COVID-19: nuovo studio clinico sta trattando pazienti con ossido nitrico – ha proprietà antivirali contro i coronavirus

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L’Università dell’Alabama di Birmingham è stata selezionata per iniziare a arruolare pazienti in uno studio internazionale che ha valutato l’uso dell’ossido nitrico per inalazione (iNO) per migliorare i risultati per i pazienti COVID-19 con polmoni gravemente danneggiati.

Attualmente, non ci sono opzioni di trattamento approvate disponibili contro il virus SARS-CoV-2, che causa COVID-19, anche se molti farmaci sono attualmente in fase di test per vedere se possono essere efficaci.

La sindrome da distress respiratorio acuto, una grave forma di insufficienza polmonare, è la principale causa di morte in COVID-19.

iNO è stato usato per il trattamento di insufficienza polmonare, ma è stato anche scoperto che ha proprietà antivirali contro i coronavirus.

L’effetto antivirale di iNO è stato testato e dimostrato durante la pandemia di SARS 2002-2003, causata da un coronavirus simile chiamato virus SARS-CoV.

Quando i polmoni falliscono, alcune parti dei polmoni ricevono aria mentre altre no.

iNO è un gas che migliora il flusso sanguigno verso le aree polmonari che ricevono aria, aumentando la quantità di ossigeno circolante nel flusso sanguigno.

Riduce anche il lavoro del lato destro del cuore, che è sottoposto a stress estremo durante condizioni di insufficienza polmonare, come una grave infezione da COVID-19.

Con l’inizio di questo studio, qualsiasi paziente COVID-19 ammesso in terapia intensiva UAB e che sta respirando con l’assistenza di un ventilatore può potenzialmente qualificarsi per lo studio.

“Questo studio consentirà ai pazienti COVID-19 più malati all’UAB di accedere a una terapia di salvataggio che può avere benefici antivirali oltre a migliorare lo stato dei polmoni”, ha affermato Vibhu Parcha, MD, ricercatore presso la Divisione di malattie cardiovascolari dell’UAB.

Pankaj Arora, MD, assistente professore della divisione, sta guidando gli sforzi dell’UAB nel fornire questa opzione terapeutica ai pazienti idonei COVID-19.

Il meccanismo di beneficio di iNO potrebbe essere l’effetto antivirale diretto, come mostrato nella pandemia di SARS 2003, la modulazione dello stress ossidativo o il miglioramento della corrispondenza della perfusione della ventilazione nei polmoni, afferma Arora. 

Il suo gruppo prevede di studiare gli effetti cardiovascolari del NO per inalazione ad alte dosi in uno sforzo accessorio alla sperimentazione clinica primaria.

“Nell’uomo, l’ossido nitrico viene generato all’interno dei vasi sanguigni e regola la pressione sanguigna, previene la formazione di coaguli e distrugge anche potenziali tossine”, ha detto Arora.

Il team UAB afferma che questa pandemia ha portato a una straordinaria risposta unificante da parte della comunità medica, inclusi medici in terapia intensiva, infermieri, terapisti respiratori, specialisti in studi clinici, revisori e amministratori medici, consentendo autorizzazioni più veloci del normale per studi di ricerca potenzialmente salvavita.

“Il fatto che siamo in grado di avviare rapidamente questo studio è dovuto alle collaborazioni tra specialità e settori di competenza presso l’UAB con l’obiettivo comune di fornire la massima qualità di assistenza scientificamente provata per i nostri pazienti COVID-19”, ha affermato Arora.

“Stiamo tutti cercando di combatterlo insieme e spero, con la nostra resilienza, di superare questi momenti difficili.”


Ossido nitrico (inalato):

  1. Akerstrom S, Mousavi-Jazi M, Klingstom J et al. L’ossido nitrico inibisce il ciclo di replicazione della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus. J Virol. 2005; 79 (3): 1966-9. PMID: 15650225 DOI: 10.1128 / JVI.79.3.1966-1969.2005
  2. Chen L, Liu P, Gao H et al. Inalazione di ossido nitrico nel trattamento della sindrome respiratoria gravemente acuta: una prova di salvataggio a Pechino. Clin Infect Dis. 2004; 39 (10): 1531-5. PMID: 15546092 DOI: 10.1086 / 425357
  3. Biblioteca nazionale di medicina degli Stati Uniti. ClinicalTrials.gov. Accesso al 2020, 2 aprile. Disponibile su https://clinicaltrials.gov.
  4. Fuller BM, Mohr NM, Skrupky L et al. L’uso di prostaglandine per inalazione in pazienti con ARDS: una revisione sistematica e una meta-analisi. Il petto. 2015; 147 (6): 1510-1522. PMID: 25742022 DOI: 10.1378 / petto.14-3161
  5. Griffiths MJD, McAuley DF, Perkins GD et al. Linee guida per la gestione della sindrome da distress respiratorio acuto. BMJ Open Resp Res. 2019; 6: e000420. PMID 31258917 DOI: 10.1136 / bmjresp-2019-000420
  6. Papazian L, Aubron C, Brochard L et al. Linee guida formali: gestione della sindrome da distress respiratorio acuto. Ann Intensive Care. 2019; 9 (1): 69. PMID: PMID: 31197492 DOI: 10.1186 / s13613-019-0540-9.
  7. Biospace. Mallinckrodt valuta il ruolo potenziale dell’ossido nitrico per inalazione nel trattamento delle complicanze polmonari associate a COVID-19, si impegna con soggetti scientifici, governativi e regolatori. Dal sito Web di Biospace. Accesso al 2020 del 24 marzo. Https://www.biospace.com/article/releases/mallinckrodt-evaluates-the-potential-role-for-inhaled-nitric-oxide-to-treat-covid-19-associated-lung-complications -engages-con-normativi-agenzie-scientifica governativa con e /.
  8. La FDA concede l’accesso esteso d’emergenza Bellerophon per INOpulse® per il trattamento del virus COVID-19 [comunicato stampa]. Warren, NJ; Bellerophon Therapeutics, Inc: 2020 mar 20. http://investors.bellerophon.com/news-releases/news-release-details/fda-grants-bellerophon-emergency-expanded-access-inopulser. Accesso al 24 marzo 2020.
  9. Gebistorf F, Karam O, Wetterslev J et al. Ossido nitrico inalato per sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) in bambini e adulti. Cochrane Database Syst Rev. 2016; 27 giu (6): 1-98. PMID: 27347773 DOI: 10.1002 / 14651858.CD002787.pub3.10. Alhazzani W, Moller MH, Arabi YM et al. Campagna di sepsi sopravvissuta: linee guida per la gestione degli adulti critici con malattia da virus corona 2019 (COVID-19). Crit Care Med. 2020. PMID: 32224769 DOI: 10.1097 / CCM.0000000000004363

La sindrome respiratoria acuta grave (SARS) è emersa di recente come una nuova grave malattia umana, provocando globalmente 774 decessi da 8098 segnalati casi probabili (al 26 settembre 2003).

Un nuovo membro della famiglia Coronaviridae è stato identificato come agente causale di questa malattia polmonare.1

Finora, il trattamento dei casi di SARS è stato in gran parte empirico e di solito è stato incluso

un agente antivirale come ribavirina o una combinazione di lopinavir / ritonavir e steroidi. Non è tuttavia chiaro se uno di questi trattamenti sia stato in grado di modificare il risultato finale della malattia. 2,3

Durante l’epidemia di SARS, Chen e colleghi hanno incluso l’inalazione di NO gas nel trattamento di numerosi pazienti con SARS. Il gas medicinale NO, una miscela gassosa di ossido nitrico (0,8%) e azoto (99,2%), è stato somministrato per tre giorni o più, inizialmente a 30 ppm e poi a 20 e 10 ppm il secondo e terzo giorno (dati non pubblicati) .

I loro risultati suggeriscono non solo un immediato miglioramento dell’ossigenazione, ma anche un effetto duraturo sulla malattia stessa dopo l’interruzione dell’inalazione di NO.

NO è una molecola chiave nella patogenesi delle malattie infettive.

In una varietà di infezioni microbiche, la biosintesi NO si verifica attraverso l’espressione di un inducibile ossido nitrico sintasi (iNOS). È stato segnalato che questa molecola ha effetti antivirali contro una varietà di virus del DNA e dell’RNA, incluso il virus dell’epatite di topo (MHV), un coronavirus murino.4

In uno studio recente, la replicazione di due isolati SARS-CoV (FFM-1 e FFM-2) ha dimostrato di essere fortemente inibita dalla glicirrizina, un composto attivo delle radici di liquirizia.5

La glicirrizina sovrascrive l’espressione di iNOS e la produzione di NO nei macrofagi.6
Anche se lo scoppio globale iniziale della SARS sembra essere stato contenuto con successo, la SARS rimarrà una seria preoccupazione, mentre continua a non esistere un vaccino adeguato o un trattamento farmacologico efficace.

Materiali e metodi

In questo studio abbiamo esaminato l’attività antivirale dell’ossido nitrico (NO) contro il coronavirus SARS (SARS-CoV) isolato Frankfurt-1 (FFM-1).

Due composti di donatore NO, S-nitroso-N-acetilpenicillamina (SNAP, Sigma, Belgio) e sodio nitroprussiato (SNP, Sigma, Belgio), sono stati aggiunti alle cellule di scimmia verde africana (Vero E6). SNAP rilascia NO in soluzioni acquose con un’emivita di circa 4 ore.7 La forma non nitrosilata di SNAP, N-acetilpenicillamina (NAP, Sigma, Belgio) è stata inclusa come composto di controllo nel test.

Le misurazioni dell’attività antivirale e della citotossicità erano basate sulla vitalità delle cellule che erano state infettate o non infettate con 100 CCID50 (dosi infettive di coltura cellulare del 50%) del SARS-CoV in presenza di varie concentrazioni dei composti in esame.

Tre giorni dopo l’infezione, il numero di cellule vitali è stato quantificato con un metodo colorimetrico a base di tetrazolio, in cui la riduzione del 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carbossi-metossi-fenile ) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolio (MTS) colorante (CellTiter 96 AQueous One Solution kit, Promega, Paesi Bassi) da deidro-genasi cellulari a un formazano colorato insolubile è stato misurato in uno spettrofotometro (Multiskan EX, Thermo Labsystems, Belgio) a 492 nm.8,9

L’indice di selettività è stato determinato come il rapporto tra la concentrazione del composto che ha ridotto la vitalità cellulare al 50% (CC50 o concentrazione citotossica del 50%) rispetto alla concentrazione del composto necessaria per inibire l’effetto citopatico virale al 50% del valore di controllo ( IC50 o concentrazione inibitoria del 50%).

La quantità di NO prodotta da SNAP nel mezzo di coltura è stata determinata analizzando il suo prodotto finale stabile, NO2- (nitrito) in un ambiente di coltura cellulare.

I campioni di colture cellulari scongelate sono stati centrifugati a 300 g per 10 minuti; volumi uguali (100 µl) dei supernatanti del campione e del reagente Griess (1% sulphanilamide, 0,1% N-1-naftiletilendiammina, 5% H3PO4) (Sigma, Belgio) sono stati miscelati e incubati per 10 minuti a 37 ° C.

La densità ottica a 540 nm è stata misurata con uno spettrofotometro multiscan automatizzato. Una serie di diluizioni di nitrito di sodio è servita a generare una curva standard per ciascun dosaggio.

risultati e discussione

SNAP ha inibito la replicazione SARS-CoV a concentrazioni non tossiche (222 µM) con un indice di selettività di 2,6 (Tabella 1).

La concentrazione di NO rilasciata da SNAP 222 µM è compresa tra 30 e 55 µM NO.

Figura 1 (A) Aumento del tasso di sopravvivenza delle cellule Vero E6 infette da SARS FFM-1 mediante il trattamento di SNAP.
È stata misurata la densità ottica a 492 nm di attività mitocondriale. I dati sono espressi come media ± SD (B) La percentuale di protezione
raggiunta dai composti nelle cellule infette da SARS-CoV è calcolata come segue: 100 × [(ODvirus + composto –
controllo ODsvirus) / (controllo ODcell – controllo ODsvirus)] / (ODcompound controllo / controllo ODcell). Le barre indicano SD.

Nessun effetto protettivo al di sotto del CC50 potrebbe essere dimostrato per SNP. La differenza di attività tra questi due composti donatori di NO potrebbe essere spiegata da un diverso meccanismo di rilascio di NO. SNAP è un donatore diretto di NO e genera NO in soluzioni acquose attraverso l’idrolisi, mentre SNP rilascia NO dopo reazione con un agente riducente.10—12
Non è stato possibile ottenere alcun effetto protettivo con N-acetilpenicillamina (NAP), che è il non forma nitrosilata di SNAP e non rilascia NO in soluzione (Figura 1).

Questi risultati mostrano che l’effetto protettivo di SNAP è una conseguenza del rilascio di NO e non di un potenziale effetto antivirale solitario della porzione N-acetil-penicillamina.

In questo studio, forniamo ulteriori prove del fatto che i donatori di NO e NO possono avere un effetto antivirale contro il SARS-CoV e speculiamo che l’effetto prolungato dell’inalazione di NO gas osservato in precedenza potrebbe essere un effetto antivirale di NO contro SARS- CoV. Sulla base dei nostri risultati, incoraggiamo l’inclusione dell’inalazione di NO nel trattamento della SARS. I donatori di NO, incluso SNAP, sono stati descritti come potenziali terapie nel trattamento delle malattie cardiovascolari.13

Per confermare l’effetto anti-SARS-CoV di NO gas e NO donatori e prima che SNAP possa essere usato nel trattamento della SARS, sono necessari ulteriori esperimenti in vivo.
Poiché la ripresa dell’epidemia di SARS è una possibilità distinta, la ricerca di antivirali efficaci contro la SARS-CoV rimane uno sforzo importante.

Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio del Fondo fiammingo per la ricerca scientifica (FWO) a Leen Vijgen e dalla concessione FWO G.0288.01.

Riferimenti

  1. Drosten C, Gunther S, Preiser W, et al. Identificazione di un nuovo coronavirus in pazienti con sindrome respiratoria acuta grave. N Engl J Med 2003; 348 : 1967—76.
  2. Zhaori G. Trattamento antivirale della SARS: possiamo trarre delle conclusioni? CMAJ 2003; 169 : 1165-6.
  3. Chu CM, Cheng VC, Hung IF, Wong MM, Chan KH, Chan KS, et al. Ruolo di lopinavir / ritonavir nel trattamento della SARS: risultati virologici e clinici iniziali. Torace 2004; 59 : 252— 6.
  4. Lane TE, Paoletti AD, Buchmeier MJ. Disassociazione tra gli effetti in vitro e in vivo dell’ossido nitrico su un coronavirus murino neurotropico. J Virol 1997; 71 : 2202—10.
  5. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glicirrizina, un componente attivo delle radici di liquirizia e replicazione del coronavirus associato alla SARS. Lancet 2003; 361 : 2045—6.
  6. Jeong HG, Kim JY. Induzione dell’espressione sintetizzabile dell’ossido nitrico inducibile per 18 [acido 3-glicirronico nei macrofagi. FEBS Lett 2002; 513 : 208-12.
  7. Ignarro LJ, Lippton H, Edwards JC, Baricos WH, Hyman AL, Kadowitz PJ, et al. Meccanismo di rilassamento vascolare della muscolatura liscia da parte di nitrati organici, nitriti, nitroprussiato e ossido nitrico: prove del coinvolgimento degli S-nitrosotioli come intermedi attivi. Pharmacol Exp Ther 1981; 218 : 739— 49.
  8. Pauwels R, Balzarini J, Baba M, Snoeck R, Schols D, Herdewijn P, et al. Test colorimetrico rapido e automatizzato a base di tetrazolio per la rilevazione di composti anti-HIV. J Virol Methods 1988; 20 : 309—21.
  9. Goodwin CJ, Holt SJ, Downes S, Marshall NJ. Saggi di tetrazolio microculturale: un confronto tra due nuovi sali di tetrazolio, XTT e MTS. J Immunol Methods 1995; 179 : 95-103.
  10. Bates JN, Baker MT, Guerra Jr R, Harrison DG. Generazione di ossido nitrico da nitroprusside da parte del tessuto vascolare. Prova che è richiesta la riduzione dell’anione nitroprussiato e la perdita di cianuro. Biochem Pharmacol 1991; 42 : 157—65.
  11. Marks GS, McLaughlin BE, Brown LB, Beaton DE, Stand BP, Nakatsu K, et al. Interazione tra gliceril trinitrato e sodio nitroprussiato con emogenato di vena polmonare bovina e supernatante da 10.000 xg: biotrasformazione e formazione di ossido nitrico. Can J Physiol Pharmacol 1991; 69 : 889—92.
  12. Kowaluk EA, Seth P, Fung HL. Attivazione metabolica del sodio nitroprussiato all’ossido nitrico nella muscolatura liscia vascolare. J Pharmacol Exp Ther  1992; 262 : 916— 22.
  13. Megson IL. Droghe di donatore di ossido nitrico. Drugs of the Future 2000; 25 : 701—15.

Fonte:
Università dell’Alabama a Birmingham

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