Ridurre il costo dell’imaging a risonanza magnetica (MRI) potrebbe rivoluzionare il modo in cui i medici diagnosticano e controllano molte malattie.
In uno studio pubblicato sulla rivista Science Advances, un ricercatore presso il Massachusetts General Hospital (MGH) e colleghi in Australia identificano il pezzo mancante necessario per generare immagini di alta qualità utilizzando scanner MRI a basso costo , che potrebbero espandere il ruolo di questa potente tecnologia in medicina.
Un tipico scanner MRI ha un prezzo fino a $ 3 milioni o più, motivo per cui le macchine si trovano principalmente nelle cliniche di imaging e sono generalmente inaccessibili per gli ospedali in aree remote con popolazioni di piccoli pazienti.
Trovare un modo per rendere gli scanner per risonanza magnetica più convenienti è stato a lungo l’obiettivo del fisico Matthew Rosen, Ph.D., direttore del laboratorio di risonanza magnetica a basso campo e dei materiali iperpolarizzati presso il MGH Martinos Center for Biomedical Imaging.
“L’obiettivo del mio laboratorio è quello di decostruire lo scanner MRI”, afferma Rosen.
Il costo di uno scanner MRI è in gran parte determinato dal suo magnete superconduttore, spiega Rosen: più forte è il campo magnetico che produce, più costoso è la macchina.
Una tipica macchina per risonanza magnetica genera un campo magnetico di 1,5 Tesla (T), sebbene sempre più macchine raggiungano i 3 T.
Tuttavia, recentemente è disponibile una nuova generazione di scanner MRI portatili “low-field” che funzionano a 0,064 T e costano tra $ 50.000 e $ 100.000.
Mentre le risonanze magnetiche a basso campo stanno crescendo in popolarità, i radiologi spesso chiedono a Rosen se è disponibile un agente di contrasto iniettabile per migliorare le immagini che producono.
I medici di tanto in tanto iniettano ai pazienti un agente di contrasto basato sul gadolinio di metalli pesanti prima di eseguire una risonanza magnetica convenzionale per migliorare la qualità dell’immagine, anche se le preoccupazioni sulla tossicità a lungo termine ora limitano tale pratica.
Affinché il gadolinio venga utilizzato con la risonanza magnetica a basso campo , un medico dovrebbe amministrare 1.000 volte di più rispetto alla quantità approvata dalla Food and Drug Administration (FDA), spiega Rosen.
Per risolvere il problema, i fisici David Waddington, Ph.D., autore principale dello studio Science Advances, e Zdenka Kuncic, Ph.D., entrambi dell’Università di Sydney, hanno suggerito di testare nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPION) come agente di contrasto con risonanza magnetica a basso campo.
Le SPION sono sicure e approvate dalla FDA per il trattamento di alcuni casi di anemia o carenza di ferro, ma hanno un’altra qualità desiderabile. “Gli SPION essenzialmente amplificano i bassi campi magnetici”, afferma Waddington, osservando che gli SPION sono 3000 volte più magnetici dei convenzionali agenti di contrasto MRI.
Nello studio, i topi da laboratorio sani sono stati scansionati con la risonanza magnetica (ULF) fatta in casa di Rosen (0,0065 T), quindi iniettati con SPION e sottoposti a nuova scansione.
Un confronto tra immagini pre e post iniezione mostra una notevole differenza, con reni, fegati e altri organi che brillano intensamente dopo la somministrazione di SPION.
Mentre gli SPION devono essere approvati dalla FDA per l’uso come agenti di contrasto, i medici possono usarli ora “off-label” con risonanza magnetica a basso campo.
Rosen e Waddington ritengono che la combinazione di MRI portatili a basso campo e SPION porterà questa preziosa tecnologia di imaging in pronto soccorso, unità di terapia intensiva e studi medici per screening di routine.
Waddington e Kuncic stanno anche studiando l’uso di SPION appositamente rivestiti che potrebbero consentire di utilizzare la risonanza magnetica per rilevare tumori maligni . “Questa è una tecnologia abilitante che renderà realtà la risonanza magnetica a basso costo”, afferma Rosen.
Le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPION) sono ampiamente utilizzate per applicazioni biomediche, tra cui imaging a risonanza magnetica (MRI), imaging a particelle magnetiche (MPI), ipertermia a fluido magnetico (MFH), separazione di biomolecole e rilascio mirato di farmaci e geni [1,2 , 3].
Questo ampio elenco di applicazioni deriva non solo dalle proprietà magnetiche di SPION, ma anche dalla capacità di sintetizzarle in diverse dimensioni e forme.
Per tutte le applicazioni di cui sopra, SPION dovrebbe idealmente avere un alto valore di magnetizzazione, una dimensione inferiore a 100 nm e una distribuzione dimensionale ridotta [4, 5].
SPION sono in genere basati su Fe3O4 e / o Fe2O3. Possono essere sintetizzati usando vari metodi, come la co-precipitazione [5, 6], la decomposizione termica [7], il sol-gel [8], la microemulsione [9], la idrotermia [10] e la sintesi elettrochimica [11].
La tecnica di co-precipitazione è tra i metodi di maggior successo, più comunemente impiegati e più convenienti per la sintesi ad alto rendimento. Tuttavia, sono necessarie strategie per superare la limitazione più importante di questo metodo, vale a dire l’ampia distribuzione granulometrica della miscela SPION risultante [5, 6].
In questo studio, descriviamo un protocollo di centrifugazione semplice, facilmente implementabile e ampiamente applicabile per ottenere SPION relativamente monodisperso da una miscela di partenza polidispersa preparata usando la tecnica di co-precipitazione.
Come risultato della loro raffinata distribuzione dimensionale, le dispersioni SPION ottimizzate ottenute hanno mostrato prestazioni sostanzialmente migliorate in MRI, MPI e MFH rispetto alla formulazione di partenza grezza, nonché ai prodotti SPION commerciali, come Resovist® e Sinerem®.
In questo contesto, è importante tenere presente che non il protocollo di centrifugazione di per sé, ma l’eventuale sviluppo di una formulazione SPION con dimensioni molto ben definite e con una distribuzione delle dimensioni molto stretta (e il conseguente uso più ottimale per la diagnostica e scopi terapeutici) è l’obiettivo del nostro lavoro.
Finora, nessuno studio sistematico è stato pubblicato sull’isolamento dimensionale SPION tramite centrifugazione sequenziale e non è disponibile alcuna analisi sistematica in cui le prestazioni di cinque sotto-frazioni SPION isolate (e controlli clinicamente / commercialmente rilevanti) sono testa a testa testa rispetto alle configurazioni MRI, MPI e MFH.
Preparazione di SPION e isolamento dimensionale
SPION con rivestimento citrato prototipo sono stati preparati mediante la tecnica di co-precipitazione standard, in atmosfera di azoto [5, 6] (vedere la sezione “Sperimentale” per i dettagli).
Sulla base di questo lotto iniziale altamente polidisperso, che chiamiamo “campione grezzo”, sono stati eseguiti cinque cicli sequenziali di centrifugazione per ottenere sottfrazioni SPION molto più monodisperse.
A tal fine, come illustrato schematicamente nella Fig. 1, il campione grezzo è stato trasferito in provette Eppendorf da 1,5 ml e centrifugato a 14.000 rpm per 20 minuti. I risultanti 1 ml di surnatante sono stati raccolti e denominati “campione C1”.
Successivamente, 0,1 ml del compartimento inferiore nel tubo di Eppendorf che conteneva la più grande frazione di nanoparticelle sono stati risospesi in acqua. La dispersione ottenuta è stata quindi nuovamente centrifugata, i 1 ml superiori sono stati raccolti come “campione C2” e gli 0,1 ml inferiori sono stati nuovamente risospesi e ri-centrifugati.
Questi passaggi sono stati ripetuti in sequenza per ottenere cinque frazioni di campioni SPION relativamente monodispersi. Queste frazioni sono indicate come C1 – C5. La miscela di partenza grezza, Resovist® e Sinerem® sono denominate rispettivamente C, R e S.
Sono stati condotti esperimenti sistematici multipli per identificare le velocità e i tempi di centrifugazione ottimali per ottenere SPION monodisperso con dimensioni ben definite. Le condizioni ottimali per l’isolamento dimensionale sono presentate in Fig. 1.
Le efficienze di produzione delle frazioni isolate in base alle dimensioni C1, C2, C3, C4 e C5 erano rispettivamente circa 7, 29, 23, 18 e 11%.
Nonostante il gran numero di pubblicazioni precedenti che descrivono la sintesi di nanoparticelle di ossido di ferro, gli strumenti e le tecnologie per la loro separazione dimensionale sono relativamente limitati. Le tecniche impiegate per controllare la dimensione media delle particelle e la polidispersità possono essere basate sull’uso di campi magnetici / elettrici, mezzi porosi e purificazione basata sulla massa e sulla densità [12,13,14].
Fortin e colleghi, ad esempio, sintetizzarono nanocristalli rivestiti di citrato di maghemite e ferrite di cobalto mediante co-precipitazione alcalina e ordinarono le dimensioni delle nanoparticelle mediante successiva separazione di fasi elettrostatiche [15].
Il frazionamento del flusso di campo magnetico (MFFF) utilizza un campo magnetico esterno omogeneo applicato ortogonalmente alla direzione del flusso, per ottenere un’efficace separazione delle particelle [12].
La cromatografia non magnetica per esclusione dimensionale (SEC) è un altro metodo frequentemente usato per la separazione dimensionale delle nanoparticelle di ossido di ferro. Le frazioni separate da SEC e MFFF hanno distribuzioni di dimensioni simili.
Tuttavia, il QFP è più veloce e ha una capacità maggiore [12, 16]. Oltre alle tecniche di cui sopra, recentemente è stato istituito un sistema di cattura e rilascio magnetico differenziale (DMCR) per classificare le nanoparticelle magnetiche. Il DMCR, come MFFF, si basa su un campo magnetico esterno per separare le specie magnetiche [17].
La separazione magnetica ad alto gradiente (HGMS) è un metodo di flusso a colonna utilizzato per isolare le nanoparticelle di ossido di ferro da un mezzo non magnetico [18]. L’elettroforesi capillare (CE) viene utilizzata per la separazione di nanoparticelle colloidali in un campo elettrico.
CE richiede attrezzature specializzate, a causa dell’elevato campo elettrico. Il frazionamento del flusso di campo elettrico (ElFFF) separa le nanoparticelle di ossido di ferro in base alle loro dimensioni e mobilità elettroforetica ma senza gli svantaggi della CE [12, 16].
Rispetto alle tecniche di cui sopra, il metodo di centrifugazione qui presentato è un po ‘più dispendioso in termini di tempo e lavoro, ma è anche più facile da eseguire e ampiamente applicabile, poiché non richiede attrezzature specializzate.
Biocompatibilità SPION
Quasi tutte le formulazioni SPION sono risultate biocompatibili. File aggiuntivo 1: le figure S2 – S4 documentano la citotossicità osservata per i campioni grezzi, C1 – C5, Resovist® e Sinerem® studiati con i test XTT, LDH e ROS. L’analisi XTT a concentrazioni di ferro di 0,1 e 1,0 mM non ha mostrato differenze significative nella vitalità delle cellule NIH3T3 al momento dell’incubazione con i campioni C1-C5 rispetto a Resovist® e Sinerem®.
È interessante notare che, a concentrazioni di ferro di 5 e 10 mM, la valutazione della vitalità basata su XTT ha indicato che tutti i campioni monodispersi, tranne C1, presentavano una biocompatibilità ancora maggiore rispetto a Resovist® e Sinerem® (File aggiuntivo 1: Figura S2).
I risultati XTT sono stati confermati usando il dosaggio LDH (File aggiuntivo 1: Figura S3). A concentrazioni di ferro di 0,1 e 1 mM, non sono state osservate variazioni nel danno alla membrana di NIH3T3 per C1-C5 rispetto a Resovist® e Sinerem®, mentre a concentrazioni di ferro di 5 e 10 mM, i valori di LDH (e danni alla membrana) erano inferiori a per Resovist® e Sinerem® (di nuovo ad eccezione del lotto di dimensioni più piccole C1).
In linea con questo, l’analisi della produzione di ROS nelle cellule NIH3T3 ha mostrato che non vi era alcun cambiamento significativo nel contenuto di ROS delle cellule esposte ai campioni monodispersi C1-C5 rispetto al campione grezzo, Resovist® e Sinerem® (File aggiuntivo 1: Figura S4).
Insieme, questi risultati dimostrano che tutti i campioni monodispersi, tranne C1, hanno una tossicità trascurabile. Si presume che la maggiore citotossicità associata alle particelle più piccole derivi da un assorbimento cellulare più rapido e più esteso, nonché da una superficie relativamente più ampia [19,20,21].
Stabilità SPION in terreni fisiologici
Tutti i campioni SPION isolati in base alla dimensione hanno mostrato un’eccellente stabilità in acqua DI (vedere le colonne 4 e 5 del file aggiuntivo 1: Tabella S1; dimostrazione di dispersione stabile fino a 6 mesi). Ciò può essere attribuito alla superficie altamente caricata negativamente di SPION.
Tutte le formulazioni SPION hanno anche mostrato un’elevata stabilità colloidale nei mezzi fisiologici, cioè nel siero bovino fetale (FBS) e nell’albumina sierica bovina (BSA). Il monitoraggio dei campioni mediante ispezione visiva fino a 24 h implica l’assenza di aggregazione di SPION (vedere File aggiuntivo 1: Figure S5a e S6a).
In linea con questo, i diametri idrodinamici e PDI ottenuti usando DLS per 2, 6 e 24 ore di incubazione in mezzi fisiologici non hanno mostrato cambiamenti significativi nella dimensione e nella distribuzione delle dimensioni (vedere File aggiuntivo 1: Figure S5b, c, S6b, ce Tabella S1).
In buon accordo con le nostre scoperte, Yu et al. sintetizzato due diversi tipi di SPION con diversi rivestimenti superficiali: SPION con rivestimento di idrossido di tetrametilammonio (T-SPION) e SPION con rivestimento di citrato (C-SPION). Il C-SPION ha mostrato una solida stabilità nei media biologici, mentre T-SPION si è aggregato rapidamente in tutti i media valutati [22].
Imaging a risonanza magnetica
Tutti i campioni SPION hanno mostrato prestazioni eccellenti come agente di contrasto per imaging a risonanza magnetica (MRI).
Figura 4 e file aggiuntivo 1: le figure S8–10 mostrano le immagini RM ponderate T1 e T2 e la quantificazione dei parametri chiave della risonanza magnetica per i campioni grezzi, C1 – C5, Resovist® e Sinerem® [vale a dire relax (r1, r2), rilassamento tassi (1 / T1, 1 / T2) e rapporti di relax (r2 / r1)]. La Figura 4 indica che tutti i campioni appena preparati, ovvero SPION monodisperso e polidisperso, presentano rilassanze trasversali (r2) maggiori di Resovist® e Sinerem®. È interessante notare che, mentre la miscela di partenza grezza e Resovist® erano entrambe altamente polidisperse, il valore r2 del primo è risultato essere due volte superiore a quello del secondo.
Dopo la centrifugazione sequenziale, i valori di r2 dello SPION monodisperso aumentano gradualmente fino al terzo ciclo di centrifugazione. Il campione C3 con dimensioni del nucleo di 13,1 ± 2,2 nm possedeva le capacità MRI più ottimali, con un valore di r2 di 434 mM − 1 s − 1. Ha prodotto un contrasto 3,3 e 5,5 volte maggiore nell’imaging pesato in T2 rispetto a Resovist® (130 mM − 1 s − 1) e Sinerem® (79 mM − 1 s − 1), rispettivamente. Numerosi studi hanno dimostrato che le dimensioni del nucleo, la distribuzione delle dimensioni e la magnetizzazione di SPION sono fattori chiave che influenzano la velocità di rilassamento trasversale (1 / T2) [15, 30]. La tendenza per i valori di r1 per i campioni C1-C5 è risultata simile a quella osservata per i valori di r2.
L’efficienza di un mezzo di contrasto T2 si basa sul rapporto r2 / r1 oltre al valore r2 [31]. In questo contesto, è importante notare che per tutti i campioni isolati per dimensione, si può concludere che esiste un miglioramento specifico del rapporto r2 / r1 rispetto a Resovist® e Sinerem® (File aggiuntivo 1: Figura S10), confermando l’idoneità di questi campioni per l’imaging RM ponderato T2.
Saraswathy e colleghi hanno sintetizzato nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con citrato con un rivestimento simile e con dimensioni del nucleo simili a quelle del campione C3. Hanno utilizzato questa formulazione SPION per la risonanza magnetica in vivo della fibrosi epatica. I valori di r1 e r2 erano 2,69 e 102 mM − 1 s − 1, rispettivamente [32].
Il confronto del valore r2 / r1 della loro formulazione (cioè 37,9) con quello del nostro campione C3 (ovvero 84,4) esemplifica l’utilità e il potenziale valore aggiunto del nostro protocollo sequenziale di isolamento dimensionale.
Smolensky et al. ha studiato l’effetto di molteplici parametri, tra cui dimensione e forma delle particelle, temperatura e intensità del campo magnetico, sulle rilassanze longitudinali e trasversali delle nanoparticelle di ossido di ferro. Secondo i loro risultati, i valori di r2 sono aumentati linearmente con l’aumentare delle dimensioni del nucleo (da 4,9 a 18 nm), mentre i valori di r1 sono rimasti relativamente costanti per particelle con dimensioni del nucleo superiori a 8 nm [33].
Anche il rivestimento superficiale e l’aggregazione di nanoparticelle sono parametri molto importanti. Blanco-Andujar e collaboratori hanno studiato l’evoluzione di r2 con dimensione aggregata SPION [34]. Nel caso di piccoli cluster, le nanoparticelle vengono disperse omogeneamente in acqua e i protoni possono diffondersi rapidamente tra i nuclei magnetici.
In queste condizioni, i valori di r2 aumentano gradualmente con diametro idrodinamico (fino a circa 80 nm). A una dimensione di 80–90 nm, non vi è ulteriore aumento di r2. Se la dimensione supera 90 nm, i valori di r2 iniziano a diminuire con l’aumentare della dimensione, a causa della riduzione dell’accessibilità della superficie e del tasso di cambio del protone.
Questa tendenza è in linea con i nostri risultati, mostrando riduzioni dei valori di r2 quando il diametro idrodinamico supera i 70 nm (i valori di r2 per C4 e C5 sono rispettivamente 398 e 350 mM − 1 s − 1, rispetto a 434 mM − 1 s −1 per C3).
L’imaging delle particelle magnetiche
SPION sono importanti materiali traccianti per l’imaging delle particelle magnetiche (MPI). MPI è una tecnica di imaging hot spot nuova e sempre più popolare che può essere utilizzata per visualizzare nanoparticelle magnetiche con altissima risoluzione temporale e spaziale.
MPI è in grado di fornire informazioni di imaging 3D in tempo reale sulla localizzazione e concentrazione di nanoparticelle magnetiche e può essere impiegato per molteplici applicazioni di imaging medico [35].
La potenziale utilità di MPI dipende fortemente dalla disponibilità di SPION ottimizzato per le dimensioni per generare immagini di alta qualità. È un dato di fatto, la generazione del contrasto MPI dipende in modo critico sia dalla dimensione SPION sia dalla distribuzione della dimensione, poiché entrambi i parametri influenzano fortemente la risposta della magnetizzazione.
Resovist® è stato originariamente sviluppato come mezzo di contrasto per la risonanza magnetica. Negli ultimi anni, è stato anche ampiamente utilizzato per MPI, a causa del suo grande momento magnetico. Al momento, Resovist® è la formulazione SPION maggiormente utilizzata per MPI.
Dalle immagini TEM, è noto che Resovist® è costituito principalmente da particelle con un diametro medio del nucleo di 5,8 ± 2,5 nm, molte delle quali sono agglomerate in gruppi (Fig. 2a). Si presume che questi aggregati, che sono formati da piccole particelle elementari, siano responsabili delle sue buone prestazioni MPI [26].
Tuttavia, le prestazioni MPI di Resovist® lasciano ancora spazio per miglioramenti significativi. Di conseguenza, negli ultimi anni, sempre più scienziati hanno iniziato a lavorare sullo sviluppo di migliori formulazioni SPION per MPI [26, 36].
La Figura 5a mostra i valori segnale-rumore (SNR) MPI delle diverse formulazioni SPION utilizzate in questo studio, ottenute alla quarta frequenza armonica del campo di azionamento. Mostra anche l’intera larghezza a metà dei valori massimi (FWHM) e la perdita di isteresi determinata dalle misurazioni della funzione di diffusione del punto (PSF).
Per consentire un confronto quantitativo, è generalmente considerato sufficiente leggere il SNR ad una frequenza armonica. Questa è in genere la 4a frequenza armonica (Fig. 5a). File aggiuntivo 1: la figura S11 mostra i valori SNR per altre frequenze armoniche. Per confrontare le prestazioni MPI dei diversi campioni, i valori SNR sono stati normalizzati alla concentrazione di ferro all’interno del volume della sonda.
I valori SNR normalizzati per C2 e C3 sono risultati molto più alti rispetto a tutti gli altri campioni. Alla quarta frequenza armonica, il SNR normalizzato per C2 era 2,3 e 7,0 volte superiore rispetto a Resovist® e Sinerem®, rispettivamente.
Inoltre, l’analisi della perdita di isteresi e FWHM ha mostrato che C2 e C3 erano quasi buoni quanto Resovist®. Minori valori di perdita di FWHM e isteresi si riferiscono rispettivamente a una risoluzione spaziale più alta raggiungibile e ad uno spostamento spaziale inferiore in MPI, rispettivamente.
Per esemplificare le capacità di imaging MPI del nostro SPION isolato in base alle dimensioni, abbiamo fabbricato due fantasmi. Uno era un fantasma a forma di E (Fig. 5b), che fungeva da struttura un po ‘più complessa, composta da singoli punti riempiti di tracciante di 0,5 mm.
L’altro fantasma era a forma di V (File aggiuntivo 1: Figura S12a) ed era costituito da singoli punti con un diametro di 0,5 mm con una distanza crescente tra loro (2, 3, 4, 5 e 6 mm). Entrambi i fantasmi sono stati riempiti con la miscela di partenza grezza, con il campione C2 e con Resovist®, assicurandosi che le concentrazioni di ferro fossero identiche. Figura 5c e
File aggiuntivo 1: la Figura S12b mostra i profili di linea delle intensità del voxel lungo le linee contrassegnate in rosso per i fantasmi E e V, rispettivamente. Si può vedere che le intensità più bassa e più alta si ottengono rispettivamente con il campione grezzo e C2. Il campione C2 ha prodotto intensità di segnale oltre due volte superiori a quelle di Resovist®.
Dall’analisi dei parametri MPI e dagli esperimenti fantasma MPI si può quindi concludere che la formulazione C2 (e in misura minore anche la C3) è un’alternativa utile per Resovist® e un agente di contrasto adatto per MPI.
Ulteriori informazioni: Contrasto in vivo ad alta sensibilità per la risonanza magnetica a campo ultraleggero mediante nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico, Science Advances (2020). DOI: 10.1126 / sciadv.abb0998
