L’immunoterapia per l’osteosarcoma tratta con successo il cancro alle ossa nei cani

L’osteosarcoma, un tumore osseo comune nei cani, colpisce più di 10.000 cani negli Stati Uniti ogni anno. Mentre la chemioterapia è generalmente efficace nell’uccidere alcune delle cellule tumorali, i numerosi effetti collaterali possono essere dolorosi e spesso esiste un sottogruppo di cellule tumorali resistenti alla chemioterapia.

Per offrire un’alternativa, Jeffrey Bryan, professore presso il College of Veterinary Medicine dell’Università del Missouri, e il team di oncologia veterinaria hanno collaborato con ELIAS Animal Health per creare un vaccino dal tumore di un cane per colpire e uccidere le cellule tumorali nei cani affetti da osteosarcoma .

Ora, il successo di questo trattamento nei cani ha portato la Food and Drug Administration (FDA) a concedere una rara designazione prioritaria per l’organizzazione madre di ELIAS Animal Health, TVAX Biomedical, per utilizzare l’approccio di immunoterapia ELIAS per trattare il glioblastoma multiforme, un tumore cancro al cervello nell’uomo.

“Questo approccio di medicina di precisione utilizza il tumore del paziente per creare un vaccino, che stimola il sistema immunitario contro le proteine ​​anomale specifiche del tumore del paziente, causando l’organismo a generare globuli bianchi, chiamati linfociti”, ha detto Bryan, che funge anche da il direttore associato di oncologia comparata per l’Ellis Fischel Cancer Center e un responsabile della ricerca della facoltà per il NextGen Precision Health Institute.

“Quindi raccogliamo ed espandiamo questi linfociti fuori dal corpo, il che li attiva in modo che siano altamente aggressivi verso il loro obiettivo. Infondendoli nuovamente nel corpo del paziente, possono cercare e distruggere le cellule cancerose dannose. “

Uno studio clinico appena completato presso il College of Veterinary Medicine della MU ha scoperto che i cani sottoposti a questa terapia hanno avuto più di 400 giorni di sopravvivenza al cancro rispetto a circa 270 giorni per i cani sottoposti a chemioterapia in uno studio separato del National Cancer Institute.

Con un impatto positivo sugli esiti sanitari nei cani con carcinoma osseo, la FDA ha concesso una designazione accelerata per questo approccio da utilizzare negli studi sull’uomo per curare il cancro al cervello nelle persone.

” Sia l’osteosarcoma nei cani che il glioblastoma multiforme nelle persone sono malattie molto aggressive che tendono a prendere rapidamente la vita del paziente ed esprimono entrambe proteine ​​mutanti che possono essere bersagli per il sistema immunitario”, ha affermato Bryan, che fa parte del comitato scientifico consultivo per ELIAS Animal Health.

“La bellezza di questo approccio di immunoterapia è che può essere teoricamente generalizzato per qualsiasi tipo di cancro. 

L’avanzamento di questi studi sull’uomo dimostra che possiamo applicare questa tecnologia per aiutare a trattare diverse malattie che sono molto mortali e che attualmente hanno poche terapie efficaci. “

ELIAS Animal Health sta continuando lo sviluppo di questa immunoterapia per l’osteosarcoma in cerca di approvazione da parte del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti in modo che il trattamento possa essere utilizzato su cani in tutto il Nord America.

Inoltre, se gli studi sull’uomo di TVAX Biomedical sono in grado di trattare con successo il glioblastoma multiforme, l’approccio dell’immunoterapia potrebbe essere ampliato per trattare altri tumori nell’uomo.

“La mia speranza è che un giorno questo approccio possa essere usato per trattare il cancro alle ossa nei bambini ” , ha detto Bryan. “Il mio obiettivo generale è quello di far parte di scoperte che non solo giovano ai cani ma anche agli umani.”

La ricerca di Bryan è un esempio di medicina di precisione, un componente chiave della NextGen Precision Health Initiative. Collaborando con i leader del governo e del settore, l’iniziativa contribuirà ad accelerare le scoperte mediche per entrambi i pazienti nel Missouri e oltre.

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Gli osteosarcomi (OS) sono i più comuni sarcomi ossei maligni primari, con una distribuzione dell’età bimodale. L’incidenza più alta è nei bambini e negli adolescenti (mediana di 18 anni), con un secondo picco più piccolo di incidenza negli anziani oltre i 60 anni.

A livello mondiale, l’incidenza di OS è di circa 1-3 casi all’anno per milione di persone [1]. Questi tumori si sviluppano principalmente nelle ossa lunghe (femore, tibia, omero), vicino alla placca di crescita nella metafisi ossea e meno frequentemente nel cranio, nella mascella e nel bacino.

I SO sono caratterizzati dalla presenza di cellule osteoblastiche trasformate che producono matrice osteoide. Tuttavia, l’identità precisa della cellula all’origine del tumore rimane sconosciuta. Le prove supportano l’idea di un’origine dell’OS nelle cellule staminali / stromali mesenchimali (MSC) e / o in precursori osteoblastici più impegnati [2,3].

Dall’introduzione delle chemioterapie per il trattamento della OS alla fine degli anni ’70, i pazienti con diagnosi di OS ricevono un trattamento neo-adiuvante seguito da una terapia adiuvante post-operatoria con un cocktail di chemioterapie, ovvero metotrexato ad alte dosi (12 g / m2), etoposide e ifosfamide per bambini e giovani adulti (<25 anni) nello studio francese OS2006 / sarcome-09 [4], o altri protocolli che combinano doxorubicina, cisplatino e ifosfamide con o senza metotrexato ad alte dosi [5,6,7] .

Con questi regimi terapeutici, la sopravvivenza a 5 anni ha raggiunto il 78% per bambini e giovani adulti con malattia localizzata, ma rimane ancora solo del 20% nei pazienti con metastasi alla diagnosi o in recidiva [1,4].

Inoltre, negli ultimi 40 anni, la sopravvivenza non è notevolmente migliorata per i pazienti senza metastasi e non è migliorata affatto per i pazienti metastatici [8]. Pertanto, il miglioramento della terapia per OS rimane un obiettivo costante e importante per molti gruppi di ricerca e clinici in tutto il mondo.

Una delle principali caratteristiche dei tumori della OS è la loro eterogeneità, sia a livello intra-tumorale che tra individui. Pertanto, i processi biologici di inizio genomici comuni che guidano l’osteosarcomagenesi non sono ancora identificati.

La complessità del genoma somatico dell’OS è una delle principali cause di eterogeneità intra-tumorale, caratterizzata da aneuploidia cromosomica, alterazione dei geni mediante mutazione e / o variazione del numero di copie, instabilità genomica caratterizzata da un massiccio riarrangiamento attraverso la cromotripsi e la presenza di schemi di regioni ipermutate localizzate, chiamate kataegis [9].

È stato scoperto che una piccola serie di geni è mutata in modo ricorrente nel sistema operativo (TP53, RB, MDM2, ATRX e DLG2) [10]. Recentemente, è stato descritto un sottoinsieme di OS con alterazioni genomiche nei geni delle vie di riparazione del DNA, che ricordano i tumori carenti di BRCA1 / 2 [11].

Diverse sindromi ereditarie come Li-Fraumeni, Rothmund – Thomson, Werner, Bloom e tumori familiari del retinoblastoma sono state anche associate a una predisposizione allo sviluppo di OS [9].

Tuttavia, nella stragrande maggioranza dei casi (95%), i SO appaiono come eventi sporadici. Complessivamente, gli eventi oncogenici mal definiti associati all’elevata eterogeneità cellulare delle cellule tumorali rendono difficile lo sviluppo di terapie molecolari mirate dedicate esclusivamente alle cellule tumorali.

I sarcomi ossei, e in particolare i sistemi operativi, crescono nel microambiente osseo, un ambiente molto specializzato, complesso e altamente dinamico composto da cellule ossee (osteoclasti, osteoblasti, osteociti), cellule stromali (MSC, fibroblasti), cellule vascolari (cellule endoteliali e periciti), cellule immunitarie (macrofagi, linfociti) e una matrice extracellulare mineralizzata (ECM).

In condizioni fisiologiche, un’attività orchestrata coordinata e perfezionata delle cellule ossee, vascolari e stromali assicura l’omeostasi ossea attraverso intense comunicazioni paracrine e cellulari.

Secondo la teoria di Paget [12], le cellule tumorali trovano in questo microambiente un terreno fertile da seminare e riescono a sfruttare le vie fisiologiche ossee a loro vantaggio per sopravvivere e crescere.

Il dialogo incrociato tra OS e microambiente osseo coinvolge numerosi segnali ambientali, indotti da più citochine, chemochine e fattori di crescita solubili [13], ma anche veicolati da vescicole extracellulari (EV), considerati oggi vettori efficaci di comunicazione tra cellule [ 14].

Nel sistema operativo, la difficoltà di progettare e convalidare nuove terapie si basa su due livelli di complessità: in primo luogo, un’elevata eterogeneità nelle cellule tumorali senza evidente evento bersaglio, e in secondo luogo, un microambiente attivo e reattivo composto da cellule attive, interconnesse e che comunicano intensamente attraverso secrezione paracrina di fattori solubili ed EV.

In questa recensione, descriviamo i diversi attori del microambiente OS nel contesto della loro complessa interazione con le cellule tumorali. Discutiamo anche le strategie terapeutiche passate, attuali e future, riguardanti il ​​complesso ecosistema dell’OS, con particolare attenzione all’emergenza di inibitori della multi-chinasi (MKI) che colpiscono le cellule tumorali e le cellule del loro microambiente e il ruolo di EV come trasportatori essenziali di informazioni nella biologia del sarcoma osseo.

Osteoclasti e osteolisi del rimodellamento osseo indotti dal sistema operativo

Lo sviluppo dell’OS è associato all’osteolisi para-tumorale, causando frequente fragilità ossea dolorosa al momento del rilevamento dell’OS nei pazienti. L’aggressività dell’OS è stata associata ai marcatori di osteolisi in alcuni casi clinici [15].

In particolare, il legame dell’attivatore del recettore della molecola solubile del fattore nucleare kappa B Ligand (RANKL), alias TNFSF11, con il suo recettore (RANK), regola principalmente l’osteolisi attraverso la regolazione paracrina.

RANKL è prodotto da osteoblasti e osteociti nell’ambiente osseo [16], mentre RANK è espresso sulla superficie cellulare dei precursori degli osteoclasti [17]. Nei sistemi operativi, l’attività degli osteoclasti porta a un circolo vizioso tra proliferazione cellulare OS e degradazione ossea, portando al rilascio di fattori pro-tumorali come il fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF1) o trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) la matrice ossea [13,18].

Tuttavia, studi clinici che hanno utilizzato la terapia con anticorpi monoclonali per bloccare la tirosina chinasi del recettore IGF in pazienti con OS hanno mostrato tassi di risposta limitati e imprevedibili, portando alla sospensione di questa terapia [19].

Il legame dell’osteolisi nel circolo vizioso osservato nell’OS è stato dimostrato in studi preclinici, utilizzando inibitori chimici (principalmente acido zoledronico, ZOL) [20,21] o concorrenti del recettore RANKL (compresa l’osteoprotegerina (OPG) [22], RANK- Fc [23]) o RANKL silenziamento [24].

Pertanto, l’inibizione dell’osteolisi è diventata un bersaglio terapeutico attraente in combinazione con chemioterapici per il trattamento dell’OS. Tuttavia, avviato sulla base di promettenti studi preclinici, OS2006, uno studio clinico di Fase III che combina ZOL con chemioterapia e chirurgia ha dato risultati molto deludenti, senza miglioramenti ma risultati terapeutici leggermente peggiori [25].

Nonostante il fatto che ZOL sia stato anche descritto in vitro per avere un effetto diretto sulle cellule OS, la sua efficacia contro la crescita primaria dell’OS e le metastasi polmonari rimane controversa [26].

L’implicazione diretta dell’attività degli osteoclasti nello sviluppo e nella progressione dell’OS nei pazienti è ancora difficile da decifrare. In effetti, una perdita di osteoclasti era associata ad un aumento delle metastasi in un modello preclinico di OS [27], mentre la co-iniezione di pre-osteoclasti con cellule di OS umane non aveva alcun effetto sulla crescita locale dell’OS e sulle metastasi polmonari nei topi nudi [28].

Denosumab, un anticorpo diretto contro RANKL, inibisce efficacemente l’attività degli osteoclasti ed è attualmente usato per trattare la perdita ossea nelle metastasi ossee, mieloma multiplo o tumori a cellule giganti.

Tuttavia, fino ad oggi non sono stati riportati risultati clinici per denosumab nei pazienti con OS, tranne in associazione con MKI sorafenib per un paziente [29,30]. Anche seguendo un targeting più specifico di RANKL, denosumab non ha un’azione differenziata verso diversi tipi di cellule.

In effetti, il percorso RANKL / RANK è coinvolto non solo negli osteoclasti, ma anche in molte altre cellule dell’ambiente tumorale, inclusi osteoblasti, cellule stromali, cellule immunitarie (linfociti T e B, cellule dendritiche) e cellule endoteliali.

L’accoppiamento locale tra riassorbimento e formazione ossea è essenziale per preservare la densità ossea e dovrebbe verificarsi in unità multicellulari di base, inclusi osteoclasti e osteoblasti, che sono coperti da cellule di rivestimento osseo che formano un baldacchino, come originariamente descritto da Lassen et al. [31].

Sotto il baldacchino, RANKL secreto dagli osteoblasti induce la differenziazione degli osteoclasti, come descritto in un paradigma ben dimostrato. È interessante notare che un nuovo modello di paradigma di comunicazione intercellulare degli osteoclasti verso gli osteoblasti può essere rilevante (Figura 1), poiché è stato recentemente riportato che gli osteoclasti maturi sono stati in grado di produrre veicoli elettrici con RANK, consentendo l’interazione con RANKL sugli osteoblasti [32].

Gli EV portatori di RANK sono stati inizialmente identificati negli osteoclasti primari di topo e nei precursori derivati ​​dal midollo osseo [33]. Di recente, Ikebuchi et al. ha dimostrato efficacemente che gli EV portatori di RANK emessi da osteoclasti maturi di topo sono stati in grado di interagire con gli osteoblasti che esprimono RANKL e quindi di indurre la differenziazione osteoblastica accoppiata con la formazione ossea che coinvolge la segnalazione RUNX2 [32].

La segnalazione di RANKL-reverse negli osteoblasti è stata dimostrata usando il RANK-masking su veicoli elettrici e creando un modello di topo mutante RanklP29A, dove il dominio di segnalazione intracellulare RANKL è stato soppresso.

Di conseguenza, l’interazione RANK – RANKL sembra essere bidirezionale, doppia e complementare nell’accoppiamento del riassorbimento e della formazione ossea: la trasduzione RANK su osteoclasti e precursori attiva l’osteolisi, mentre la trasduzione RANKL su osteoblasti e precursori attiva l’osteogenesi.

Nel contesto dell’OS, il rimodellamento osseo è collegato a un circolo vizioso tra osteoclasti e cellule tumorali [22], che si instaura attraverso il rilascio di fattori di crescita dalla matrice ossea degradata. Tuttavia, questo circolo vizioso può essere ulteriormente potenziato dagli EV secreti dagli osteoclasti e dalle cellule OS [34].

Infatti, i veicoli elettrici secreti dalle cellule OS sono stati in grado di migliorare l’osteolisi, mentre i RANK-EV secreti dagli osteoclasti possono attivare la RANKL espressa sulle cellule OS [35], suggerendo una possibile segnalazione inversa RANK – RANKL nella OS, come precedentemente descritto nella normale fisiologia ossea [ 32].

In uno studio clinico retrospettivo su 40 pazienti, l’espressione di RANKL è stata osservata nel 75% dei campioni di biopsia dell’OS e il suo livello di espressione elevata è stato correlato a un risultato scarso del paziente [36]. Branstetter et al. [37] hanno rilevato RANKL nel 68% dei SO umani, ma solo il 37% dei campioni di OS ha mostrato più del 10% delle cellule tumorali che esprimono RANKL.

Lo stesso anno, è stato riferito che la proliferazione delle linee cellulari OS che esprimono RANKL è stata aumentata attraverso la segnalazione di trasduzione che comporta l’attivazione di AKT ed ERK quando le cellule sono state esposte a OPG [38].

Si potrebbe ipotizzare che RANKL espresso sulla superficie delle cellule OS possa essere stato attivato da OPG, poiché questa proteina è la forma esca e solubile di RANK che lega RANKL (Figura 2).

Tuttavia, si ritiene che questo effetto pro-proliferativo di OPG sia indipendente da RANKL poiché RANK solubile non ha indotto effetti simili. Pertanto, è stato proposto che l’effetto pro-proliferativo di OPG fosse mediato da un recettore sconosciuto.

Per quanto riguarda l’identificazione innovativa della segnalazione inversa di RANKL come descritto sopra (Figura 1 e Figura 2) [32], l’attivazione di RANKL nelle cellule del sistema operativo dovrebbe essere rivisitata, poiché i RANK-EV rilasciati dagli osteoclasti potrebbero avere un ruolo inatteso nel sistema operativo attraverso un possibile segnalazione inversa RANK – RANKL nelle celle del sistema operativo.

Osteoblasti e formazione
ossea I tumori ossei primari hanno potenti influenze locali sull’osso e le conseguenze cliniche di queste influenze possono essere devastanti. La OS è caratterizzata dalla formazione di una matrice osteoide che circonda le cellule tumorali anaplastiche [39,40] e può stimolare la formazione di varie strutture ossee, come i triangoli di Codman o le spine ossee, progettate come reazione periostale dello sprazzo di sole.

Lo schema a raggi solari dell’osso è dovuto ai nuovi strati di fibre di collagene che si estendono perpendicolarmente all’osso. Questo processo è principalmente dovuto a una deregolamentazione del rimodellamento osseo e in parte all’attività degli osteoblasti non tumorali, come osservato nei modelli OS del topo.

I progenitori osteoblastici sono MSC presenti principalmente nel midollo osseo e, in particolare, cellule staminali scheletriche multipotenti (MSSC), che sono un sottoinsieme di MSC recentemente identificate [41].

Sotto il controllo di diversi fattori di trascrizione specifici, le MSC sono in grado di differenziarsi in osteoblasti, condroblasti, mioblasti e adipociti, mentre le MSCC si differenziano in osteoblasti e condroblasti, ma non in mioblasti e adipociti.

Tuttavia, non ci sono ancora prove che indichino che le MSC o le MSSC siano le cellule più importanti nella patogenesi dell’OS. Le attuali conoscenze sull’osteoblastogenesi si basano sulla differenziazione MSC anziché MSSC. In breve, l’espressione del fattore di trascrizione RUNX2 e Osterix o SOX9 porta alla differenziazione dell’MSC, rispettivamente verso i lignaggi osteoblastici e condroblastici [42].

La differenziazione delle MSC in osteoblasti maturi comporta una serie complessa di fasi di proliferazione e differenziazione (Figura 3). In breve, RUNX2 (noto anche come CBFA1) è un fattore trascrizionale che lega un sito di consenso, chiamato OSE2, presente lungo i promotori prossimali di molti geni tra cui quelli della catena α1 del collagene di tipo I (COL1A1), sialoproteina ossea (BSP), osteocalcina (OCN) e osteopontin (OPN) [43,44].

RUNX2 è fondamentale per le prime fasi della differenziazione dell’MSC in pre-osteoblasti e per mantenere la funzione osteoblastica, mentre Osterix (noto anche come SP7) è coinvolto nella differenziazione osteoblastica principalmente a valle di RUNX2 consentendo la differenziazione degli pre-osteoblasti in osteoblasti maturi funzionali [ 45].

A monte di questi fattori trascrizionali, una cascata di trasduzione del segnale deve essere attivata da citochine o fattori di crescita come TGF-β, fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) o membri della famiglia del sito di integrazione MMTV di tipo senza ali (WNT). La maggior parte di queste citochine o fattori di crescita sono implicate nello sviluppo del sistema operativo.

La famiglia TGF-β comprende almeno 30 membri nell’uomo [46]. Il ruolo dei TGF-β durante il rimodellamento osseo è complesso. Per quanto riguarda il lignaggio osteoblastico mesenchimale, il TGF-β1 favorisce la formazione ossea stimolando la proliferazione e la migrazione delle MSC durante le prime fasi dell’osteoblastogenesi [47,48].

Al contrario, durante le ultime fasi dell’osteoblastogenesi, il TGF-β1 inibisce la differenziazione delle MSC negli osteoblasti e la mineralizzazione degli osteoblasti maturi in coltura [49]. È interessante notare che TGF-β1 è principalmente implicato nello sviluppo dell’OS durante la crescita tumorale primaria o la progressione metastatica [50].

Il blocco dell’attività del TGF-β nelle cellule OS da parte della sovraespressione di SMAD7 ha ridotto la crescita tumorale primaria influenzando le relazioni tra cellule tumorali e cellule non tumorali [51].

Gli FGF sono anche regolatori chiave dello sviluppo scheletrico [52]. Ad esempio, l’FGF2 è importante per la proliferazione e la maturazione dei pre-osteoblasti, mentre l’FGF18 è essenziale per la formazione matura di osteoblasti.

Pertanto, i recettori FGF sono tirosina chinasi dei recettori che possono rappresentare un bersaglio terapeutico nei pazienti con OS [53]. Infatti, Weekes et al. ha riportato un’importante riduzione delle metastasi polmonari dopo aver usato l’inibitore AZD4547 per bloccare la segnalazione del recettore FGF a seguito dell’induzione dell’OS nei topi [54].

I WNT sono una famiglia di 19 glicoproteine ​​secrete. Il legame di un ligando WNT (cioè, WNT1, WNT3a) a un recettore cresciuto (FZD) e il suo co-recettore LRP5 / 6 attiva la via canonica WNT [55].

L’attivazione della cascata di segnalazione WNT porta alla promozione della formazione ossea e alla soppressione del riassorbimento osseo, portando a un equilibrio nel rimodellamento osseo [56]. È interessante notare che un anticorpo monoclonale contro l’inibitore di segnalazione WNT dickkopf-1 ha inibito le metastasi dell’OS in un modello preclinico di OS [57].

In questo modo emergono prove del ruolo degli osteoblasti nella crescita tumorale nell’osso. Gli osteoblasti regolano direttamente la sintesi della matrice ossea tramite il proprio secretoma e indirettamente regolano il riassorbimento osseo attraverso il rilascio di RANKL, che lega RANK ai precursori degli osteoclasti come precedentemente presentato (Figura 1).

Inoltre, RANK è espresso su MSC ed è downregolato durante l’osteoblastogenesi. Curiosamente, Branstetter et al. non ha rilevato l’espressione RANK sulle cellule tumorali nei campioni di OS [37].

Tuttavia, si potrebbe affrontare l’importanza della segnalazione RANK nelle cellule OS, che derivano da cellule impegnate nella via di differenziazione tra MSC o pre-osteoblasti verso osteoblasti maturi [58].

In questo contesto, Navet et al. studiato il ruolo della sovraespressione di RANK nelle linee cellulari dell’OS e durante lo sviluppo dell’OS nei topi immunodeficienti [59]. L’attivazione del percorso RANKL – RANK in queste linee cellulari OS non ha modificato la proliferazione o migrazione cellulare, né la crescita tumorale in vivo.

Tali risultati suggeriscono che l’attivazione di RANK nelle cellule OS non è coinvolta nella crescita tumorale. Tuttavia, le cellule OS che sovraesprimono RANK hanno indotto un aumento significativo delle metastasi polmonari che è stato prevenuto con un anticorpo diretto contro RANKL.

In un altro studio [23], la delezione di tutto il corpo delle proteine ​​RANKL ha impedito lo sviluppo di OS e metastasi polmonari in topi geneticamente predisposti mentre, al contrario, la delezione di rango negli osteoblasti non ha modificato il carico di OS, né le metastasi polmonari. L’attivazione del percorso RANKL – RANK non sembra essere direttamente implicata nello sviluppo del sistema operativo, ma può essere indirettamente coinvolta nella progressione del sistema operativo.

L’implicazione di una potenziale segnalazione inversa di RANKL nelle cellule OS non è stata testata in questi studi, ma sarebbe interessante ora prendere in considerazione le implicazioni della trasduzione di RANKL sugli osteoblasti [32] (Figura 1).

Gli anticorpi contro RANKL e la delezione di tutto il corpo di RANKL potrebbero interrompere l’accoppiamento tra riassorbimento e formazione ossea e modificare la progressione dell’OS inibendo la trasduzione di RANKL su osteoblasti e su cellule OS che esprimono RANKL (Figura 2).

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