede la conoscenza del il potenziale virus che causa l’infezione per l’attuazione
Sequencer del DNA del portaleVantaggi: Il Minion è un piccolo, portatile dispositivo che può produrre alta qualità sequenza dati per l’identificazione del virus. Può essere utilizzato sia per il rilevamento mirato che imparzialeLimitazioni: per applicazioni imparziali, richiede tempo e sforzi significativi per generare le librerie di cDNA necessariesequenziamento da materiale clinico. Attualmente non utile per rilevare virus in modo imparziale con bassi titoli di infezione
LABBRAVantaggi: piattaforma altamente versatile per la rilevazione efficiente di anticorpi contro anticorpi sia lineari che conformazionali. Costruzione rapida di test immunologici per specifiche proteine virali . Ampia gamma dinamica di rilevazione di anticorpi che consente profili robusti contro le proteine ​​virali per la rilevazione e la stratificazione della malattiaLimitazioni: nessun test LIPS commerciale disponibile. Prima è necessario uno sviluppo aggiuntivo di una piattaforma multivirusadattamento per la profilazione virale diffusa
VirScanVantaggi: un test sierologico completo basato sui fagi che può catalogare la storia di infezione virale contro oltre 200 virus umani. Potenziale districare il complesso ruolo dell’infezione virale nella salute e nella malattiaLimitazioni: solo una pubblicazione che documenta la sua utilità. Deve essere eseguito in laboratori dedicati perché la tecnica prevede immunoprecipitazione, sequenziamento del DNA e analisi bioinformatica. Gran numero e complessa serie di sintesi di DNA componenti sono richiesto rendendo esso difficile da produrre e quindi riprodurreindipendentemente da altri laboratori
Labbra: sistema di immunoprecipitazione della luciferasi.


Background

  • La diagnosi delle infezioni virali e lo studio del loro impatto clinico sulla salute umana e sulla malattia sono stati ostacolati da metodi di rilevazione non ottimali.
  • Le nuove tecnologie emergenti hanno il potenziale per ridurre i tempi di test, limitare la necessità di apparecchiature sofisticate, aumentare la portata degli obiettivi virali esaminati e / o aumentare la qualità e la quantità di informazioni prodotte.

Rilevazione virale basata su CRISPR

  • La tecnologia basata su CRISPR, come SHERLOCKv2, consente la rilevazione rapida di acidi nucleici virali con sensibilità attomolare in un formato cartaceo, utilizzabile sul campo.
  • È possibile che una serie di strumenti diagnostici basati su CRISPR rilevi una vasta gamma di agenti infettivi virali nei campioni clinici.

Sequenziamento del DNA portatile

  • MinION, un sequencer portatile di nanopori di DNA, fornisce informazioni sulla sequenza in tempo reale in un formato distribuibile sul campo per il rilevamento di virus mirato.
  • Miglioramenti futuri sono ancora necessari per le applicazioni imparziali di rilevamento virale.

Rilevazione basata su anticorpi dei sistemi di immunoprecipitazione della luciferasi

  • I sistemi di immunoprecipitazione della luciferasi forniscono un rilevamento quantitativo di anticorpi antivirali con elevata sensibilità e specificità.
  • L’ampia gamma dinamica di rilevazione di anticorpi antivirali da parte dei sistemi di immunoprecipitazione della luciferasi è particolarmente utile per esplorare il ruolo dei virus nelle malattie croniche umane.

Analisi VirScan del viroma umano

  • VirScan è in grado di schermare simultaneamente le risposte anticorpali contro centinaia di virus.
  • VirScan mostra un grande potenziale per l’uso come strumento di profilazione per catalogare la storia di infezione virale di un individuo.

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Sono stati sviluppati diversi metodi per caratterizzare le specificità delle molecole che legano le proteine. Le tecnologie di visualizzazione sono in genere limitate a polipeptidi più brevi e le librerie basate su cDNA soffrono di distribuzioni di abbondanza clonale altamente non uniformi e frame di lettura errati. 1 

Le tecniche a doppio ibrido e reporter diviso, 2  sono limitate alle analisi delle molecole di esca che possono essere presentate all’interno della cellula e non sono adatte per l’identificazione di target di farmaci o anticorpi.

Più recentemente, i microarrays delle proteine ​​sono stati usati per questi scopi 3 ,  ma la loro costruzione richiede in genere la purificazione e la matrice delle singole proteine, con conseguenti costi sostanziali e vari gradi di denaturazione delle proteine.

Per ovviare a questi limiti, abbiamo sviluppato PLATO (ParalleL Analysis of Translated ORFs), un metodo che combina la   visualizzazione in vitro di proteine ​​a lunghezza intera con l’analisi mediante sequenziamento del DNA ad alto rendimento.

Dimostriamo l’utilità di PLATO eseguendo diversi schermi di interazione contro l’ORFeome umano, una raccolta normalizzata di 15.483 cDNA nel sistema di clonazione Gateway. 4

Per esprimere una libreria ORF  in vitro , PLATO impiega un display ribosomiale, una tecnica utilizzata per preparare una libreria di molecole di mRNA che rimangono legate alle proteine ​​che codificano mancando di un codone di stop. 5

 La visualizzazione ribosoma impone vincoli minimi sulla lunghezza o composizione delle proteine ​​che possono essere visualizzate in modo efficiente.

Abbiamo costruito un vettore ‘destinazione’ di visualizzazione ribosoma compatibile con la clonazione di Gateway (pRD-DEST;  Figura 1 aggiuntiva ), da utilizzare come destinatario per un pool normalizzato di cloni ORF “entry”.

Dopo la ricombinazione, il DNA viene amplificato dalla PCR, producendo modelli lineari privi di codoni di arresto. Dopo la   trascrizione e la traduzione in vitro , l’ORFeome visualizzato sul ribosoma può essere sottoposto a screening per il legame con esche immobilizzate.

L’arricchimento delle proteine ​​leganti candidate può essere rapidamente valutato utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) con primer specifici per ORF, oppure  in massa  mediante sequenziamento profondo degli mRNA arricchiti ( Fig. 1a ).

Le librerie di sequenziamento possono inoltre essere altamente multiplexate, riducendo così il costo di ciascuna schermata. Tutti i passaggi richiesti per PLATO sono compatibili con l’automazione mediante robotica standard per la gestione dei liquidi.

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Figura 1
Analisi parallele di ORF tradotti in vitro (PLATO). (a) Schema di visualizzazione ORF. La libreria vettoriale di voci ORFeome v5.1 umana raggruppata è attL-attR (“LR”) ricombinata nel vettore di espressione pRD-DEST. I plasmidi di espressione sono PCR amplificati per generare i modelli di DNA per la trascrizione in vitro. Dopo la traduzione in vitro, i complessi proteina-mRNA-ribosoma vengono incubati con esche proteiche, anticorpo o piccole molecole immobilizzate su perline. La libreria di mRNA arricchita viene recuperata dai complessi di perline esca per ulteriori analisi. (b) Elaborazione di campioni di mRNA per sequenziamento profondo del DNA. Dopo la frammentazione e la trascrizione inversa (RT) usando un primer universale per recuperare l’estremità 3 ‘delle trascrizioni di ORFeome, Il cDNA è poliadenilato con deossinucleotide transferasi terminale (TdT) e amplificato per il sequenziamento profondo multiplex utilizzando primer contenenti un codice a barre campione e gli adattatori di sequenziamento Illumina P5 e P7. (c) Letture in sequenza della libreria umana non arricchita di pRD-ORFeome mRNA (la libreria ‘input’). La maggior parte degli ORF è stata sequenziata almeno una volta.

La nostra strategia per il sequenziamento profondo delle librerie di display arricchite impiega il recupero dei termini ORF 3 ‘, che riduce al minimo le interferenze dal degrado dell’RNA e garantisce una correlazione stechiometrica tra il conteggio dei tag e l’abbondanza della trascrizione.

A tal fine, abbiamo adottato il seguente protocollo:

(i) mRNA arricchiti chimicamente di frammenti;

(ii) invertire la trascrizione di frammenti usando un primer comune;

(iii) cDNA poliadenilati;

(iv) aggiungere codici a barre campione e adattatori di sequenziamento usando l’amplificazione PCR a due stadi ( Fig. 1b ).

Le successive analisi di sequenziamento profondo multiplex di librerie di display raggruppate sono riproducibili e quantitative ( Figura 2 complementare ). Il sequenziamento di un campione di pRD-OR umano non arricchito mRNA (input) ha rilevato le trascrizioni di 14.582 ORF univoci su 15.483 cDNA totali nella libreria del clone di ingresso (94%,  Fig. 1c ).

Per testare la capacità di PLATO di identificare le interazioni proteina-proteina, abbiamo usato LYN, che contiene componenti strutturali comuni della famiglia SRC, inclusi i domini SH3, SH2 e chinasi 6 ,  ed è stato ampiamente caratterizzato per i suoi partner di interazione.

Dopo l’arricchimento dell’affinità dell’ORFeoma umano usando GST-LYN, GST da solo o una proteina non collegata a GST (GST-Muted), abbiamo usato il sequenziamento Illumina per identificare le proteine ​​specificamente legate da GST-LYN ( Fig. 2a ,  Tabella supplementare 1 ,  Supplementare Fig. 3a ).

Numerosi partner vincolanti di LYN erano tra quelli identificati e ne abbiamo convalidati due con qPCR ( Fig. 2b ). 7 ,  8  Abbiamo classificato gli interlocutori LYN candidati in base al loro grado di arricchimento su GST-LYN e confermato cinque su sette testati dall’analisi Western Blot ( Fig. 2c ).

Dei due candidati non validati, uno legato in modo non specifico a GST, mentre l’altro era un vero negativo. Tra gli ORF altamente arricchiti, le proteine ​​contenenti dominio SH2 erano sovrarappresentate ( P  <0,01, test di Fisher).

Coerentemente con un ruolo per l’autofosforilazione di LYN nel mediare queste interazioni, il trattamento con fosfatasi del GST-LYN immobilizzato ha abolito il legame di SH2D1A e SH2D4A, ma ha solo parzialmente ridotto il legame con PIK3R3, suggerendo la presenza di un dominio di interazione aggiuntivo ( Figura 3b supplementare ). Queste proteine ​​non sono state precedentemente segnalate per interagire con LYN.

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Figura 2
Identificazione di interazioni note e precedentemente non descritte mediante PLATO. ( a ) Interazioni con tirosina-proteina chinasi LYN. Il diagramma a dispersione delle sequenze di ciascun ORF legge dopo l’arricchimento su GST-LYN o GST. Diversi candidati vincolanti LYN noti e non descritti sono evidenziati in rosso. ( b ) Arricchimento di due interagenti noti di LYN. I dati sono stati normalizzati nelle librerie arricchite di GST (n = 3, media ± sd; *,  P  <0,01; t test). ( c ) Conferma di proteine ​​leganti LYN note e previste mediante precipitazione per affinità-western blotting di lisati da cellule HEK 293T che sovraesprimono transitoriamente le singole proteine ​​candidate marcate con V5-His. ( d) Conferma di autoantigeni precedentemente non identificati da un paziente affetto da PND. ( e ) Interazioni con autoanticorpi. Classifica di arricchimento degli autoantigeni PND identificati mediante CSF dal paziente C. ( f ) Interazioni con una piccola molecola. Arricchimento di obiettivi precedentemente identificati di gefitinib. I dati sono stati normalizzati nelle librerie arricchite con controllo (n = 3, media ± sd; *,  P  <0,05; t test).

Successivamente abbiamo chiesto se il PLATO potesse essere usato per identificare target proteici di anticorpi provenienti da pazienti con malattia autoimmune. Per prima cosa abbiamo esaminato l’arricchimento del bersaglio usando per anticorpi purificati per affinità P53 e PDCD4 immobilizzati su granuli di proteina A / G per l’immunoprecipitazione delle biblioteche.

Con qPCR, le trascrizioni di P53 e PDCD4 sono state fortemente arricchite dai loro anticorpi cognati, ma non dagli anticorpi di controllo ( Figura 4 aggiuntiva ).

In lavori precedenti, abbiamo sintetizzato una libreria di oligonucleotidi che codifica per un peptidoma umano sovrapposto di 36 residui per la visualizzazione su batteriofago T7 (T7-Pep). Il sequenziamento profondo del T7-Pep arricchito con affinità usando fluido cerebrospinale autoimmune (CSF) da tre individui con disturbo neurologico paraneoplastico (PND) ha scoperto autoantigeni noti e nuovi. 9 

Abbiamo proiettato questi campioni usando PLATO. A differenza di T7-Pep, l’ORFeome umano è una raccolta incompleta di proteine ​​a lunghezza intera e le nostre scoperte riflettono la complementarità intrinseca di queste librerie. 

Ad esempio, l’antigene ventrale neuro-oncologico 1 (NOVA1) è assente dall’ORFeome umano v5.1 umano, quindi PLATO non è stato in grado di rilevare questa autoreattività nota nel paziente A, mentre è stato identificato in modo robusto con T7-Pep. 

Al contrario, PLATO ha identificato numerosi autoantigeni per ciascun paziente che sono stati persi nei nostri schermi peptidome ( Tabella Supplementare 2 ).

Ad esempio, l’analisi PLATO dei pazienti A e B ha rivelato l’immunoreattività con autoantigeni tumorali noti non rilevati con T7-Pep.

Molti di questi antigeni reattivi sono stati selezionati per la conferma mediante immunoprecipitazione e western blotting ( Fig. 2d ,  Fig. 5a-d supplementare ). Inoltre, avevamo precedentemente stabilito che gli anticorpi del paziente C riconoscevano il motivo tripartito contenente le proteine ​​TRIM9 e TRIM67.

PLATO ha ampliato considerevolmente i membri della famiglia TRIM riconosciuti dagli anticorpi nel liquido cerebrospinale di questo paziente per includere TRIM1 / MID2, TRIM18 / MID1, TRIM54 e TRIM55 ( Fig. 2e ). 

In particolare, l’allineamento di sequenze multiple provoca un raggruppamento stretto di questo preciso sottoinsieme della famiglia estesa TRIM, suggerendo la presenza di epitopi condivisi e conformazionali non rappresentati in T7-Pep. 10 

Come alternativa alla lettura PLATO, l’ibridazione di librerie arricchite di autoanticorpi con microarray di oligonucleotidi personalizzati ha rivelato un elenco simile di autoantigeni ( Figura 6 aggiuntiva ).

La scoperta degli obiettivi di piccole molecole comporta in genere l’uso di estratti cellulari contenenti un’ampia distribuzione di abbondanza proteica, che limita l’accuratezza del rilevamento mediante spettrometria di massa.

Le librerie ORF normalizzate e il sequenziamento quantitativo del DNA potrebbero quindi offrire un maggiore potere di rilevazione delle interazioni proteina-piccola molecola. Abbiamo testato questa idea con gefitinib, un inibitore del dominio tirosin-chinasi del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR).

Gefitinib interagisce con la tasca di legame ATP di EGFR e tirosina chinasi aggiuntiva. 11 L’  analisi dopo ORFeome arricchimento di affinità su microsfere accoppiate con gefitinib ha rivelato un arricchimento significativo di 10 dei 17 target previsti testati ( Fig. 2f ).

Questo esperimento dimostra la relativa facilità con cui le interazioni tra le proteine ​​candidate possono essere analizzate con PLATO; il legame di qualsiasi ORF può essere rapidamente valutato utilizzando qPCR senza necessità di clonazione o western blot.

L’affinità delle librerie ORFeome arricchita dall’inibitore della tirosina chinasi della famiglia Src dasatinib ha mostrato una sovrarappresentazione delle protein chinasi ( P  = 0.0003; test di Fisher), incluso il target noto LCK e diversi target non precedentemente associati a questo composto ( Tabella Supplementare 3 ).

I limiti di PLATO comprendono raccolte ORFeome incomplete e una mancanza di modifiche post-traduzionali di proteine. Tuttavia, la qualità, la completezza e la disponibilità di queste librerie continueranno a migliorare nel tempo.

Inoltre, proteine ​​ORF molto grandi possono essere visualizzate in modo meno efficiente e possono contenere aggregati di proteine ​​contenenti domini che si estendono a membrana o inclini all’aggregazione e che normalmente richiedono un macchinario cellulare ospite; questi fattori possono complicare l’analisi dei dati.

Infine, la visualizzazione del ribosoma impone alcune limitazioni alle condizioni in cui possono essere eseguiti arricchimenti di affinità (ad esempio bassa temperatura e assenza di contaminazione da RNAse) e l’uso di proteine ​​contenenti domini leganti l’acido nucleico in quanto le esche possono determinare un legame non specifico.

Tuttavia, quando vengono soddisfatte le condizioni richieste per PLATO, questo metodo offre tre vantaggi principali come strumento per le indagini proteomiche. Innanzitutto, ha una dimensione minima delle proteine ​​e una distorsione della composizione. In secondo luogo, ha bassi costi e requisiti minimi dello strumento.

Infine, il costo in rapida diminuzione del sequenziamento del DNA renderà PLATO una piattaforma ideale per progetti che coinvolgono un gran numero di campioni, come la profilazione di autoanticorpi su scala di coorte o analisi delle relazioni struttura-attività di composti di piccole molecole.


Fonte:
Harvard

43. Zhou P, Fan H, Lan T et al. Sindrome da diarrea acuta suina fatale causata da un coronavirus correlato alla HKU2 di origine pipistrello. Nature 556 (7700), 255–258 (2018).

•• Dimostra il potenziale dei sistemi di immunoprecipitazione della luciferasi per il rapido sviluppo di un test sierologico per il monitoraggio delle risposte anticorpali a un virus scoperto di recente.

46. ​​Xu GJ, Kula T, Xu Q et al. Immunologia virale Profilazione sierologica completa delle popolazioni umane utilizzando un viroma umano sintetico. Science 348 (6239), aaa0698 (2015).

•• La pubblicazione descrive i dettagli della tecnologia VirScan per lo studio simultaneo della storia dell’infezione di centinaia di virus contemporaneamente.

49. Roossinck MJ. I buoni virus: simbiosi virali mutualistiche. Nat. Rev. Microbiol. 9 (2), 99–108 (2011).

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