EIDD-2801 – un nuovo farmaco antivirale ha il potenziale per curare il coronavirus

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Gli scienziati sperano che un nuovo farmaco – chiamato EIDD-2801 – possa cambiare il modo in cui i medici trattano il COVID-19.

Il farmaco mostra risultati promettenti nel ridurre il danno polmonare, ha terminato i test sui topi e presto passerà agli studi clinici sull’uomo.

A partire dal 3 aprile, il nuovo coronavirus SARS-CoV-2 aveva infettato più di 1 milione di persone con COVID-19 e causato oltre 58.000 morti in una pandemia in tutto il mondo.

Attualmente, nessun farmaco antivirale è stato approvato per il trattamento della SARS-CoV-2 o di uno qualsiasi degli altri coronavirus che causano malattie nell’uomo.

I ricercatori della UNC-Chapel Hill Gillings School of Global Public Health stanno svolgendo un ruolo chiave nello sviluppo e nel collaudo dell’EIDD-2801. 

I virologi nel laboratorio di William R. Kenan Jr. Distinto professore di epidemiologia Ralph Baric, stanno lavorando con i colleghi del laboratorio di Mark Denison, Edward Claiborne Stahlman Professore di pediatria presso il Vanderbilt University Medical Center (VUMC) e con George Painter, capo direttore esecutivo del no profit DRIVE (Drug Innovation Ventures presso Emory) e direttore dell’Emory Institute for Drug Development (EIDD), dove è stato scoperto l’EIDD-2801.

I risultati dello studio più recente del team sono stati pubblicati online il 6 aprile dalla rivista  Science Translational Medicine .

L’articolo include dati provenienti da cellule polmonari umane in coltura infette da SARS-CoV-2 , nonché da topi infetti dai relativi coronavirus SARS-CoV e MERS-CoV.

Lo studio ha scoperto che, quando usato come profilattico, l’EIDD-2801 può prevenire gravi lesioni polmonari nei topi infetti.

EIDD-2801 è una forma disponibile per via orale del composto antivirale EIDD-1931; può essere preso come una pillola e può essere adeguatamente assorbito per viaggiare nei polmoni.

Quando somministrato come trattamento 12 o 24 ore dopo l’inizio dell’infezione, EIDD-2801 può ridurre il grado di danno polmonare e la perdita di peso nei topi.

Questa finestra di opportunità dovrebbe essere più lunga negli esseri umani, poiché il periodo tra l’insorgenza della malattia di coronavirus e la morte è generalmente esteso nell’uomo rispetto ai topi.

“Questo nuovo farmaco non solo ha un alto potenziale per il trattamento dei pazienti con COVID-19, ma sembra anche efficace per il trattamento di altre gravi infezioni da coronavirus”, ha affermato l’autore senior Baric.

Rispetto ad altri potenziali trattamenti COVID-19 che devono essere somministrati per via endovenosa, EIDD-2801 può essere somministrato per via orale come una pillola.

Oltre alla facilità di trattamento, ciò offre un potenziale vantaggio per il trattamento di pazienti meno malati o per la profilassi, ad esempio in una casa di cura in cui molte persone sono state esposte ma non sono ancora malate.

“Siamo sorpresi dalla capacità di EIDD-1931 e -2801 di inibire tutti i coronavirus testati e il potenziale trattamento orale di COVID-19.

Questo lavoro mostra l’importanza del supporto del National Institutes of Health (NIH) in corso per la ricerca collaborativa per lo sviluppo di antivirali per tutti i virus pandemici, non solo per i coronavirus ”, ha affermato Andrea Pruijssers, il principale scienziato antivirale del Denison Lab presso VUMC.

Denison è stato autore senior di uno studio del dicembre 2019 che ha riferito per la prima volta che l’EIDD-1931 ha bloccato la replicazione di un ampio spettro di coronavirus.

Questi collaboratori interistituzionali, supportati da una sovvenzione NIH attraverso l’Università dell’Alabama a Birmingham, hanno anche eseguito lo sviluppo preclinico di remdesivir, un altro farmaco antivirale attualmente in sperimentazione clinica su pazienti con COVID-19.

Nel nuovo articolo di Science Translational Medicine, Maria Agostini, postdottorato nel laboratorio di Denison, ha dimostrato che i virus che mostrano resistenza a remdesivir subiscono una maggiore inibizione da EIDD-1931.

“I virus che portano mutazioni di resistenza a remdesivir sono in realtà più sensibili all’EIDD-1931 e viceversa, suggerendo che i due farmaci potrebbero essere combinati per una maggiore efficacia e per prevenire l’insorgere di resistenza”, ha detto Painter.

Gli studi clinici sull’EIDD-2801 nell’uomo dovrebbero iniziare più tardi questa primavera.

Se avranno successo, il farmaco potrebbe non solo essere utilizzato per limitare la diffusione di SARS-CoV-2, ma potrebbe anche controllare i futuri focolai di altri coronavirus emergenti.

“Con tre nuovi coronavirus umani emersi negli ultimi 20 anni, è probabile che continueremo a vedere di più”, ha affermato il primo autore Timothy Sheahan, assistente professore di epidemiologia di Gillings e collaboratore del Baric Lab. “EIDD-2801 promette non solo di trattare oggi i pazienti COVID-19, ma anche di trattare nuovi coronavirus che potrebbero emergere in futuro.”


L’EIDD-2801 terapeutico riduce la replicazione e la patogenesi della SARS-CoV

Data la promettente attività antivirale di NHC in vitro, abbiamo successivamente valutato la sua efficacia in vivo usando EIDD-2801, un profarmaco biodisponibile per via orale di NHC (β-DN 4 -idrossicitidina-5′-isopropil estere), progettato per migliorare la farmacocinetica in vivo e biodisponibilità orale nell’uomo e nei primati non umani ( 15 ).

È importante sottolineare che i profili plasmatici di NHC e EIDD-2801 sono simili nei topi dopo somministrazione orale ( 15 ). Prima abbiamo eseguito uno studio profilattico di aumento della dose in topi C57BL / 6 in cui abbiamo somministrato per via orale veicolo (10% PEG, 2,5% Cremoforo RH40 in acqua) o 50, 150 o 500 mg / kg EIDD-2801 2 ore prima dell’infezione intranasale con 5E +04 PFU di SARS-CoV adattato per topo (SARS-MA15), e successivamente veicolo o farmaco ogni 12 ore successive.

A partire da 3 giorni dopo l’infezione (dpi) e fino alla fine dello studio, la perdita di peso corporeo rispetto al trattamento con il veicolo è stata significativamente ridotta (50 mg / kg) o prevenuta (150, 500 mg / kg) con la profilassi EIDD-2801 ( ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Dunnett, P <0,0001) (fig. S3A).

Anche l’emorragia polmonare è stata significativamente ridotta di 5 dpi con il trattamento EIDD-2801 da 500 mg / kg (Kruskal-Wallis Test, P = 0,010, fig. S3B). È interessante notare che c’è stata una riduzione dose-dipendente del titolo polmonare SARS-CoV (titoli mediani: 50 mg / kg = 7E + 03 pfu / mL, 150 mg / kg = 2,5E + 03 pfu / mL, 500 mg / kg = 50 pfu / mL, veicolo = 6.5E + 04 pfu / mL) con differenze significative (Kruskal-Wallis con il test comparativo multiplo di Dunn) tra il veicolo, 150 mg / kg (P = 0,03) e 500 mg / kg (P = 0,006) gruppi. Pertanto, la profilassi EIDD-2801 somministrata per via orale era fortemente antivirale e in grado di prevenire la replicazione e la malattia di SARS-CoV.

Poiché solo il gruppo 500 mg / kg ha ridotto significativamente la perdita di peso, l’emorragia e ridotto il titolo polmonare a livelli quasi non rilevabili, abbiamo testato questa dose in condizioni di trattamento terapeutico per determinare se l’EIDD-2801 potrebbe migliorare gli esiti di un’infezione da CoV in corso. Come controllo, abbiamo avviato il veicolo orale o EIDD-2801 2 ore prima dell’infezione con 1E + 04 pfu SARS-MA15.

Per condizioni terapeutiche, abbiamo iniziato il trattamento EIDD-2801 12, 24 o 48 ore dopo l’infezione. Dopo l’inizio del trattamento, la dose per tutti i gruppi è stata eseguita ogni 12 ore per la durata dello studio. Entrambi i trattamenti profilattici sono iniziati 2 ore prima dell’infezione e il trattamento terapeutico iniziato 12 ore dopo l’infezione in modo significativo (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey) ha impedito la perdita di peso corporeo a seguito dell’infezione SARS-CoV su 2 dpi e successivamente (-2 ore: P = Da 0.0002 a <0,0001; +12 ore: P = da 0,0289 a <0,0001) rispetto agli animali trattati con veicoli ( Fig. 6A ).

Il trattamento iniziato 24 hpi ha anche ridotto significativamente la perdita di peso corporeo (3-5 dpi, P = da 0,01 a <0,0001) sebbene non nella stessa misura dei precedenti gruppi di inizio trattamento. Quando iniziata 48 hpi, la perdita di peso corporeo era diversa dal veicolo solo su 4 dpi (P = 0,037,  Fig. 6A ).

L’EIDD-2801 terapeutico (Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunnett) ha ridotto l’emorragia polmonare quando iniziata fino a 24 ore dopo l’infezione (-2, +12 e +24 ore P <0,0001) rispecchiando i fenotipi di perdita di peso corporeo ( Fig. 6B ). È interessante notare che tutti i topi trattati con EIDD-2801 avevano significativamente (Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunnett) ridotto le cariche virali nei polmoni anche nel gruppo +48 ore (Tutti P <0,0001,  Fig. 6C ), che avevano la minima protezione da perdita di peso corporeo ed emorragia polmonare. Abbiamo anche misurato la funzione polmonare attraverso la pletismografia del corpo intero (WBP).

Nella  Fig. 6D , mostriamo che la metrica di pausa avanzata (PenH) del WBP, che è un marker surrogato per broncocostrizione o ostruzione polmonare ( 27 ), è stata significativamente migliorata (ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Dunnett) migliorata nel corso dello studio se il trattamento è stato iniziato fino a 12 ore dopo l’infezione (-2 ore: da 2d pi a 5 dpi, P <0,00

Da 01 a 0,019, +12 ore: da 2 dpi a 5 dpi, P <da 0,0001 a 0,0192) anche se il gruppo +24 ore ha mostrato anche un miglioramento sporadico (3 dpi P = 0,002) ( Fig. 6D ). Infine, abbiamo valutato ciecamente le sezioni di tessuto polmonare ematossilina ed eosina colorate per le caratteristiche istologiche di ALI utilizzando due strumenti di punteggio diversi e complementari ( 18 ), che mostrano che il trattamento iniziato fino a +12 ore ha ridotto significativamente l’ALI (Kruskal-Wallis con il confronto multiplo di Dunn test) (American Thoracic Society (ATS) Punteggio di lesioni polmonari: -2 ore P = 0,0004, +12 ore P = 0,0053, Punteggio danno alveolare diffuso (DAD): -2 ore P = 0,0015, +12 ore P = 0,0004,  Fig 6E). Complessivamente, l’EIDD-2801 terapeutico era fortemente antivirale contro SARS-CoV in vivo, ma il grado di beneficio clinico dipendeva dal tempo di inizio post-infezione.

Fig. 6 EIDD-2801 profilattico e terapeutico riduce la replicazione e la patogenesi della SARS-CoV . Numero equivalente di topi C57BL / 6 maschi e femmine di 25-29 settimane di età sono stati somministrati al veicolo (10% PEG, 2,5% Cremophor RH40 in acqua) o al profarmaco NHC EIDD-2801 a partire da -2 ore, +12, +24 o +48 ore dopo l’infezione e successivamente ogni 12 ore per via orale (n = 10 / gruppo). I topi sono stati infettati per via intranasale con ceppo SARS-CoV MA15 adattato al mouse PFU 1E + 04. (A)  Peso iniziale percentuale. Gli asterischi indicano differenze rispetto al veicolo trattato dall’ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey. ( B)  Emorragia polmonare nei topi dal pannello  A  segnata su una scala da 0 a 4, dove 0 è un polmone sano rosa normale e 4 è un polmone rosso scuro diffusamente scolorito. (C)  Titolo del polmone del virus nei topi dal pannello  A  come determinato dal test della placca. Gli asterischi in entrambi i pannelli  B  e  C  indicano differenze rispetto al veicolo per ANOVA a una via con un test di confronto multiplo di Dunnett. ( D)  La funzione polmonare mediante pletismografia di tutto il corpo è stata eseguita quotidianamente su cinque animali per gruppo. Gli asterischi indicano differenze rispetto al veicolo per ANOVA a due vie con un test di confronto multiplo di Dunnett. (E) Le caratteristiche istologiche della lesione polmonare acuta (ALI) sono state valutate alla cieca utilizzando il sistema di punteggio degli infortuni polmonari dell’American Thoracic Society e un sistema di punteggio alveolare diffuso. Sono stati valutati tre campi ad alta potenza scelti a caso (60X) di polmone malato per topo. Il numero di topi segnati per gruppo: Veicolo N = 7, -2 ore N = 9, +12 ore N = 9, +24 ore N = 10, +48 ore N = 9. Gli asterischi indicano un significato statistico rispetto al veicolo di Kruskal -Wallis con un test di confronto multiplo di Dunn. Per tutti i pannelli, le scatole comprendono dal 25 ° al 75 ° percentile, la linea è alla mediana, mentre i baffi rappresentano l’intervallo. *, -2 ore e +12 ore rispetto al veicolo; **, +24 ore rispetto al veicolo; ***, +48 ore rispetto al veicolo.

L’efficacia profilattica e terapeutica dell’EIDD-2801 è correlata all’aumento del tasso di mutazione MERS-CoV

Dopo aver ottenuto dati promettenti sull’efficacia in vivo con SARS-CoV, abbiamo studiato se l’EIDD-2801 sarebbe efficace contro MERS-CoV. Poiché l’ortoologo murino del recettore MERS-CoV, dipeptidil peptidasi 4 (DPP4), non supporta il legame e l’ingresso virali, tutti gli studi in vivo sono stati condotti su topi geneticamente modificati codificanti un recettore DPP4 murino codificante per due residui umani nelle posizioni 288 e 330 (topi hDPP4 288/330) ( 18 ,  28). Simile ai nostri dati SARS-CoV, tutte le dosi di topi profilattici EIDD-2801 (50, 150 e 500 mg / kg) hanno protetto i topi hDPP4 288/330 (fig. S4) da una significativa perdita di peso corporeo (ANOVA a due vie con confronto multiplo di Dunnett test, P = da 0,03 a <0,0001), emorragia polmonare (Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn, P = da 0,01 a <0,0001) e replicazione virale non rilevabile (Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn, P <0,0001) indipendentemente dalla dose del farmaco a seguito di infezione intranasale con MERS-CoV adattato al topo 5E + 04 PFU (fig. S4).

Abbiamo quindi valutato l’efficacia terapeutica EIDD-2801 seguendo i promettenti risultati dei nostri studi profilattici. Simile al nostro studio SARS-CoV, il trattamento EIDD-2801 somministrato prima o 12 ore dopo l’infezione MERS-CoV adattata per via endovenosa da topo (5E + 04 PFU) ha impedito la perdita di peso corporeo da 2 a 6 dpi (ANOVA a due vie con confronto multiplo di Tukey test,  Fig. 7A , P = da 0,02 a <0,0001) ed emorragia polmonare su 6 dpi (Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn, P = da 0,0004 a <0,0001,  Fig. 7B), ma il trattamento iniziato 24 o 48 ore non offriva una protezione simile. A differenza dei dati relativi alla perdita di peso corporeo e all’emorragia polmonare che variavano in base al tempo di inizio del trattamento, il titolo del polmone virale su 6 dpi era significativamente ridotto al limite di rilevazione in tutti i gruppi di trattamento (Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn,  Fig. 7C , P <0,0001 ).

È interessante notare che quando l’RNA genomico virale è stato quantificato in campioni accoppiati di tessuto polmonare, l’EIDD-2801 ha ridotto significativamente le quantità di RNA virale (ANOVA a una via con test di confronto multiplo di Dunnett, P <0,0001-0,017) in modo dipendente dal tempo di iniziazione per tutti gruppi tranne per +48 ore ( Fig. 7D ).

La discrepanza tra i titoli infettivi e l’RNA virale suggerisce che le mutazioni accumulate rendono le particelle non infettive e non rilevabili dal test della placca, coerenti con il MOA. Per valutare l’effetto del trattamento EIDD-2801 sulla funzione polmonare, abbiamo valutato la funzione polmonare mediante WBP. Rispecchiando i dati sulla perdita di peso corporeo, la normale funzione polmonare è stata osservata solo nei gruppi in cui il trattamento è stato iniziato prima o 12 ore dopo l’infezione (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey, -2 ore: P <0,0001 3 dpi, P = 0,0002 4 dpi, + 12 ore: P <0,0001 3 dpi, P = 0,0008 4 dpi,  Fig. 7E ). Collettivamente, questi dati dimostrano che il profarmaco NHC, EIDD-2801, riduce fortemente i titoli infettivi di MERS-CoV, l’RNA virale e la patogenesi sia in condizioni profilattiche che terapeutiche precoci.

Fig. 7 EIDD-2801 profilattico e terapeutico riduce la replicazione MERS-CoV e la patogenesi coincidenti con un aumento dei tassi di mutazione virale . Numeri equivalenti di topi C57BL / 6 hDPP4 maschi e femmine di età compresa tra 10 e 14 settimane sono stati somministrati al veicolo (10% PEG, 2,5% Cremophor RH40 in acqua) o al profarmaco NHC EIDD-2801 a partire da -2 ore, +12, +24 o + 48 ore dopo l’infezione e successivamente ogni 12 ore per via orale (n = 10 / gruppo). I topi sono stati infettati per via intranasale con ceppo MERS-CoV M35C4 adattato al mouse 5F + 04 PFU. ( A)  Peso iniziale percentuale. Gli asterischi indicano differenze tra -2 ore e +12 ore di gruppo dal veicolo per ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey. ( B)  Emorragia polmonare nei topi dal pannello  A segnato su una scala da 0 a 4 dove 0 è un normale polmone sano rosa e 4 è un polmone rosso scuro diffusamente scolorito. (C)  Titolo del polmone del virus nei topi dal pannello  A  come determinato dal test della placca. Gli asterischi in entrambi i pannelli  B  e  C  indicano differenze rispetto al veicolo di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. (D)  RNA genomico MERS-CoV nel tessuto polmonare mediante qRT-PCR. Gli asterischi indicano differenze per ANOVA a senso unico con un test di confronto multiplo di Dunnett. (E)  La funzione polmonare mediante pletismografia di tutto il corpo è stata eseguita quotidianamente su quattro animali per gruppo. Gli asterischi indicano differenze rispetto al veicolo per ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey. (F) Flusso di lavoro per misurare il tasso di mutazione nell’RNA MERS-CoV e nella trascrizione dell’ospite ISG15 mediante Primer ID nel tessuto polmonare del topo. (G)  Numero di sequenze di consenso modello (TCS) per MERS-CoV nsp10 e ISG15. (H)  Tasso di errore totale in MERS-CoV nsp10 e ISG15. (I)  Il tasso di transizione da citosina a uridina in MERS-CoV nsp10 e ISG15. Nei pannelli  GI, gli  asterischi indicano differenze rispetto al veicolo per ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey. (J)  Frequenza di cambio codone in MERS-CoV nsp10. Gli asterischi indicano differenze rispetto al veicolo di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn. Per tutti i pannelli, le scatole comprendono dal 25 ° al 75 ° percentile, la linea è alla mediana, mentre i baffi rappresentano l’intervallo.

Per studiare i meccanismi molecolari associati alle prestazioni dei farmaci in vivo, abbiamo studiato la correlazione tra produzione di virus infettivo e mutagenesi mediata da EIDD-2801 dell’RNA MERS-CoV in condizioni di trattamento terapeutico. Usando Primer ID NGS, abbiamo misurato i tassi di mutazione dell’RNA genomico virale (proteina non strutturale 10, nsp10) e dell’mRNA del gene 15 ( ISG15 ) stimolato dall’interferone ospite , un gene immuno-innato altamente regolato dopo l’infezione da MERS-CoV ( Fig. 7F ).

Primer ID NGS misura la frequenza mutazionale in singole molecole di RNA, ognuna delle quali è rappresentata da una singola sequenza di consenso del modello (TCS) ( 25 ). La TCS virale è stata significativamente ridotta (ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey, -2 ore P <0,0001, +12 ore P = 0,0001, +24 ore P = 0,02) in modo dipendente dal tempo di inizio del trattamento ( Fig. 7G ) simile all’RNA genomico virale misurato da qRT-PCR. Al contrario, il numero di ISG15 TCS era simile (P = da 0,2 a 0,8) per tutti i gruppi, indicando che né il veicolo né il trattamento farmacologico hanno influenzato in modo significativo i livelli o le mutate trascrizioni dell’mRNA ISG15 ( Fig. 7G ).

Simile ai nostri dati TCS in  Fig. 6G , il tasso di errore totale in nsp10 virale è stato significativamente aumentato (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey) nei gruppi in cui il trattamento è stato iniziato prima (-2 ore, tasso di errore mediano = 10,5 errori / 10.000 basi, P <0,0001) e fino a 24 ore dopo l’infezione (12 ore, tasso di errore mediano = 8,2 errori / 10.000 basi, P <0,0001; +24 ore, tasso di errore mediano = 5,4 errori / 10.000 basi, P = 0,0003 ), ma i tassi di errore in ISG15 sono rimasti al basale per tutti i gruppi ( Fig. 7H ).

Inoltre, le transizioni nucleotidiche osservate nei genomi MERS-CoV in vitro, sono state osservate anche in vivo in gruppi in cui il trattamento è stato iniziato prima e fino a 12 ore dopo l’infezione (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey, P = da 0.0003 a < 0,0001) ( Fig. 7I ).

È importante sottolineare che queste transizioni non sono state osservate nell’mRNA dell’ISG15 ospite ( Fig. 7I ). Infine, la mutagenesi dose-dipendente EIDD-2801 di RNA virale correlata con un aumento della frequenza di cambiamento del codone, compresi i codoni di arresto, nei topi in cui il trattamento è stato iniziato 12 ore o prima (ANOVA bidirezionale con test di confronto multiplo di Tukey, mediana del veicolo = 3.4; -2 ore mediana = 22,8, P = 0,0035; +12 ore mediana = 20,0, P = 0,0004,  Fig. 7J ).

Pertanto, circa il 20% delle mutazioni osservate nei gruppi -2 ore e +12 ore ha provocato una modifica del codone e un’alterazione della sequenza proteica nsp10. Quando si estrapolano i nostri risultati da nsp10 a tutto il genoma MERS-CoV 30kb, EIDD-2801 probabilmente causa tra 15 (+24 ore di trattamento) e 30 (-2 ore di trattamento) mutazioni per genoma, il 10-20% dei quali determina cambiamenti nella codifica degli aminoacidi.

Complessivamente, i nostri dati dimostrano che la mutagenesi guidata da EIDD-2801 si correla bene con le riduzioni della carica virale, fortemente indicative di un meccanismo d’azione guidato dalla catastrofe di errore in condizioni terapeutiche.


Fonte:
University of North Carolina a Chapel Hill

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