Gli scienziati sperano che un nuovo farmaco – chiamato EIDD-2801 – possa cambiare il modo in cui i medici trattano il COVID-19.
Il farmaco mostra risultati promettenti nel ridurre il danno polmonare, ha terminato i test sui topi e presto passerà agli studi clinici sull’uomo.
A partire dal 3 aprile, il nuovo coronavirus SARS-CoV-2 aveva infettato più di 1 milione di persone con COVID-19 e causato oltre 58.000 morti in una pandemia in tutto il mondo.
Attualmente, nessun farmaco antivirale è stato approvato per il trattamento della SARS-CoV-2 o di uno qualsiasi degli altri coronavirus che causano malattie nell’uomo.
I ricercatori della UNC-Chapel Hill Gillings School of Global Public Health stanno svolgendo un ruolo chiave nello sviluppo e nel collaudo dell’EIDD-2801.
I virologi nel laboratorio di William R. Kenan Jr. Distinto professore di epidemiologia Ralph Baric, stanno lavorando con i colleghi del laboratorio di Mark Denison, Edward Claiborne Stahlman Professore di pediatria presso il Vanderbilt University Medical Center (VUMC) e con George Painter, capo direttore esecutivo del no profit DRIVE (Drug Innovation Ventures presso Emory) e direttore dell’Emory Institute for Drug Development (EIDD), dove è stato scoperto l’EIDD-2801.
I risultati dello studio più recente del team sono stati pubblicati online il 6 aprile dalla rivista Science Translational Medicine .
L’articolo include dati provenienti da cellule polmonari umane in coltura infette da SARS-CoV-2 , nonché da topi infetti dai relativi coronavirus SARS-CoV e MERS-CoV.
Lo studio ha scoperto che, quando usato come profilattico, l’EIDD-2801 può prevenire gravi lesioni polmonari nei topi infetti.
EIDD-2801 è una forma disponibile per via orale del composto antivirale EIDD-1931; può essere preso come una pillola e può essere adeguatamente assorbito per viaggiare nei polmoni.
Quando somministrato come trattamento 12 o 24 ore dopo l’inizio dell’infezione, EIDD-2801 può ridurre il grado di danno polmonare e la perdita di peso nei topi.
Questa finestra di opportunità dovrebbe essere più lunga negli esseri umani, poiché il periodo tra l’insorgenza della malattia di coronavirus e la morte è generalmente esteso nell’uomo rispetto ai topi.
“Questo nuovo farmaco non solo ha un alto potenziale per il trattamento dei pazienti con COVID-19, ma sembra anche efficace per il trattamento di altre gravi infezioni da coronavirus”, ha affermato l’autore senior Baric.
Rispetto ad altri potenziali trattamenti COVID-19 che devono essere somministrati per via endovenosa, EIDD-2801 può essere somministrato per via orale come una pillola.
Oltre alla facilità di trattamento, ciò offre un potenziale vantaggio per il trattamento di pazienti meno malati o per la profilassi, ad esempio in una casa di cura in cui molte persone sono state esposte ma non sono ancora malate.
“Siamo sorpresi dalla capacità di EIDD-1931 e -2801 di inibire tutti i coronavirus testati e il potenziale trattamento orale di COVID-19.
Questo lavoro mostra l’importanza del supporto del National Institutes of Health (NIH) in corso per la ricerca collaborativa per lo sviluppo di antivirali per tutti i virus pandemici, non solo per i coronavirus ”, ha affermato Andrea Pruijssers, il principale scienziato antivirale del Denison Lab presso VUMC.
Denison è stato autore senior di uno studio del dicembre 2019 che ha riferito per la prima volta che l’EIDD-1931 ha bloccato la replicazione di un ampio spettro di coronavirus.
Questi collaboratori interistituzionali, supportati da una sovvenzione NIH attraverso l’Università dell’Alabama a Birmingham, hanno anche eseguito lo sviluppo preclinico di remdesivir, un altro farmaco antivirale attualmente in sperimentazione clinica su pazienti con COVID-19.
Nel nuovo articolo di Science Translational Medicine, Maria Agostini, postdottorato nel laboratorio di Denison, ha dimostrato che i virus che mostrano resistenza a remdesivir subiscono una maggiore inibizione da EIDD-1931.
“I virus che portano mutazioni di resistenza a remdesivir sono in realtà più sensibili all’EIDD-1931 e viceversa, suggerendo che i due farmaci potrebbero essere combinati per una maggiore efficacia e per prevenire l’insorgere di resistenza”, ha detto Painter.
Gli studi clinici sull’EIDD-2801 nell’uomo dovrebbero iniziare più tardi questa primavera.
Se avranno successo, il farmaco potrebbe non solo essere utilizzato per limitare la diffusione di SARS-CoV-2, ma potrebbe anche controllare i futuri focolai di altri coronavirus emergenti.
“Con tre nuovi coronavirus umani emersi negli ultimi 20 anni, è probabile che continueremo a vedere di più”, ha affermato il primo autore Timothy Sheahan, assistente professore di epidemiologia di Gillings e collaboratore del Baric Lab. “EIDD-2801 promette non solo di trattare oggi i pazienti COVID-19, ma anche di trattare nuovi coronavirus che potrebbero emergere in futuro.”
L’EIDD-2801 terapeutico riduce la replicazione e la patogenesi della SARS-CoV
Data la promettente attività antivirale di NHC in vitro, abbiamo successivamente valutato la sua efficacia in vivo usando EIDD-2801, un profarmaco biodisponibile per via orale di NHC (β-DN 4 -idrossicitidina-5′-isopropil estere), progettato per migliorare la farmacocinetica in vivo e biodisponibilità orale nell’uomo e nei primati non umani ( 15 ).
È importante sottolineare che i profili plasmatici di NHC e EIDD-2801 sono simili nei topi dopo somministrazione orale ( 15 ). Prima abbiamo eseguito uno studio profilattico di aumento della dose in topi C57BL / 6 in cui abbiamo somministrato per via orale veicolo (10% PEG, 2,5% Cremoforo RH40 in acqua) o 50, 150 o 500 mg / kg EIDD-2801 2 ore prima dell’infezione intranasale con 5E +04 PFU di SARS-CoV adattato per topo (SARS-MA15), e successivamente veicolo o farmaco ogni 12 ore successive.
A partire da 3 giorni dopo l’infezione (dpi) e fino alla fine dello studio, la perdita di peso corporeo rispetto al trattamento con il veicolo è stata significativamente ridotta (50 mg / kg) o prevenuta (150, 500 mg / kg) con la profilassi EIDD-2801 ( ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Dunnett, P <0,0001) (fig. S3A).
Anche l’emorragia polmonare è stata significativamente ridotta di 5 dpi con il trattamento EIDD-2801 da 500 mg / kg (Kruskal-Wallis Test, P = 0,010, fig. S3B). È interessante notare che c’è stata una riduzione dose-dipendente del titolo polmonare SARS-CoV (titoli mediani: 50 mg / kg = 7E + 03 pfu / mL, 150 mg / kg = 2,5E + 03 pfu / mL, 500 mg / kg = 50 pfu / mL, veicolo = 6.5E + 04 pfu / mL) con differenze significative (Kruskal-Wallis con il test comparativo multiplo di Dunn) tra il veicolo, 150 mg / kg (P = 0,03) e 500 mg / kg (P = 0,006) gruppi. Pertanto, la profilassi EIDD-2801 somministrata per via orale era fortemente antivirale e in grado di prevenire la replicazione e la malattia di SARS-CoV.
Poiché solo il gruppo 500 mg / kg ha ridotto significativamente la perdita di peso, l’emorragia e ridotto il titolo polmonare a livelli quasi non rilevabili, abbiamo testato questa dose in condizioni di trattamento terapeutico per determinare se l’EIDD-2801 potrebbe migliorare gli esiti di un’infezione da CoV in corso. Come controllo, abbiamo avviato il veicolo orale o EIDD-2801 2 ore prima dell’infezione con 1E + 04 pfu SARS-MA15.
Per condizioni terapeutiche, abbiamo iniziato il trattamento EIDD-2801 12, 24 o 48 ore dopo l’infezione. Dopo l’inizio del trattamento, la dose per tutti i gruppi è stata eseguita ogni 12 ore per la durata dello studio. Entrambi i trattamenti profilattici sono iniziati 2 ore prima dell’infezione e il trattamento terapeutico iniziato 12 ore dopo l’infezione in modo significativo (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey) ha impedito la perdita di peso corporeo a seguito dell’infezione SARS-CoV su 2 dpi e successivamente (-2 ore: P = Da 0.0002 a <0,0001; +12 ore: P = da 0,0289 a <0,0001) rispetto agli animali trattati con veicoli ( Fig. 6A ).
Il trattamento iniziato 24 hpi ha anche ridotto significativamente la perdita di peso corporeo (3-5 dpi, P = da 0,01 a <0,0001) sebbene non nella stessa misura dei precedenti gruppi di inizio trattamento. Quando iniziata 48 hpi, la perdita di peso corporeo era diversa dal veicolo solo su 4 dpi (P = 0,037, Fig. 6A ).
L’EIDD-2801 terapeutico (Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunnett) ha ridotto l’emorragia polmonare quando iniziata fino a 24 ore dopo l’infezione (-2, +12 e +24 ore P <0,0001) rispecchiando i fenotipi di perdita di peso corporeo ( Fig. 6B ). È interessante notare che tutti i topi trattati con EIDD-2801 avevano significativamente (Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunnett) ridotto le cariche virali nei polmoni anche nel gruppo +48 ore (Tutti P <0,0001, Fig. 6C ), che avevano la minima protezione da perdita di peso corporeo ed emorragia polmonare. Abbiamo anche misurato la funzione polmonare attraverso la pletismografia del corpo intero (WBP).
Nella Fig. 6D , mostriamo che la metrica di pausa avanzata (PenH) del WBP, che è un marker surrogato per broncocostrizione o ostruzione polmonare ( 27 ), è stata significativamente migliorata (ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Dunnett) migliorata nel corso dello studio se il trattamento è stato iniziato fino a 12 ore dopo l’infezione (-2 ore: da 2d pi a 5 dpi, P <0,00
Da 01 a 0,019, +12 ore: da 2 dpi a 5 dpi, P <da 0,0001 a 0,0192) anche se il gruppo +24 ore ha mostrato anche un miglioramento sporadico (3 dpi P = 0,002) ( Fig. 6D ). Infine, abbiamo valutato ciecamente le sezioni di tessuto polmonare ematossilina ed eosina colorate per le caratteristiche istologiche di ALI utilizzando due strumenti di punteggio diversi e complementari ( 18 ), che mostrano che il trattamento iniziato fino a +12 ore ha ridotto significativamente l’ALI (Kruskal-Wallis con il confronto multiplo di Dunn test) (American Thoracic Society (ATS) Punteggio di lesioni polmonari: -2 ore P = 0,0004, +12 ore P = 0,0053, Punteggio danno alveolare diffuso (DAD): -2 ore P = 0,0015, +12 ore P = 0,0004, Fig 6E). Complessivamente, l’EIDD-2801 terapeutico era fortemente antivirale contro SARS-CoV in vivo, ma il grado di beneficio clinico dipendeva dal tempo di inizio post-infezione.
L’efficacia profilattica e terapeutica dell’EIDD-2801 è correlata all’aumento del tasso di mutazione MERS-CoV
Dopo aver ottenuto dati promettenti sull’efficacia in vivo con SARS-CoV, abbiamo studiato se l’EIDD-2801 sarebbe efficace contro MERS-CoV. Poiché l’ortoologo murino del recettore MERS-CoV, dipeptidil peptidasi 4 (DPP4), non supporta il legame e l’ingresso virali, tutti gli studi in vivo sono stati condotti su topi geneticamente modificati codificanti un recettore DPP4 murino codificante per due residui umani nelle posizioni 288 e 330 (topi hDPP4 288/330) ( 18 , 28). Simile ai nostri dati SARS-CoV, tutte le dosi di topi profilattici EIDD-2801 (50, 150 e 500 mg / kg) hanno protetto i topi hDPP4 288/330 (fig. S4) da una significativa perdita di peso corporeo (ANOVA a due vie con confronto multiplo di Dunnett test, P = da 0,03 a <0,0001), emorragia polmonare (Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn, P = da 0,01 a <0,0001) e replicazione virale non rilevabile (Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn, P <0,0001) indipendentemente dalla dose del farmaco a seguito di infezione intranasale con MERS-CoV adattato al topo 5E + 04 PFU (fig. S4).
Abbiamo quindi valutato l’efficacia terapeutica EIDD-2801 seguendo i promettenti risultati dei nostri studi profilattici. Simile al nostro studio SARS-CoV, il trattamento EIDD-2801 somministrato prima o 12 ore dopo l’infezione MERS-CoV adattata per via endovenosa da topo (5E + 04 PFU) ha impedito la perdita di peso corporeo da 2 a 6 dpi (ANOVA a due vie con confronto multiplo di Tukey test, Fig. 7A , P = da 0,02 a <0,0001) ed emorragia polmonare su 6 dpi (Kruskal-Wallis con test di confronto multiplo di Dunn, P = da 0,0004 a <0,0001, Fig. 7B), ma il trattamento iniziato 24 o 48 ore non offriva una protezione simile. A differenza dei dati relativi alla perdita di peso corporeo e all’emorragia polmonare che variavano in base al tempo di inizio del trattamento, il titolo del polmone virale su 6 dpi era significativamente ridotto al limite di rilevazione in tutti i gruppi di trattamento (Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn, Fig. 7C , P <0,0001 ).
È interessante notare che quando l’RNA genomico virale è stato quantificato in campioni accoppiati di tessuto polmonare, l’EIDD-2801 ha ridotto significativamente le quantità di RNA virale (ANOVA a una via con test di confronto multiplo di Dunnett, P <0,0001-0,017) in modo dipendente dal tempo di iniziazione per tutti gruppi tranne per +48 ore ( Fig. 7D ).
La discrepanza tra i titoli infettivi e l’RNA virale suggerisce che le mutazioni accumulate rendono le particelle non infettive e non rilevabili dal test della placca, coerenti con il MOA. Per valutare l’effetto del trattamento EIDD-2801 sulla funzione polmonare, abbiamo valutato la funzione polmonare mediante WBP. Rispecchiando i dati sulla perdita di peso corporeo, la normale funzione polmonare è stata osservata solo nei gruppi in cui il trattamento è stato iniziato prima o 12 ore dopo l’infezione (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey, -2 ore: P <0,0001 3 dpi, P = 0,0002 4 dpi, + 12 ore: P <0,0001 3 dpi, P = 0,0008 4 dpi, Fig. 7E ). Collettivamente, questi dati dimostrano che il profarmaco NHC, EIDD-2801, riduce fortemente i titoli infettivi di MERS-CoV, l’RNA virale e la patogenesi sia in condizioni profilattiche che terapeutiche precoci.
Per studiare i meccanismi molecolari associati alle prestazioni dei farmaci in vivo, abbiamo studiato la correlazione tra produzione di virus infettivo e mutagenesi mediata da EIDD-2801 dell’RNA MERS-CoV in condizioni di trattamento terapeutico. Usando Primer ID NGS, abbiamo misurato i tassi di mutazione dell’RNA genomico virale (proteina non strutturale 10, nsp10) e dell’mRNA del gene 15 ( ISG15 ) stimolato dall’interferone ospite , un gene immuno-innato altamente regolato dopo l’infezione da MERS-CoV ( Fig. 7F ).
Primer ID NGS misura la frequenza mutazionale in singole molecole di RNA, ognuna delle quali è rappresentata da una singola sequenza di consenso del modello (TCS) ( 25 ). La TCS virale è stata significativamente ridotta (ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey, -2 ore P <0,0001, +12 ore P = 0,0001, +24 ore P = 0,02) in modo dipendente dal tempo di inizio del trattamento ( Fig. 7G ) simile all’RNA genomico virale misurato da qRT-PCR. Al contrario, il numero di ISG15 TCS era simile (P = da 0,2 a 0,8) per tutti i gruppi, indicando che né il veicolo né il trattamento farmacologico hanno influenzato in modo significativo i livelli o le mutate trascrizioni dell’mRNA ISG15 ( Fig. 7G ).
Simile ai nostri dati TCS in Fig. 6G , il tasso di errore totale in nsp10 virale è stato significativamente aumentato (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey) nei gruppi in cui il trattamento è stato iniziato prima (-2 ore, tasso di errore mediano = 10,5 errori / 10.000 basi, P <0,0001) e fino a 24 ore dopo l’infezione (12 ore, tasso di errore mediano = 8,2 errori / 10.000 basi, P <0,0001; +24 ore, tasso di errore mediano = 5,4 errori / 10.000 basi, P = 0,0003 ), ma i tassi di errore in ISG15 sono rimasti al basale per tutti i gruppi ( Fig. 7H ).
Inoltre, le transizioni nucleotidiche osservate nei genomi MERS-CoV in vitro, sono state osservate anche in vivo in gruppi in cui il trattamento è stato iniziato prima e fino a 12 ore dopo l’infezione (ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey, P = da 0.0003 a < 0,0001) ( Fig. 7I ).
È importante sottolineare che queste transizioni non sono state osservate nell’mRNA dell’ISG15 ospite ( Fig. 7I ). Infine, la mutagenesi dose-dipendente EIDD-2801 di RNA virale correlata con un aumento della frequenza di cambiamento del codone, compresi i codoni di arresto, nei topi in cui il trattamento è stato iniziato 12 ore o prima (ANOVA bidirezionale con test di confronto multiplo di Tukey, mediana del veicolo = 3.4; -2 ore mediana = 22,8, P = 0,0035; +12 ore mediana = 20,0, P = 0,0004, Fig. 7J ).
Pertanto, circa il 20% delle mutazioni osservate nei gruppi -2 ore e +12 ore ha provocato una modifica del codone e un’alterazione della sequenza proteica nsp10. Quando si estrapolano i nostri risultati da nsp10 a tutto il genoma MERS-CoV 30kb, EIDD-2801 probabilmente causa tra 15 (+24 ore di trattamento) e 30 (-2 ore di trattamento) mutazioni per genoma, il 10-20% dei quali determina cambiamenti nella codifica degli aminoacidi.
Complessivamente, i nostri dati dimostrano che la mutagenesi guidata da EIDD-2801 si correla bene con le riduzioni della carica virale, fortemente indicative di un meccanismo d’azione guidato dalla catastrofe di errore in condizioni terapeutiche.
