I ricercatori hanno sviluppato una tecnologia non invasiva che combina ultrasuoni e microbolle per distruggere le cellule tumorali

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Un gruppo di ricerca internazionale guidato dal Dott. Tali Ilovitsh del Dipartimento di Ingegneria biomedica dell’Università di Tel Aviv ha sviluppato una piattaforma tecnologica non invasiva per la consegna genica nelle cellule tumorali al seno.

La tecnica combina gli ultrasuoni con microbolle mirate al tumore. Una volta attivato l’ecografia, le microbolle esplodono come testate intelligenti e mirate, creando buchi nelle membrane delle cellule tumorali, consentendo la consegna del gene.

Condotta per due anni, la ricerca è stata pubblicata il 9 giugno sulla rivista Proceedings of National Academy of Sciences (PNAS).

La dott.ssa Ilovitsh ha sviluppato questa tecnologia rivoluzionaria durante la sua ricerca post-dottorato presso il laboratorio della Prof. Katherine Ferrara presso la Stanford University.

La tecnica utilizza ultrasuoni a bassa frequenza (250 kHz) per far esplodere bolle microscopiche mirate al tumore.

Credit: Tel Aviv University

In vivo, la distruzione cellulare ha raggiunto l’80% delle cellule tumorali.

“Le microbolle sono bolle microscopiche riempite di gas, con un diametro piccolo quanto un decimo di un vaso sanguigno”, spiega il dott. Ilovitsh. “A determinate frequenze e pressioni, le onde sonore fanno sì che le microbolle si comportino come palloncini: si espandono e si contraggono periodicamente.

Questo processo aumenta il trasferimento di sostanze dai vasi sanguigni nel tessuto circostante. Abbiamo scoperto che utilizzando frequenze più basse di quelle applicate in precedenza, le microbolle possono espandersi in modo significativo, fino a quando non esplodono violentemente.

Ci siamo resi conto che questa scoperta poteva essere utilizzata come piattaforma per il trattamento del cancro e abbiamo iniziato a iniettare microbolle direttamente nei tumori. “

Il dottor Ilovitsh e il resto del team hanno utilizzato microbolle mirate al tumore che sono state attaccate alle membrane delle cellule tumorali al momento dell’esplosione e le hanno iniettate direttamente nei tumori in un modello murino.

“Circa l’80% delle cellule tumorali sono state distrutte nell’esplosione, che è stata positiva da sola”, afferma il dott. Ilovitsh. “Il trattamento mirato, sicuro ed economico, è stato in grado di distruggere la maggior parte del tumore.

Tuttavia, non è abbastanza. Al fine di prevenire la diffusione delle restanti cellule tumorali, abbiamo dovuto distruggere tutte le cellule tumorali. Ecco perché abbiamo iniettato un gene di immunoterapia accanto alle microbolle, che agisce come un cavallo di Troia, e ha segnalato al sistema immunitario di attaccare la cellula cancerosa. “

Da solo, il gene non può entrare nelle cellule tumorali . Tuttavia, questo gene mirava a migliorare il sistema immunitario è stato co-iniettato insieme alle microbolle.

I pori di membrana si sono formati nel restante 20% delle cellule tumorali sopravvissute all’esplosione iniziale, consentendo l’ingresso del gene nelle cellule. Ciò ha innescato una risposta immunitaria che ha distrutto la cellula tumorale.

“La maggior parte delle cellule tumorali sono state distrutte dall’esplosione e le cellule rimanenti hanno consumato il gene dell’immunoterapia attraverso i fori che sono stati creati nelle loro membrane”, spiega il dott. Ilovitsh.

“Il gene ha indotto le cellule a produrre una sostanza che ha innescato il sistema immunitario per attaccare la cellula cancerosa. In effetti, i nostri topi avevano tumori su entrambi i lati del loro corpo. Nonostante il fatto che abbiamo condotto il trattamento solo da un lato, il sistema immunitario ha attaccato anche il lato distante. “

La dott.ssa Ilovitsh afferma che in futuro intende tentare di utilizzare questa tecnologia come trattamento non invasivo per malattie legate al cervello come tumori cerebrali e altre condizioni neurodegenerative come l’Alzheimer e il morbo di Parkinson.

“La barriera emato-encefalica non consente ai farmaci di penetrare, ma le microbolle possono aprire temporaneamente la barriera, consentendo l’arrivo del trattamento nell’area target senza la necessità di un intervento chirurgico invasivo.”


Nuclei di cavitazione per terapia
I nuclei di cavitazione più utilizzati sono microbolle rivestite di fosfolipidi con nucleo di gas. Per i 128 studi preclinici inclusi nelle sezioni di trattamento di questa recensione, le microbolle Definity disponibili in commercio e clinicamente approvate (Luminity in Europe; core gas octafluoropropano, rivestimento fosfolipidico) (Definity 2011; Nolsøe e Lorentzen 2016) (in 22 studi).

La definizione è stata utilizzata per gli studi su tutte le applicazioni discusse qui, principalmente per l’apertura del BBB (12 studi). SonoVue (Lumason negli Stati Uniti) è disponibile in commercio e anche clinicamente approvato (nucleo di esafluoruro di zolfo, rivestimento fosfolipidico) (Lumason 2016; Nolsøe e Lorentzen 2016) ed è stato utilizzato in 14 studi per il trattamento di tumori non cerebrali (ad es. Xing et al. 2016), apertura BBB (ad es. Goutal et al.2018) e sonobactericide (ad es. Hu et al.2018).

Altre microbolle disponibili in commercio non clinicamente approvate, come BR38 (Schneider et al. 2011) nello studio di Wang et al. (2015d) e MicroMarker (VisualSonics) nello studio di Theek et al. (2016).

Le microbolle su misura sono diverse quanto le loro applicazioni, con caratteristiche speciali su misura per migliorare le diverse strategie terapeutiche. Sono stati usati diversi tipi di gas come nucleo (aria (ad es. Eggen et al. 2014), azoto (ad es. Dixon et al.2019), ossigeno (ad es. Fix et al.2018), ottafluoropropano (ad es. Pandit et al.2019), perfluorobutano (ad es. Dewitte et al.2015), esafluoruro di zolfo (Bae et al.2016; Horsley et al.2019) o una miscela di gas come ossido nitrico e ottafluoropropano (Sutton et al.2014) o esafluoruro di zolfo e ossigeno (McEwan et al. 2015).

Mentre i gas fluorurati migliorano la stabilità delle microbolle rivestite con fosfolipidi (Rossi et al. 2011), altri gas possono essere caricati per applicazioni terapeutiche, come l’ossigeno per il trattamento dei tumori (McEwan et al.2015; Fix et al.2018; Nesbitt et al.2018) e ossido nitrico (Kim et al.2014; Sutton et al.2014) e idrogeno gassoso (He et al.2017) per il trattamento delle malattie cardiovascolari.

Il principale componente fosfolipidico delle microbolle su misura è di solito una fosfatidilcolina come 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), utilizzata in 13 studi (ad esempio, Dewitte et al.2015; Bae et al. 2016; Bae et al. 2016 ; Chen et al.2016; Fu et al.2019) o 1,2-distearoil-sn-glicer-3-fosfocolina (DSPC), utilizzato in 18 studi (ad esempio Kilroy et al.2014; Bioley et al.2015 ; Dong et al.2017; Goyal et al.2017; Pandit et al.2019). Questi fosfolipidi sono popolari perché sono anche i componenti principali di Definity (Definity 2011) e SonoVue / Lumason (Lumason 2016), rispettivamente.

Un altro componente chiave del rivestimento di microbolle è un emulsionante ialato di polietilenglicole (PEG) come il poliossietilene (40) stearato (PEG40-stearato; ad esempio Kilroy et al.2014) o il 1,2-distearoil-sn-glycero utilizzato più frequentemente -3-fosfoetanolamina-N-carbossi (polietilenglicole) (DSPE – PEG2000; ad esempio, Belcik et al.2017), che viene aggiunto per inibire la coalescenza e aumentare l’emivita in vivo (Ferrara et al. 2009).

In generale, vengono utilizzati due metodi per produrre microbolle su misura: agitazione meccanica (ad es. Ho et al.2018) e sonicazione della sonda (ad es. Belcik et al.2015). Entrambi i metodi producono una popolazione di microbolle di dimensioni polidisperse.

Le microbolle monodisperse prodotte dalla microfluidica sono state recentemente sviluppate e stanno iniziando ad attirare l’attenzione per gli studi terapeutici preclinici. Dixon et al. (2019) hanno utilizzato microbolle monodisperse per trattare l’ictus ischemico.

Varie applicazioni terapeutiche hanno ispirato lo sviluppo di nuovi nuclei di cavitazione, che è discusso in profondità nella recensione del compagno di Stride et al. (2020). Per migliorare la consegna dei farmaci, le terapie possono essere somministrate contemporaneamente o caricate sulle microbolle.

Una strategia per il caricamento è quella di creare microbolle stabilizzate da nanoparticelle polimeriche contenenti droga attorno a un nucleo di gas (Snipstad et al. 2017). Un’altra strategia è quella di attaccare molecole terapeutiche o liposomi all’esterno delle microbolle, ad esempio mediante accoppiamento biotina-avidina (Dewitte et al. 2015; McEwan et al. 2016; Nesbitt et al.2018).

I liposomi ecogenici possono essere caricati con differenti terapie o gas e sono stati studiati per la consegna di farmaci vascolari (Sutton et al. 2014), il trattamento dei tumori (Choi et al. 2014) e la sonotrombolisi (Shekhar et al. 2017). Acoustic Cluster Therapy (ACT) combina microbolle di sonazoid con goccioline che possono essere caricate con terapie per il trattamento dei tumori (Kotopoulis et al.2017).

Le microbolle cationiche utilizzate nelle sezioni di trattamento di questa recensione sono state utilizzate principalmente per l’erogazione di farmaci vascolari, con materiale genetico caricato sulla superficie delle microbolle mediante accoppiamento di carica (ad esempio, Cao et al. 2015).

Oltre ai fosfolipidi e alle nanoparticelle, le microbolle possono anche essere rivestite con proteine ​​denaturate come l’albumina. Optison (Optison 2012) è un mezzo di contrasto per ultrasuoni disponibile in commercio e clinicamente approvato che viene rivestito con albumina umana e utilizzato negli studi sul trattamento dei tumori non cerebrali (Xiao et al.2019), apertura BBB (Kovacs et al.2017; Payne et al.2017) e immunoterapia (Sta Maria et al.2015).

Le particelle di dimensioni nanometriche citate in questa recensione sono state utilizzate come nuclei di cavitazione per il trattamento di tumori, come nanodroplet (ad esempio, Cao et al.2018) e nanocup (Myers et al. 2016); per apertura BBB (nanodroplet; Wu et al.2018); e per sonobactericide (nanodroplets; Guo et al. 2017a).

Interazione bolla-cellula
Fisica

La fisica dell’interazione tra bolle o goccioline e cellule è descritta in quanto questi sono i principali nuclei di cavitazione usati per la consegna e la terapia del farmaco.

Fisica dell’interazione microbolle-cellula Il
riempimento di gas e / o vapore rende le bolle altamente sensibili ai cambiamenti di pressione e, pertanto, l’esposizione agli ultrasuoni può causare cambiamenti rapidi e drammatici nel loro volume.

Questi cambiamenti di volume a loro volta danno origine a una serie di fenomeni meccanici, termici e chimici che possono influenzare in modo significativo l’ambiente immediato delle bolle e mediare gli effetti terapeutici.

Per semplicità, questi fenomeni sono discussi nel contesto di una singola bolla. È importante notare, tuttavia, che gli effetti biologici sono in genere prodotti da una popolazione di bolle e l’influenza delle interazioni tra le bolle non deve essere trascurata.

Effetti meccanici
Una bolla in un liquido è soggetta a molteplici influenze concorrenti: la pressione motrice del campo ecografico imposto; la pressione idrostatica imposta dal liquido circostante; la pressione del gas e / o del vapore all’interno della bolla; tensione superficiale e influenza di qualsiasi materiale di rivestimento; l’inerzia del fluido circostante; e smorzamento causato dalla viscosità del fluido e / o rivestimento circostante, conduzione termica e / o radiazione acustica.

Il movimento della bolla è determinato principalmente dalla competizione tra l’inerzia del liquido e la pressione interna del gas. Questa competizione può essere caratterizzata usando l’equazione di Rayleigh-Plesset per la dinamica della bolla per confrontare i contributi relativi dei termini che descrivono l’inerzia e la pressione all’accelerazione della parete della bolla (Flynn 1975a):

(1)

dove R è il raggio della bolla dipendente dal tempo con il valore iniziale Ro, pG è la pressione del gas all’interno della bolla, p∞ è la pressione idrostatica combinata e variabile nel tempo nel liquido, σ è la tensione superficiale nel gas-liquido interfaccia, ρL è la densità del liquido, IF è il fattore di inerzia e PF il fattore di pressione.
Flynn (1975a, 1975b) ha identificato due scenari: Se la PF è dominante quando la bolla si avvicina alla sua dimensione minima, allora la bolla subirà oscillazioni di volume sostenute. Se il termine di inerzia è dominante (IF), la bolla subirà un collasso inerziale, simile a una cavità vuota, dopo di che potrebbe rimbalzare o disintegrarsi. Quale di questi scenari si verifica dipende dal rapporto di espansione della bolla Rmax / Ro e, quindi, dalla dimensione della bolla, dall’ampiezza e dalla frequenza del campo ecografico applicato.
Le oscillazioni delle bolle sia inerziali che non inerziali possono dare origine a molteplici fenomeni che influenzano l’ambiente circostante della bolla e quindi sono importanti per la terapia. Questi includono:
1. Impingement diretto: anche a moderate ampiezze di oscillazione, l’accelerazione della parete della bolla può essere sufficiente per imporre forze significative su superfici vicine, deformando facilmente strutture fragili come membrane cellulari biologiche (van Wamel et al. 2006; Kudo 2017) e pareti dei vasi sanguigni (Chen et al. 2011).

2. Movimento balistico: oltre all’oscillazione, la bolla può essere traslata a causa del gradiente di pressione nel fluido generato da un’onda ultrasonica propagante (forza di radiazione primaria). A causa della loro elevata compressibilità, le bolle possono viaggiare a velocità significative, sufficienti a spingerle verso obiettivi per una migliore deposizione locale di un farmaco (Dayton et al. 1999) o per penetrare nei tessuti biologici (Caskey et al. 2009; Bader et al.2015 ; Acconcia et al. 2016).

3. Microstreaming: quando una struttura oscilla in un fluido viscoso, si verifica un trasferimento di quantità di moto a causa dell’attrito interfacciale. Qualsiasi asimmetria nell’oscillazione provocherà un movimento netto di quel fluido nelle immediate vicinanze della struttura nota come microstreaming (Kolb e Nyborg 1956). Questo movimento a sua volta imporrà sollecitazioni di taglio su qualsiasi superficie vicina, oltre ad aumentare la convezione all’interno del fluido. A causa della natura intrinsecamente non lineare delle oscillazioni delle bolle (eqn [1]), sia la cavitazione non inerziale che inerziale possono produrre microstreaming significativi, con conseguenti velocità del fluido dell’ordine di 1 mm / s (Pereno e Stride 2018). Se la bolla è vicina a una superficie, mostrerà anche oscillazioni non sferiche, che aumentano ulteriormente l’asimmetria e quindi il microstreaming (Nyborg 1958;

4. Micro-getto: un altro fenomeno associato a oscillazioni di bolle non sferiche vicino a una superficie è la generazione di un getto di liquido durante il collasso della bolla. Se c’è un’asimmetria sufficiente nell’accelerazione del fluido su entrambi i lati della bolla collassante, il fluido che si muove più rapidamente può deformare la bolla in una forma toroidale, provocando l’emissione di un getto ad alta velocità sul lato opposto. È stato riferito che il microjet è in grado di produrre vaiolatura anche in materiali altamente resistenti come l’acciaio (Naudé ed Ellis 1961; Benjamin ed Ellis 1966). Tuttavia, poiché sia ​​la direzione che la velocità del getto sono determinate dalle proprietà elastiche della superficie vicina, i suoi effetti nel tessuto biologico sono più difficili da prevedere (Kudo e Kinoshita 2014). Tuttavia, come riportato da Chen et al. (2011),

5. Onde di shock: una cavità inerentemente collassante che provoca velocità delle pareti delle bolle supersoniche crea una significativa discontinuità nella pressione nel liquido circostante portando all’emissione di un’onda d’urto, che può imporre stress significativi alle strutture vicine.

6. Forza di radiazione secondaria: ad ampiezze minori di oscillazione, una bolla genererà anche un’onda di pressione nel fluido circostante. Se la bolla è adiacente a una superficie, l’interazione tra questa onda e il suo riflesso dalla superficie porta a un gradiente di pressione nel liquido e una forza di radiazione secondaria sulla bolla. Come per il micro getto, le proprietà elastiche del confine determineranno la differenza di fase tra le onde irradiate e riflesse e, quindi, se le bolle si muovono verso o lontano dalla superficie. Il movimento verso la superficie può amplificare gli effetti dei fenomeni 1, 3 e 6.

Effetti termici
Come descritto sopra, una microbolla oscillante irradierà energia dal campo ecografico incidente sotto forma di un’onda di pressione sferica. Inoltre, il carattere non lineare delle oscillazioni di microbolle porterà alla ri-radiazione di energia su una gamma di frequenze.

A pressioni di guida moderate, lo spettro di bolle conterrà multipli interi (armoniche) della frequenza di guida; e a pressioni più elevate, anche componenti frazionarie (sub e ultramonmoniche).

Nel tessuto biologico, l’assorbimento degli ultrasuoni aumenta con la frequenza e questo comportamento non lineare aumenta anche la velocità di riscaldamento (Hilgenfeldt et al. 2000; Holt e Roy 2001).

Le bolle dissipano anche energia a causa dell’attrito viscoso nella conduzione liquida e termica dal nucleo del gas, la cui temperatura aumenta durante la compressione. Il meccanismo dominante dipende dalle dimensioni della bolla, dalle condizioni di guida e dalla viscosità del mezzo.

Lo smorzamento termico è, tuttavia, generalmente trascurabile nelle applicazioni biomediche degli ultrasuoni in quanto la costante di tempo associata al trasferimento di calore è molto più lunga del periodo delle oscillazioni della microbolle (Prosperetti 1977).

Effetti chimici
L’aumento di temperatura prodotto nel tessuto circostante sarà trascurabile rispetto a quello che si verifica all’interno della bolla, specialmente durante il collasso inerziale quando può raggiungere diverse migliaia di Kelvin (Flint e Suslick 1991).

Allo stesso modo la pressione del gas aumenta in modo significativo. Sebbene sostenute solo per un periodo molto breve, queste condizioni estreme possono produrre specie chimiche altamente reattive, in particolare le specie reattive dell’ossigeno (ROS), nonché l’emissione di radiazioni elettromagnetiche (sonoluminescenza). È stato riferito che i ROS svolgono un ruolo significativo in molteplici processi biologici (Winterbourn 2008), e sia i ROS che le sonoluminescenze possono influenzare l’attività dei farmaci (Rosenthal et al. 2004; Trachootham et al. 2009; Beguin et al.2019).

Fisica dell’interazione gocciolina-cellula
Le goccioline sono costituite da una quantità incapsulata di un liquido volatile, come il perfluorobutano (punto di ebollizione: -1,7 ° C) o il perfluoropentano (punto di ebollizione: 29 ° C), che si trova in uno stato surriscaldato a temperatura corporea.

Lo stato surriscaldato significa che sebbene i liquidi volatili abbiano un punto di ebollizione inferiore a 37 ° C, queste goccioline rimangono nella fase liquida e non presentano vaporizzazione spontanea dopo l’iniezione. La vaporizzazione può invece essere ottenuta mediante esposizione a ultrasuoni di ampiezza significativa attraverso un processo noto come vaporizzazione di goccioline acustiche (ADV) (Kripfgans et al. 2000).

Prima della vaporizzazione, le goccioline hanno in genere un ordine di grandezza più piccolo delle bolle emergenti e il perfluorocarburo è inerte e biocompatibile (Biro e Blais 1987). Queste proprietà consentono una serie di possibilità terapeutiche (Sheeran e Dayton 2012; Lea-Banks et al.2019).

Ad esempio, a differenza delle microbolle, piccole goccioline possono esagerare dai vasi che perdono nel tessuto tumorale a causa dell’effetto di permeabilità e ritenzione (EPR) potenziato (Long et al. 1978; Lammers et al. 2012; Maeda 2012), e quindi essere trasformato in bolle di ADV (Rapoport et al. 2009; Kopechek et al. 2013).

Caricare le goccioline con un farmaco consente la consegna locale (Rapoport et al. 2009) tramite ADV. Il meccanismo alla base di ciò è che le bolle emergenti danno origine a forze di radiazione e microstreaming simili come descritto in precedenza nella Fisica dell’interazione microbubble-cellula. Va notato che l’ossigeno viene assorbito durante la crescita delle bolle (Radhakrishnan et al. 2016), il che potrebbe causare ipossia.

La fisica dell’interazione gocciolina-cellula è in gran parte governata da ADV. In generale, è stato osservato che l’ADV è promosso dai seguenti fattori: grandi pressioni negative di picco (Kripfgans et al. 2000), generalmente ottenute da una forte focalizzazione del raggio generato, da un’alta frequenza dell’onda emessa e da una distanza relativamente lunga tra il trasduttore e la goccia.

Un’altra osservazione che è stata fatta con goccioline di dimensioni micrometriche è che la vaporizzazione spesso inizia in un punto di nucleazione ben definito vicino al lato della gocciolina dove incide l’onda acustica (Shpak et al. 2014).

Questi fatti possono essere spiegati considerando i due meccanismi che svolgono un ruolo nel raggiungimento di una grande pressione negativa di picco all’interno della gocciolina: messa a fuoco acustica e propagazione non lineare degli ultrasuoni (Shpak et al. 2016). Di seguito, le lunghezze e le dimensioni sono correlate alla lunghezza d’onda, ovvero alla distanza percorsa da un’onda in una oscillazione (ad esempio un’onda ultrasonica a 1 MHz che viaggia in acqua con una velocità dell’onda, c, di 1500 m / s ha una lunghezza d’onda, w (m), di c / f = 1500/106 = 0,0015, ovvero 1,5 mm.

Messa a fuoco acustica
Poiché la velocità del suono nei liquidi perfluorocarburici è significativamente inferiore rispetto a quella nell’acqua o nei tessuti, la rifrazione dell’onda incidente si verificherà all’interfaccia tra questi fluidi e la forma sferica della gocciolina darà origine alla messa a fuoco.

La valutazione di questo effetto di messa a fuoco non è semplice perché il modo tradizionale di descrivere questi fenomeni con raggi che si propagano lungo linee rette (l’approccio del raggio) vale solo per oggetti molto più grandi della lunghezza d’onda applicata. Nel caso attuale, la frequenza di una tipica onda ad ultrasuoni utilizzata per l’insonificazione è dell’ordine di 1–5 MHz, producendo lunghezze d’onda dell’ordine di 1500–300 µm, mentre una goccia sarà più piccola di 2-4 ordini di grandezza.

Inoltre, usando l’approccio dei raggi, la minore velocità del suono nel perfluorocarburo produrrebbe un punto focale vicino al retro della gocciolina, il che è in contraddizione con le osservazioni. Il modo corretto di trattare l’effetto di messa a fuoco è quello di risolvere il problema della diffrazione completa decomponendo l’onda incidente, l’onda riflessa dalla gocciolina e l’onda trasmessa nella gocciolina in una serie di onde sferiche.

Per ogni onda sferica, è possibile derivare la riflessione sferica e i coefficienti di trasmissione. La sovrapposizione di tutte le onde sferiche produce la pressione all’interno della gocciolina. Tuttavia, quando questo approccio viene applicato solo a un’onda incidente con la frequenza che viene emessa dal trasduttore, ciò non porta né al punto di nucleazione corretto né a una pressione negativa sufficiente per la vaporizzazione. Le goccioline su scala nanometrica potrebbero essere troppo piccole per fare un uso efficace del meccanismo di messa a fuoco e ADV è quindi meno dipendente dalla frequenza.

Trattamento dei tumori (non cerebrali)
La struttura del tessuto tumorale varia in modo significativo da quella del tessuto sano che ha importanti implicazioni per il suo trattamento. Per supportare la continua espansione delle cellule neoplastiche, è necessaria la formazione di nuovi vasi (cioè angiogenesi) (Junttila e de Sauvage 2013).

Come tale, sorge una vascolarizzazione rapidamente sviluppata, mal organizzata con aperture vascolari allargate. Tra questi vasi, esistono grandi regioni avascolari, che sono caratterizzate da una densa matrice extracellulare, alta pressione interstiziale, basso pH e ipossia.

Inoltre, si forma un ambiente immunosoppressivo locale, prevenendo la possibile attività antitumorale da parte del sistema immunitario.

Nonostante la crescente conoscenza della fisiopatologia dei tumori, il trattamento rimane impegnativo. I farmaci chemioterapici vengono generalmente somministrati per abolire le cellule tumorali in rapida divisione.

Tuttavia, i loro effetti citotossici non si limitano alle cellule cancerose, causando effetti off-target limitanti la dose. Per superare questo ostacolo, la chemioterapia è spesso incapsulata in portatori di dimensioni nanometriche, ovvero nanoparticelle, progettate per diffondersi specificamente attraverso le grandi aperture della vascolarizzazione del tumore, mentre vengono escluse dai tessuti sani dai normali vasi sanguigni (Lammers et al. 2012 ; Maeda 2012).

Nonostante siano molto promettenti negli studi preclinici, le nanoparticelle contenenti farmaci hanno mostrato un successo clinico limitato a causa della vasta eterogeneità nella vascolarizzazione del tumore (Barenholz 2012; Lammers et al. 2012; Wang et al. 2015d).

Inoltre, la penetrazione del farmaco negli strati più profondi del tumore può essere limitata da un’alta pressione interstiziale e da una densa matrice extracellulare nel tumore. Inoltre, le regioni acide e ipossiche limitano l’efficacia dei trattamenti a base di radiazioni e chemioterapia a causa degli effetti biochimici (Mehta et al. 2012; McEwan et al. 2015; Fix et al.2018).

Le microbolle attivate dagli ultrasuoni sono in grado di alterare l’ambiente tumorale localmente, migliorando in tal modo l’erogazione del farmaco ai tumori. Queste alterazioni sono rappresentate schematicamente nella Figura 2 e comprendono il miglioramento della permeabilità vascolare, la modifica della perfusione tumorale, la riduzione dell’ipossia locale e il superamento dell’elevata pressione interstiziale.

Fig 2
Fig. 2 Le microbolle attivate dagli ultrasuoni possono alterare localmente il microambiente tumorale attraverso quattro meccanismi: aumento della permeabilità, miglioramento del contatto, riduzione dell’ipossia e alterazione della perfusione. ROS = specie reattive dell’ossigeno.

Diversi studi hanno scoperto che le microbolle guidate dagli ultrasuoni hanno migliorato il rilascio di agenti chemioterapici nei tumori, con conseguente aumento degli effetti antitumorali (Wang et al. 2015d; Snipstad et al.2017; Zhang et al.2018).

Inoltre, diversi prodotti genetici potrebbero essere effettivamente erogati alle cellule tumorali tramite microbolle guidate dagli ultrasuoni, con conseguente downregulation di percorsi specifici del tumore e inibizione della crescita tumorale (Kopechek et al. 2015; Zhou et al. 2015).

Theek et al. (2016) hanno inoltre confermato che l’accumulo di nanoparticelle può essere ottenuto in tumori con basso effetto EPR. Il trasporto e la distribuzione di farmaci attraverso la densa matrice tumorale e nelle regioni con elevata pressione interstiziale sono spesso i fattori limitanti nei tumori periferici.

Di conseguenza, diversi rapporti hanno indicato che la penetrazione del farmaco nel tumore è rimasta limitata dopo la sonoporazione, il che può impedire l’eradicazione dell’intero tessuto tumorale (Eggen et al.2014; Wang et al.2015d; Wei et al.2019).

In alternativa, la cavitazione delle microbolle può influire sulla perfusione tumorale, in quanto vasocostrizione e persino arresto temporaneo vascolare sono stati riportati ex vivo (Keravnou et al. 2016) e in vivo (Hu et al. 2012; Goertz 2015; Yemane et al.2018).

Questi effetti sono stati osservati a intensità di ultrasuoni più elevate (> 1,5 MPa) e si ritiene che derivino dalla cavitazione inerziale che porta a violenti crolli di microbolle. Poiché è necessario l’apporto di sangue per mantenere la crescita tumorale, l’interruzione vascolare potrebbe formare un approccio diverso per interrompere lo sviluppo del tumore.

Il danno microvascolare indotto da microbolle è stato in grado di integrare gli effetti diretti di chemioterapici e farmaci antivascolari mediante citotossicità mediata da ischemia secondaria, che ha portato all’inibizione della crescita tumorale (Wang et al.2015a; Ho et al.2018; Yang et al.2019b).

Inoltre, è stato osservato un effetto sinergico tra la radioterapia e il trattamento con microbolle stimolate dagli ultrasuoni, poiché la radioterapia induce anche la morte cellulare secondaria per apoptosi endoteliale e danno vascolare (Lai et al. 2016; Daecher et al. 2017). Tuttavia, sono stati segnalati numerosi effetti avversi a causa di un’eccessiva interruzione vascolare, tra cui emorragia, necrosi tissutale e formazione di trombi (Goertz 2015; Wang et al. 2015d; Snipstad et al. 2017).

Inoltre, le microbolle contenenti ossigeno possono fornire un apporto di ossigeno locale alle aree ipossiche, rendendo più efficaci i trattamenti dipendenti dall’ossigeno. Questo è interessante per la terapia sonodinamica, che si basa sulla produzione di ROS citotossici da parte di un agente sonosensibilizzante all’attivazione da ultrasuoni in presenza di ossigeno (McEwan et al. 2015, 2016; Nesbitt et al.2018).

Poiché gli ultrasuoni possono essere utilizzati per stimolare il rilascio di ossigeno da microbolle che trasportano ossigeno e contemporaneamente attivare un sonosensibilizzante, questo approccio è stato segnalato per essere particolarmente utile per il trattamento di tipi di tumore ipossico (McEwan et al.2015; Nesbitt et al.2018 ). Inoltre, la bassa ossigenazione promuove la resistenza alla radioterapia, che può essere aggirata da una fornitura momentanea di ossigeno. Sulla base di questa nozione, sono state utilizzate microbolle che trasportano ossigeno per migliorare l’esito della radioterapia in un modello di fibrosarcoma di ratto (Fix et al. 2018).

Infine, le microbolle attivate dagli ultrasuoni promuovono la convezione e inducono forze di radiazione acustica. Pertanto, è possibile ottenere un contatto più stretto con l’endotelio tumorale e un tempo di contatto prolungato (Kilroy et al. 2014). Inoltre, queste forze possono contrastare l’elevata pressione interstiziale presente nei tumori (Eggen et al. 2014; Lea-Banks et al. 2016; Xiao et al.2019).

Oltre alla loro capacità di migliorare l’assorbimento del tumore, le microbolle possono essere utilizzate come portatori di farmaci sensibili agli ultrasuoni per ridurre gli effetti off-target dei chemioterapici. Caricando i farmaci o le nanoparticelle contenenti farmaci direttamente nelle o sulle microbolle, è possibile ottenere un controllo spaziale e temporale del rilascio del farmaco, riducendo così l’esposizione ad altre parti del corpo (Yan et al.2013; Snipstad et al.2017) .

Inoltre, diversi studi hanno riportato effetti anti-cancro migliorati dal trattamento con microbolle accoppiate ai farmaci, rispetto a un approccio di co-somministrazione (Burke et al. 2014; Snipstad et al. 2017).

Inoltre, la neovascolatura tumorale esprime recettori di superficie specifici che possono essere presi di mira da specifici ligandi. L’aggiunta di tali frazioni mirate alla superficie di microbolle (cariche di droga) migliora la consegna mirata al sito ed è stato trovato che potenzia ulteriormente questo effetto (Bae et al. 2016; Xing et al. 2016; Luo et al. 2017).

Le goccioline sfasanti e gli agenti solidi stabilizzanti i gas (ad esempio i nanocup) hanno l’eccezionale capacità di beneficiare sia dell’accumulo mediato da EPR nelle parti “che perdono” della vascolarizzazione del tumore a causa delle loro piccole dimensioni, sia a causa degli ultrasuoni permeabilizzazione della struttura del tessuto (Zhou 2015; Myers et al.2016; Liu et al.2018b; Zhang et al.2018).

Diversi gruppi di ricerca hanno riportato regressione tumorale dopo il trattamento con goccioline acusticamente attive (Gupta et al. 2015; van Wamel et al. 2016; Cao et al.2018; Liu et al.2018b) o particelle solide stabilizzanti i gas (Min et al. 2016; Myers et al. 2016). Un approccio diverso all’uso delle goccioline per il trattamento del tumore è l’ACT, che si basa su cluster di microbolle e goccioline che a seguito di esposizione ad ultrasuoni, subiscono uno spostamento di fase per creare grandi bolle che possono bloccare transitoriamente i capillari (Sontum et al. 2015).

Sebbene il meccanismo alla base della tecnica non sia ancora del tutto chiaro, gli studi hanno riportato un miglioramento nella consegna e nell’efficacia di paclitaxel e Abraxane nei modelli di tumore della prostata con xenotrapianto (van Wamel et al. 2016; Kotopoulis et al. 2017). Un altro uso delle goccioline per il trattamento dei tumori è il potenziamento del riscaldamento dei tumori ad ultrasuoni focalizzato ad alta intensità (HIFU) (Kopechek et al. 2014).

Sebbene la consegna di farmaci a base di microbolle ai tumori solidi mostri grandi promesse, deve anche affrontare importanti sfide. I parametri ecografici utilizzati negli studi in vivo variano notevolmente tra i gruppi di ricerca e non è stato trovato alcun consenso sul regime di oscillazione che si ritiene sia responsabile degli effetti osservati (Wang et al. 2015d; Snipstad et al. 2017).

Inoltre, di solito vengono applicati impulsi ad ultrasuoni più lunghi e tempi di esposizione più elevati rispetto ai rapporti in vitro (Roovers et al. 2019c). Ciò potrebbe promuovere effetti aggiuntivi come il clustering di microbolle e la traduzione di microbolle, che potrebbero anche causare danni locali al tessuto circostante (Roovers et al. 2019a).

Per chiarire ulteriormente questi effetti, la ricerca in vitro fondamentale rimane importante. Pertanto, sono attualmente allo studio nuovi modelli in vitro che imitano in modo più accurato la complessità dell’ambiente tumorale in vivo. Park et al. (2016) ha progettato un sistema perfusibile nave-su-un-chip e ha riportato il successo della consegna di doxorubicina alle cellule endoteliali che rivestono questa rete microvascolare.

Mentre tali chip microfluidici potrebbero essere estremamente utili per studiare le interazioni delle microbolle con la barriera cellulare endoteliale, è necessario prestare particolare attenzione al materiale delle camere per evitare riflessi ecografici e onde stazionarie (Beekers et al.2018).

In alternativa, gli sferoidi tumorali 3-D sono stati usati per studiare gli effetti della somministrazione di farmaci ad ultrasuoni e microbolle sulla penetrazione e l’effetto terapeutico in un modello tumorale multicellulare (Roovers et al.2019b).

Oltre ad espandere le conoscenze sulle interazioni tra microbolle e tessuti in dettagliati studi parametrici in vitro, sarà cruciale ottenere un migliore controllo del comportamento delle microbolle in vivo e collegarlo agli effetti terapeutici. 

A tal fine, il rilevamento della cavitazione passiva per monitorare il comportamento della cavitazione delle microbolle in tempo reale è attualmente in fase di sviluppo e potrebbe fornire migliori approfondimenti in futuro (Choi et al. 2014; Graham et al. 2014; Haworth et al. 2017).

Si stanno impegnando nella costruzione di sistemi di consegna personalizzati, che possono essere dotati di trasduttori multipli che consentono la consegna di farmaci guidati dall’imaging ad ultrasuoni e / o dal rilevamento di cavitazione passiva (Escoffre et al.2013; Choi et al.2014; Wang et al. 2015c; Paris et al.2018).


Ulteriori informazioni:  Tali Ilovitsh et al, trasfezione di citochine mediata da ultrasuoni a bassa frequenza migliora il reclutamento di cellule T in siti tumorali locali e distanti,  Atti della National Academy of Sciences  (2020). DOI: 10.1073 / pnas.1914906117

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