Mentre cresce il bilancio delle vittime della pandemia COVID-19 , gli scienziati di tutto il mondo continuano a spingere per sviluppare trattamenti efficaci e un vaccino per il virus respiratorio altamente contagioso.
Gli scienziati dell’Università di South Florida Health (USF Health) Morsani College of Medicine hanno recentemente lavorato con i colleghi del College of Pharmacy dell’Università dell’Arizona per identificare diversi composti esistenti che bloccano la replicazione del virus COVID-19 (SARS-CoV-2) all’interno delle cellule umane cresciuto in laboratorio.
Tutti gli inibitori hanno dimostrato potenti interazioni chimiche e strutturali con una proteina virale fondamentale per la capacità del virus di proliferare.
Lo studio sulla scoperta di droghe del team di ricerca è apparso il 15 giugno su Cell Research , una rivista Nature di grande impatto.
I candidati farmacologici più promettenti – tra cui il boceprevir C dell’epatite C approvato dalla FDA e un farmaco antivirale veterinario sperimentale noto come GC-376 – prendono di mira la proteasi principale SARS-CoV-2 (M pro ), un enzima che elimina le proteine da un lungo filo che il virus produce quando invade una cellula umana.
Senza M pro , il virus non può replicare e infettare nuove cellule. Questo enzima era già stato validato come bersaglio di un farmaco antivirale per SARS e MERS originali, entrambi geneticamente simili a SARS-CoV-2.
“Con una malattia infettiva in rapida crescita come COVID-19 , non abbiamo tempo per sviluppare nuovi farmaci antivirali da zero”, ha affermato Yu Chen, PhD, professore associato di medicina molecolare USF Health e coautore del documento Cell Research. “Molti buoni candidati alla droga sono già là fuori come punto di partenza.
Ma, con nuove informazioni provenienti da studi come il nostro e la tecnologia attuale, possiamo aiutare a progettare farmaci ancora migliori (riproposti) molto più velocemente. ”
Prima della pandemia, il dottor Chen ha applicato la sua esperienza nella progettazione di farmaci basati sulla struttura per aiutare a sviluppare inibitori (composti farmacologici) che colpiscono gli enzimi batterici che causano resistenza a determinati antibiotici comunemente prescritti come la penicillina.
Ora il suo laboratorio concentra le sue tecniche avanzate, tra cui cristallografia a raggi X e docking molecolare, alla ricerca di modi per fermare SARS-CoV-2.
M pro rappresenta un bersaglio attraente per lo sviluppo di farmaci contro COVID-19 a causa del ruolo essenziale dell’enzima nel ciclo di vita del coronavirus e dell’assenza di una proteasi simile nell’uomo, ha detto il dottor Chen.
Poiché le persone non hanno l’enzima, i farmaci che prendono di mira questa proteina hanno meno probabilità di causare effetti collaterali, ha spiegato.
I quattro principali candidati alla droga identificati dal team sanitario dell’Università dell’Arizona-USF come i migliori (i più potenti e specifici) per combattere la COVID-19 sono descritti di seguito. Questi inibitori sono saliti al vertice dopo lo screening di oltre 50 composti proteasi esistenti per potenziali riproposizioni:
- Boceprevir, un farmaco per il trattamento dell’epatite C, è l’unico dei quattro composti già approvati dalla FDA. La sua dose efficace, il profilo di sicurezza, la formulazione e il modo in cui il corpo elabora il farmaco (farmacocinetica) sono già noti, il che accelererebbe notevolmente i passaggi necessari per ottenere boceprevir negli studi clinici per COVID-19, ha detto il dottor Chen.
- GC-376, un farmaco veterinario sperimentale per un ceppo mortale di coronavirus nei gatti, che causa peritonite infettiva felina. Questo agente è stato il più potente inibitore dell’enzima M pro nei test biochimici, ha detto il dottor Chen, ma prima che possano iniziare i test sull’uomo avrebbe bisogno di essere testato su modelli animali di SARS-CoV-2. Il dottor Chen e il suo dottorando Michael Sacco hanno determinato la struttura a raggi X del GC-376 legato da M pro e hanno caratterizzato le interazioni molecolari tra il composto e l’enzima virale utilizzando la modellazione 3D del computer.
- Gli inibitori del calpain II e XII, gli inibitori della cisteina studiati in passato per cancro, malattie neurodegenerative e altre condizioni, hanno anche mostrato una forte attività antivirale. La loro capacità di inibire due volte la proteasi M pro e calpain / cathepsin suggerisce che questi composti possono includere l’ulteriore vantaggio di sopprimere la resistenza ai farmaci, i ricercatori riferiscono.
Tutti e quattro i composti erano superiori agli altri inibitori M pro precedentemente identificati come idonei per la valutazione clinica per il trattamento della SARS-CoV-2, ha affermato il dott. Chen.
GC-376 è un promettente candidato – uno che uccide o altera il virus senza distruggere le cellule sane – si adatta perfettamente, nella forma unica della “tasca vincolante” del recettore delle proteine virali. GC-376 ha funzionato particolarmente bene nel conformarsi (integrando) alla forma dei siti di legame agli enzimi M pro target , ha detto il dottor Chen.
Usando una serratura (recettore) e una chiave (farmaco), “GC-376 era di gran lunga la chiave con la migliore o più stretta,” ha aggiunto. “La nostra modellazione mostra come l’inibitore può imitare il substrato peptidico originale quando si lega al sito attivo sulla superficie della proteasi principale SARS-CoV-2.”
Invece di promuovere l’attività dell’enzima virale, come fa normalmente il substrato, l’inibitore riduce significativamente l’attività dell’enzima che aiuta SARS-CoV-2 a fare copie di se stesso.
La visualizzazione delle interazioni 3-D tra i composti antivirali e la proteina virale fornisce una comprensione più chiara di come funziona il complesso M pro e, a lungo termine, può portare alla progettazione di nuovi farmaci COVID-19, ha affermato Chen.
Nel frattempo, ha aggiunto, i ricercatori si concentrano su come ottenere trattamenti antivirali mirati da usare più rapidamente in prima linea, modificando i farmaci esistenti e candidati alla cura del coronavirus – per migliorare la loro stabilità e prestazioni.
Il dottor Chen ha lavorato allo studio con il ricercatore capo Jun Wang, PhD, assistente universitario di farmacologia e tossicologia UA. Il lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Institutes of Health.
Coronavirus, una grande famiglia di virus, che causa infezioni del tratto respiratorio superiore nell’uomo e in altri mammiferi superiori (Bedford et al., 2020). L’epidemia di coronavirus è stata segnalata tre volte nel 21 ° secolo, ovvero SARS nel 2002, MERS nel 2012 e COVID-19 a novembre 2019.
Il recente scoppio di COVID-19 causato da SARS-CoV-2 è emerso dalla Cina. La trasmissione umano-umana di questo virus zoonotico altamente infettivo ha portato a una crescita esponenziale del numero di casi infetti, che ha provocato il suo scoppio di pandemia in tutto il mondo (Fahmi, 2020).
Attualmente, più di 225 Paesi sono colpiti dal COVID-19, con oltre 2,5 milioni di persone fino ad oggi, in aumento in migliaia al giorno in tutto il mondo e circa il 5-10% di mortalità (Fahmi, 2020).
Inoltre, le vite di milioni di persone sono state colpite da blocchi, isolamenti e quarantene obbligatori. Pertanto, il grave effetto dell’epidemia COVID-19 ha imposto importanti sfide per la salute, la società e l’economia globali (Fry, 2020).
Attualmente, non esistono specifici farmaci antivirali o vaccini disponibili per il trattamento e la gestione di COVID-19, il che rende ulteriormente difficile gestire la situazione.
Attualmente sono in corso terapie preventive e di supporto per prevenire le complicanze (Salata et al., 2020). Numerosi sforzi sono in corso per colpire le proteine chiave della patogenesi SARS-CoV-2 come la proteasi principale (MPro), l’RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp), il dominio N terminale N (RNA) di legame all’RNA della proteina nucleocapside (proteina N), virale canale ionico (proteina E), 2′-O-ribosioMetiltransferasi e recettore dell’enzima 2 di conversione dell’angiotensina umana (hACE-2) (Gao et al., 2020; Gupta et al., 2020; Khan et al., 2020; Sarma et al., 2020; Shang et al., 2020; Zhang et al., 2020).
Per proporre o riutilizzare molecole di farmaco e / o piombo contro SARS-CoV-2, sarebbe efficace colpire proteine specifiche di patogenesi multipla del virus all’interno di una stretta rete di interazione o con funzionalità dipendente (Zhou et al., 2020).
Ai fini della scoperta di farmaci, l’MPro dei coronavirus è stato ampiamente studiato. Sono proteasi simili alla papaina coinvolte nell’auto-maturazione e nell’elaborazione degli enzimi della replicasi virale (Zhang et al., 2020). MPro ha 11 siti di scissione putativa nel laboratorio di replicasi di 790 kD che indica la sua predominanza nel trattamento proteolitico del grande laboratorio di polipoteina.
MPro di SARS-CoV-2 ha mostrato un’identità ad alta sequenza e una somiglianza strutturale con quella di SARS-CoV MPro. Contiene due domini catalitici, I (chimotripsina) e II (picornavirus 3 C-simil-proteasi) ciascuno contenente β-barile antiparallelo a sei strati contenente diad attivo H41 e C145. Poiché svolgono un ruolo chiave nella replicazione del virus, queste proteasi sono emerse come importanti bersagli farmacologici.
Inoltre, con la loro bassissima somiglianza con le proteasi umane, gli inibitori di MPro risultano molto meno citotossici (Anand et al., 2003; Zhang et al., 2020). Studi preliminari hanno suggerito il potenziale uso dell’inibitore della proteasi lopinavir / ritonavir, farmaci comunemente usati per il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), per il trattamento di pazienti COVID-19 (Cao et al., 2020; Muralidharan et al., 2020).
Sfortunatamente, nello studio clinico randomizzato in aperto, questi farmaci non sono risultati impressionanti per il trattamento con COVID-19. Inoltre, diversi altri inibitori della proteasi virale come l’inibitore della proteasi dell’HCV Danoprevir, l’inibitore della proteasi dell’HIV Darunavir sono in vivo e studi clinici per il trattamento dell’infezione da SARS-CoV-2 (Dong et al., 2020).
Per trovare nuove o riposizionare molecole di farmaci esistenti, potrebbe essere importante comprendere la sequenza e la struttura di SARS-CoV-MPro rispetto a vari altri ceppi di coronavirus. La loro comprensione comparativa è enigmatica, il che potrebbe essere importante per riutilizzare gli inibitori della proteasi antivirali disponibili contro SARS-CoV-2 MPro.
Il coronavirus utilizza un complesso multiproteico per replicare i genomi a base di RNA. La scissione delle polipoteine virali (ORF1a e ORF1b) produce un insieme di proteine non strutturali (Nsp). Di questi, RdRp o Nsp12 catalizza la sintesi ed è noto per svolgere un ruolo importante nel ciclo di replicazione e trascrizione del virus. RdRp è un obiettivo primario per inibitori antivirali analogici nucleotidici come Remdesivir, un farmaco in fase di valutazione per l’infezione da SARS-CoV2 nelle cliniche (Gao et al., 2020; Imbert et al., 2006).
Remdesivir, un analogo nucleotidico, ha mostrato attività antivirali ad ampio spettro e studi preclinici hanno anche mostrato dati promettenti sulla sicurezza umana (Amirian & Levy, 2020; Dong et al., 2020). Recentemente, un rapporto ha suggerito che la significativa inibizione di RdRp di SARS-CoV-2 da parte di Remdesivir e studi clinici per lo stesso sono in corso per valutare l’efficacia di questa molecola nei pazienti COVID-19 (www.clinicaltrials.gov; Studio No : NCT04280705).
Oltre alla maturazione e alla replicazione, l’ingresso di questo virus legando la sua proteina di picco superficiale all’HACE-2 è anche un processo cruciale che può essere preso di mira (Hasan et al., 2020; Kuhn et al., 2004; Shang et al . 2020).
Poiché questo recettore delle cellule ospiti è essenziale per l’ingresso del virus; il targeting per hACE-2 promette di prevenire l’infezione da SARS-Cov-2. È stato dimostrato che l’inibitore della serina proteasi clinicamente approvato (TMPRSS2) può anche legarsi al recettore SARS-CoV-2 hACE-2 e inibire l’ingresso virale (Hoffmann et al., 2020).
Ad oggi, il Chinese Trial Clinical Registry ha registrato circa 550 studi contro SARS-CoV-2, valutando principalmente molecole di farmaci esistenti. Questi studi comprendono l’applicazione di antivirali (favipiravir, adalimumab, diidroartemisininpiperaquina, leflunomide, lopinavir), farmaci antimalarici (clorochina o idrossiclorochina), vitamina C ad alte dosi, ecc. (Www.chictr.org.cn/index.aspx).
Dai dati disponibili di studi sperimentali e clinici, è stato scoperto che le molecole destinate alla singola proteina saranno inefficaci piombo antivirale. Pertanto, per elaborare una strategia efficace, sono necessarie molecole in grado di colpire più proteine chiave come RdRp e hACE-2 insieme al MPro come principale bersaglio farmacologico (Wu et al., 2020).
Lo screening dei farmaci in silico è uno strumento molto vitale e utile per lo screening rapido. Ciò consente di selezionare i lead e quindi soddisfare l’urgente richiesta di ricostituire i farmaci per il trattamento dell’infezione da SARS-CoV-2.
Pertanto, in questo studio, abbiamo eseguito un’analisi comparativa del principale obiettivo di SARS-CoV-2, MPro per le sue caratteristiche strutturali ad altri virus della famiglia Coronoviridea.
Queste informazioni sono state inoltre utilizzate per lo screening virtuale della libreria personalizzata di sostanze fitochimiche, ingredienti attivi presenti nei medicinali anti-tussivi ayurvedici comunemente usati in India e farmaci antivirali sintetici contro MPro. Le molecole più colpite da questo schermo sono state quindi ancorate contro SARS-CoV-2 RdRP e hACE2 per trovare le molecole dirette a più target.
Riteniamo che questo studio fornirà un nuovo approccio e una base per la scoperta di molecole antivirali multi-target contro la patogenesi della SARS-CoV-2. Pertanto, questi composti potrebbero essere potenziali candidati per studi antivirali in vitro e in vivo seguiti da trattamento clinico di SARS-CoV-2.
Molecole anti-tussive come δ-viniferina e miricitrina hanno mostrato una maggiore affinità per il sito attivo di SARS-CoV-2 MPro e altri target
Lo screening dell’usanza ha reso la libreria di ∼7100 molecole comprendente diversi tipi come flavonoidi, glucosinolati, anti-tussivi, anti-influenza, anti-virali, terpeni, terpenoidi, alcaloidi e altri noti e / o predetti anti-SARS-CoV -2 molecole sono state fatte contro SARS-CoV-2 MPro come target principale (Dati supplementari 2).
È stata eseguita una ricerca di somiglianza tra sequenze di MPro e sequenze di proteine umane, il che suggerisce che le proteasi virali non hanno alcun omologo nell’uomo, pertanto prendere di mira MPro sarà specifico solo per le proteasi virali.
I risultati dell’analisi docking hanno dimostrato che numerosi fitochimici e antivirali hanno un forte legame nel sito attivo di SARS-CoV-2 MPro. Le molecole selezionate hanno anche mostrato un’elevata affinità di legame con SARS-CoV-2 RdRp e hACE-2 (Dati supplementari 3). Allo stesso modo MPro, altri bersagli virali considerati in questo studio, RdRp, hanno anche mostrato che non esiste un omologo umano, quindi potrebbe essere un potenziale bersaglio virale con MPro.
Le molecole migliori con la più alta energia di legame e con accettabili criteri di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) sono state ulteriormente selezionate per l’analisi delle interazioni (Figura 4).
Per convalidare la nostra strategia di attracco e i risultati ottenuti, abbiamo utilizzato una serie di molecole anti-SARS-CoV-2 note o previste riportate dalla letteratura (Wu et al., 2020). Per un’ulteriore analisi delle interazioni, abbiamo selezionato le molecole con un punteggio di legame elevato rispetto a tutti gli obiettivi. Inoltre, abbiamo preso in considerazione i precedenti rapporti che supportano le proprietà antivirali di queste molecole contro virus diversi.
Figura 4. Mappa del calore delle energie di legame dei migliori risultati per diversi tipi di molecole utilizzate per lo screening, vale a dire flavonoidi, glucosinolati, anti-tussivi, anti-influenza, antivirali sintetici, terpeni, terpenoidi e alcaloidi.
In generale, abbiamo notato un forte legame dei ligandi con MPro e RdRp rispetto al recettore hACE 2. I flavonoidi hanno mostrato risultati promettenti con affinità di legame migliori rispetto ai farmaci antivirali sintetici esistenti. Per dettagli sul punteggio di docking e sui nomi dei ligandi, consultare Dati supplementari 3.
Poiché uno dei sintomi di COVID-19 è la tosse, una libreria di molecole anti-tussive ayurvediche nella medicina indiana (82 molecole) viene sottoposta a screening contro SARS-CoV-2 MPro. Le prime 20 molecole risultanti sono state ulteriormente schermate contro altri target: recettori RdRp e hACE 2. Tra queste molecole, δ-viniferina, crisantema, miritilina e miricitrina hanno mostrato un forte legame con SARS-CoV-2 MPro.
La δ-viniferina e la miricitrina hanno mostrato elevata solubilità e biodisponibilità nell’analisi computazionale dell’ADME; quindi, analizzato per l’interazione intermolecolare. Con SARS-CoV-2 MPro, la δ-viniferina ha mostrato un’energia di legame di -8,4 Kcal / mol con diverse interazioni non covalenti nel sito attivo e nel sito di legame al substrato.
THR24 e HIS163 formano un contatto polare con gruppi ossidrilici di δ-viniferina, mentre il residuo sito attivo HIS41 mostra l’interazione Pi-Pi con l’impalcatura aromatica centrale di un ligando. Oltre a ciò, MET165 è coinvolto nell’interazione Pi-zolfo con il ligando e altri residui dalla tasca legante il substrato, che sono coinvolti nell’interazione attraente van der Waal o nel legame carbonio-idrogeno (Figura 5A).
Oltre a MPro, la δ-viniferina sembrava avere un forte legame con il recettore SARS-CoV-2 RdRp e hACE2 con un punteggio rispettivamente di -8,3 e -8,4 Kcal / mol. Nel caso di RdRp, i residui di tasca di legame ALA762, TRP800, SER814 hanno mostrato legami idrogeno con il gruppo ossidrilico del ligando. Mentre, il sito attivo e altri residui chiave, in particolare ARG553, ASP618, ASP623 e ASP761, mostrano interazioni Pi con gli scaffold aromatici di δ-viniferina.
Figura 5. δ-Viniferin con residui del sito attivo di (A) MPro (B) RdRp e (C) hACE-2. È seguito dalla mappa di interazione della miricitrina con (D) MPro (E) RdRp e (F) hACE-2. Il tipo di interazione si distingue per cerchi colorati (residui).
Linee tratteggiate dirette alla porzione specifica nel ligando. I residui verdi simboleggiano le forze di van der Waals. I residui rosa indicano che sono coinvolti nell’accatastamento Pi-Pi. Il rosa chiaro indica le interazioni del gruppo alchilico. Il colore arancione chiaro indica le interazioni Pi-zolfo.
L’arancione scuro mostra interazioni pi-anione. Gli anelli aromatici sono coinvolti nelle interazioni Pi-Pi, Pi-anione e Pi-zolfo. Interazione intermolecolare tra Taiwanhomoflavone A con residui attivi del sito di (G) MPro, (H) RdRp e (I) hACE-2. La prossima è la mappa di interazione di Lactucopicrin 15-ossalato con (J) MPro, (K) RdRp e (L) hACE-2.
L’elevata densità di queste interazioni intermolecolari non covalenti è un indicatore del legame forte e specifico di δ-viniferina con tasca attiva RdRp. Inoltre, i gruppi idrossilici e aromatici di δ-viniferina interagiscono anche attraverso i contatti polari e l’interazione Pi-alchile con i residui GLU35, LEU39, LYS68 e ALA71 di hACE-2 (Figura 5B e 6C).
L’interazione di δ-viniferina con MPro, RdRp e hACE-2 suggerisce il suo alto potenziale come ligando diretto multi-bersaglio contro SARS-CoV-2. δ-Viniferin è un dimero di resveratrolo, uno stilbene importante prodotto da foglie di vite stressate (Aresta et al., 2003). È anche uno dei maggiori stilbeni presenti insieme al resveratrolo nel vino rosso (Vitrac et al., 2005).
Precedenti studi hanno anche suggerito che δ-viniferina mostra una potente attività antivirale contro una varietà di virus, vale a dire. rotavirus (B. Yu et al., 2018), Human Immunodeficiency Virus (HIV) (Pflieger et al., 2013); virus dell’epatite C (HCV) (Lee et al., 2019).
Un’altra molecola anti-tussiva, la miricitrina, ha scoperto di avere un forte legame con i residui del sito attivo dell’MPro con un punteggio di legame di -8,9 Kcal / mol. I residui attivi del sito HIS41 e CYS145 formano rispettivamente interazioni Pi-Alkyl e Pi-Sulphur con l’impalcatura aromatica del ligando, rispettivamente.
TYR54, PHE140, GLY143, HIS163 e GLU166 sono coinvolti nella formazione di 6 legami idrogeno con ossidrile e ossigeno carbossilico del ligando. Oltre a questo, ci sono altre interazioni aggiuntive come le forze di van der Waals che stabilizzano il legame del ligando con l’enzima (Figura 5D).
La miricitrina ha mostrato un’interazione altrettanto forte con RdRp e hACE-2 con un punteggio di legame di -7,9 e -7,5 Kcal / mol, rispettivamente. Per RdRp, il gruppo carbossilico della miricitrina forma due legami idrogeno con ARG553, ARG555 e THR556.
Mentre il residuo attivo del sito ASP623 sta avendo interazione Pi-Anione con gli anelli aromatici del ligando. Allo stesso modo, questo ligando si lega a hACE-2 formando interazione polare con ALA348, PHE390, ARG393 e ASN394.
Questa interazione è poi ulteriormente stabilizzata dal raggruppamento di Pi di PHE40 e interazioni Pi-anione di ASP350, ASP382 con anelli aromatici del ligando (Figura 5E e F).
La miricitrina è un analogo glicosilato della miricetina, presente nella Myrica esculenta. Sebbene nel nostro studio di attracco, la miricetina abbia mostrato un’affinità di legame relativamente minore rispetto alla miricitrina, studi precedenti hanno dimostrato che possiede una potente attività antivirale.
La miricetina ha inibito la proteina VP35 con interazione di RNA a doppio filamento nel virus Ebola (Daino et al., 2018). La miricetina glicosilata, ovvero la miricitrina, ha dimostrato di inibire l’HIV (Ortega et al., 2017), il virus dell’herpes simplex (Li et al., 2020), il coronavirus SARS (Keum & Jeong, 2012; Yu et al., 2012).
Insieme, i nostri risultati suggeriscono che δ-viniferina e miricitrina potrebbero essere potenti molecole per la mitigazione della SARS-CoV-2. È interessante notare che le principali molecole anti-tussive nel presente studio principalmente δ-viniferina, crisantemo, miritilina e miricitrina sono presenti nell’estratto di uva nera, che è uno degli ingredienti chiave dei medicinali antitosse ayurvedici, e il booster energetico e immunitario, Chyawanprash ( Georgiev et al., 2014).
Pertanto, questi medicinali potrebbero essere utili nella gestione e nella mitigazione di COVID-19. In particolare, la formulazione a base di erbe e le bevande contenenti Vitis vinifera potrebbero essere utili nella gestione di COVID-19.
Ulteriori informazioni: Chunlong Ma et al, Boceprevir, GC-376 e inibitori del calpain II, XII inibiscono la replicazione virale SARS-CoV-2 prendendo di mira la principale proteasi virale, Cell Research (2020). DOI: 10.1038 / s41422-020-0356-z
