COVID-19: un farmaco antivirale usato per trattare il coronavirus del gatto dovrebbe essere efficace come trattamento per l’uomo

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I ricercatori dell’Università di Alberta si stanno preparando a lanciare sperimentazioni cliniche di un farmaco utilizzato per curare una malattia mortale causata da un coronavirus nei gatti che si aspettano sarà efficace anche come trattamento per gli esseri umani contro COVID-19 .

“In soli due mesi, i nostri risultati hanno dimostrato che il farmaco è efficace nell’inibire la replicazione virale nelle cellule con SARS-CoV-2 “, ha detto Joanne Lemieux, professore di biochimica presso la Facoltà di Medicina e Odontoiatria.

“È molto probabile che questo farmaco funzioni sugli esseri umani, quindi siamo incoraggiati dal fatto che sarà un trattamento antivirale efficace per i pazienti COVID-19”.

Il farmaco è un inibitore della proteasi che interferisce con la capacità del virus di replicarsi, ponendo fine a un’infezione. Le proteasi sono fondamentali per molte funzioni del corpo e sono obiettivi comuni per i farmaci per il trattamento di tutto, dall’ipertensione al cancro e all’HIV.

Studiato per la prima volta dal chimico John Vederas e dal biochimico Michael James dopo l’epidemia di sindrome respiratoria acuta grave (SARS) del 2003, l’inibitore della proteasi è stato ulteriormente sviluppato da ricercatori veterinari che hanno dimostrato che cura una malattia fatale nei gatti.

Il lavoro per testare il farmaco contro il coronavirus che causa il COVID-19 è stato uno sforzo cooperativo tra quattro laboratori U of A, gestiti da Lemieux, Vederas, dal professore di biochimica Howard Young e dal direttore fondatore del Li Ka Shing Institute of Virology, Lorne Tyrrell.

Alcuni degli esperimenti sono stati condotti dal programma Stanford Synchrotron Radiation Lightsource Structural Molecular Biology.

I loro risultati sono stati pubblicati oggi sulla rivista Nature Communications dopo essere stati pubblicati per la prima volta su BioRxIV, un sito web di ricerca.

“C’è una regola con la ricerca COVID che tutti i risultati devono essere resi pubblici immediatamente”, ha detto Lemieux, motivo per cui sono stati pubblicati prima di essere sottoposti a peer-review.

Ha detto che l’interesse per il lavoro è alto, con il documento che è stato consultato migliaia di volte non appena è stato pubblicato.

Lemieux ha spiegato che Vederas ha sintetizzato i composti e Tyrrell li ha testati contro il virus SARS-CoV-2 in provette e linee cellulari umane. I gruppi Young e Lemieux hanno poi rivelato la struttura cristallina del farmaco mentre si lega alla proteina.

“Abbiamo determinato la forma tridimensionale della proteasi con il farmaco nella tasca del sito attivo, mostrando il meccanismo di inibizione”, ha detto. “Questo ci consentirà di sviluppare farmaci ancora più efficaci”.

Lemieux ha detto che continuerà a testare le modifiche dell’inibitore per adattarlo ancora meglio al virus.

Ma ha detto che l’attuale farmaco mostra un’azione antivirale sufficiente contro SARS-CoV-2 per procedere immediatamente agli studi clinici.

“In genere, affinché un farmaco entri in studi clinici, deve essere confermato in laboratorio e quindi testato su modelli animali”, ha detto Lemieux. 

“Poiché questo farmaco è già stato utilizzato per trattare i gatti con coronavirus, ed è efficace con poca o nessuna tossicità, ha già superato quelle fasi e questo ci consente di andare avanti”.

“A causa dei forti dati che noi e altri abbiamo raccolto, stiamo portando avanti studi clinici per questo farmaco come antivirale per COVID-19″.

I ricercatori hanno stabilito una collaborazione con Anivive Life Sciences, una società di medicina veterinaria che sta sviluppando il farmaco per gatti, per produrre la qualità e la quantità di farmaco necessarie per gli studi clinici sull’uomo.

Lemieux ha affermato che sarà probabilmente testato in Alberta in combinazione con altri promettenti antivirali come il remdesivir, il primo trattamento approvato per l’uso condizionale in alcuni paesi, tra cui Stati Uniti e Canada.


L’epidemia di COVID-19 si è evoluta in una pandemia a causa della natura virulenta della SARS-CoV-2, raggiungendo oltre 3 milioni di casi in tutto il mondo entro la fine di aprile 2020, con il numero di infetti in rapida crescita in tutto il mondo 1 .

Questo scenario attuale contrasta l’epidemia di SARS meno virulenta nel 2002-03, che ha avuto solo 8000 casi e 774 decessi (OMS, 2004) 2 . C’è un urgente bisogno di terapie antivirali per le infezioni acute da COVID-19, soprattutto fino a quando non viene sviluppato un vaccino efficace.

La principale proteasi del coronavirus è un forte bersaglio farmacologico a causa della sua natura essenziale per la maturazione del virus e la successiva infezione 3 . I coronavirus sono virus a RNA che dirottano il meccanismo di traduzione dell’ospite per generare proteine ​​virali. L’RNA virale codifica per due poliproteine ​​sovrapposte: pp1a e pp1ab, rispettivamente di 450 kD e 750 kD.

Le poliproteine ​​devono essere scisse per rilasciare singole proteine ​​funzionali per la replicazione virale e la trascrizione. Le proteasi codificate virali includono la proteasi principale (M pro ), chiamata anche 3CL pro , e una proteasi simile alla papaina (PL pro ). M pro fende le poliproteine ​​in 11 posizioni principalmente a Leu Gln | Sequenze di Ser Ala Gly, che consentono l’assemblaggio del virus. Dato il suo ruolo cruciale nella replicazione del virus, il SARS-CoV-2 M pro è un importante bersaglio farmacologico per la terapia antivirale COVID-19.

Il coronavirus M pro è una proteasi cisteina per la quale esistono molte classi di inibitori differenti 4 . Gli inibitori della proteasi sono farmaci candidati comuni se soddisfano i requisiti di bassa tossicità, solubilità e reversibilità 5 . Diverse proteasi sono state identificate come bersagli molecolari e utilizzate per lo sviluppo di nuove classi di farmaci 5 compreso Tipranavir per il trattamento dell’HIV 6 .

Tuttavia, l’inibizione delle proteasi della cisteina da parte di specie reattive al tiolo è spesso insostenibile per i farmaci umani a meno che l’inibitore non sia reversibile. I farmaci accettori di Michael che sono irreversibili in vivo , come Rupintrivir, hanno fallito negli studi clinici a causa del basso

biodisponibilità 3 . Una reazione irreversibile indesiderata si verifica con numerosi tioli di mammiferi per distruggere l’inibitore. Anche la reazione con i tioli della proteina ospite potrebbe potenzialmente portare a tossicità acuta o reazione immunitaria.

A questo proposito, la reazione reversibile dei tioli con gli inibitori dell’aldeide per produrre emitioacetali rappresenta un’opportunità unica per un’efficace inibizione della proteasi della cisteina, poiché possono legarsi potenzialmente più efficacemente nel sito attivo della loro proteina bersaglio rispetto ad altri tioli 7 .

Gli addotti aldeidici bisolfiti solubili in acqua vengono preparati facilmente, in modo reversibile dall’aldeide madre in condizioni fisiologiche, e possono essere profarmaci ideali per l’inibizione della proteasi della cisteina come descritto di seguito.

Nei primi studi abbiamo sviluppato inibitori a base di peptidi, comprese le aldeidi, contro le proteasi virali della cisteina 7 che sono stati successivamente studiati con M pro durante l’epidemia di coronavirus SARS (SARS-CoV) nel 2003 8 .

Le aldeidi peptidiche ei loro derivati ​​bisolfitici sono stati successivamente utilizzati per inibire la proteasi principale del Coronavirus felino FCoV 9 . Il FCoV generalmente causa sintomi lievi, ma può portare a peritonite infettiva felina (FIP), che di solito è fatale nei gatti.

L’addotto bisolfito GC376, che si converte rapidamente in aldeide peptidica GC373, è stato ben tollerato e in grado di invertire l’infezione nei gatti 10 . Questo, insieme ad altri studi che includevano furetto e visone coronavirus M pro , ha dimostrato l’ampia specificità di questo inibitore della proteasi 11 .

Una struttura cristallina di GC376 è stata risolta con l’omologo MERS M pro e ha dimostrato un’interazione covalente con la cisteina catalitica di M pro 12 . Recentemente, strutture del M SARS-CoV-2 pro proteasi sono stati risolti con un ketoamide peptide basato inibitore 13 e vari farmaci riutilizzati come agenti anti-cancro 14 .

Tuttavia, questi inibitori M pro non sono stati testati su modelli animali di infezione da coronavirus né sono stati segnalati in studi sull’uomo o sugli animali per la SARS. Alcuni sono noti per avere gravi effetti collaterali e tossicità delle cellule umane, specialmente quelli che sono agenti antitumorali. In questo studio, esaminiamo se GC373 e GC376, stabiliti come farmaci efficaci nei gatti, inibiscono la SARS-CoV-2 M in modo pro reversibile e possono essere utilizzati come terapia antivirale negli esseri umani.

GC373 e GC376 inibiscono SARS-CoV-2 M pro

Abbiamo sintetizzato i composti dipeptidil chiave, l’aldeide GC373 e l’addotto bisolfito GC376 ( Figura 1A ) 9 ( Dati estesi , Figura S1 ), per verificare se questi inibitori della FIP sono efficaci nei confronti dell’M pro del SARS-CoV-2 e dell’M pro della SARS -CoV (associato all’epidemia del 2002).

Questo composto è costituito da un surrogato di glutammina nel substrato, posizione P1, un Leu in posizione P2 e anello benzenico in posizione P3, che riflette la specificità nota per SARS-CoV-2 M pro . Il SARS-CoV-2 M pro è stato clonato come fusione di tag SUMO, che ha consentito un’espressione ad alto rendimento, una maggiore stabilità e la generazione di N e C-terminali nativi ( dati estesi, Figura S2 e S3) .

Allo stesso modo, SARS-CoV M pro è stato espresso e purificato per ottenere N- e C-termini nativi secondo i metodi precedenti 8 . I parametri cinetici per SARS-CoV M pro e SARS-CoV-2-M pro sono stati determinati utilizzando un substrato FRET peptide sintetico con una coppia donatore-accettore di antranilato-nitrotirosina (Abz-SVTLQSG-Tyr NO2 R – Dati estesi, Figura S4 ) in quanto mostra una sensibilità 10 volte maggiore rispetto all’equivalente sistema EDANS-Dabcyl 15 .

Sia SARS-CoV-2 M pro che SARS-CoV M pro hanno mostrato un legame cooperativo al substrato del substrato FRET ( dati estesi, Figura S5 )

Le misurazioni di IC 50 hanno rivelato che sia GC373 che GC376 inibiscono SARS-CoV M pro

e SARS-CoV-2 M pro in vitro a concentrazioni nanomolari ( Figura 1B e C ). Per SARS-CoV-2 M pro , IC 50    per GC373 e GC376 sono 0,40 ± 0,05 mM e 0,19 ± 0,04 mM,

rispettivamente. Ciò è in accordo con gli studi su questi composti con M pro da virus correlati. Per FCoV M pro, IC 50 per GC376 era 0,04 ± 0,04 mM e per GC373 era 0,02 ± 0,01

mM 9 . Per SARS-CoV M pro abbiamo osservato un IC 50 migliorato , dimostrando l’ampia inibizione da parte di entrambi i composti, con GC373 e GC376 rispettivamente pari a 0,070 ± 0,02 mM e 0,05 ± 0,01 mM.

L’addotto bisolfito GC376 mostra una potenza leggermente superiore per entrambi gli enzimi rispetto all’aldeide libera. I nostri valori IC 50 in vitro per GC373 e GC376 riflettono uno stretto legame per SARS-CoV-2 M pro rispetto ad altri inibitori testati in vitro , ad esempio ebselen (IC 50

0,67 µM) 14 , tideglusib (IC 50 1,55 µM) 14 , carmofur (IC 50 1,82 µM) 14 , disulfiram (IC 50 9,35 µM) 14 , shikonin (IC 50 15,75 µM) 14 , PX-12 (IC 50 21,39 µM) 14 . Sia GC373 che GC376 sono anche più potenti degli inibitori della chetoamide recentemente segnalati (IC 50 del composto di piombo 0,67 µM) 13 .

Recentemente, un inibitore della peptidil correlato è stato riportato con una testata simile al nostro composto, ma con un gruppo indolo nella posizione P3 e un IC 50 di 0,05 ± 0,005 pM 16 . Tuttavia, tale composto non ha dimostrato di essere efficace negli animali, come nel caso di GC376.

Struttura cristallina di SARS-CoV-2 M pro in complesso con GC373 e GC376

Al fine di conoscere il meccanismo di inibizione, i M SARS-CoV-2 pro strutture cristalline con inibitori GC373 e GC376 sono stati determinati a 2,0 Angstrom ( Figura 2 e dati estesi, Tabella S1 ). La struttura tridimensionale del SARS-CoV-2 M pro (codice PDB 6WTM) è molto simile alle strutture risolte di recente con un RMSD di 0,38 Å 2 (codice PDB 6LU7) 13,14 .

SARS-CoV-2 M pro cristallizzato come un dimero facilitato da un dito N del protomero A (residui da 1 a 7) che si inserisce in una tasca nel protomero B. Ogni promotore mostrava una struttura a due lobi con un lobo composto da due- b-barili antiparalleli (domini I e II), che formano una piega di chimotripsina e peptidasi simile a 3C, con il sito attivo costituito da una diade Cys-144 e His-41 situata all’interfaccia del dominio.

Il foro oxyanion, influenzato dalla dimerizzazione 17 , è formato dai residui della catena principale Gly143, Ser144 e Cys145. Il dominio C-terminale III è coinvolto nello scambio di domini e facilita la formazione di dimeri 18 . La sostituzione molecolare con struttura 6Y7M.PDB ha rivelato la densità elettronica nella mappa Fo-Fc della cisteina catalitica per entrambi gli inibitori GC373 (codice PDB 6WTK) e GC376 (codice PDB 6WTJ).

In entrambe le strutture l’inibitore del peptidile è legato in modo covalente a Cys-145 come emitioacetale, dimostrando che, come previsto, il gruppo bisolfito lascia GC376 ( Dati estesi, Figura S6 ).

In contrasto con la struttura MERS M pro -GC376, la densità elettronica SARS-CoV-2 M pro indicava la formazione di un solo enantiomero per questo inibitore 12 . Una forte rete di legami idrogeno viene stabilita dalla catena laterale di His163 e dall’ammide della spina dorsale di His164 e Glu166, con i contributi della spina dorsale di Gly143, Ser144 e Cys145 che definiscono il foro dell’ossianione ( Figura 3 ).

Insieme, questo fornisce un forte legame e un basso IC 50 per l’inibitore. Il surrogato di glutammina nella posizione del substrato P1 interagisce con la catena laterale di His163, mentre il Leu in P2 si inserisce in una tasca idrofobica, rappresentando il sito secondario S2 dell’enzima.

Analogamente a quanto osservato nella struttura 12 MERS-M pro -GC376 , l’anello benzilico e il b-lattame del surrogato Gln formano un’interazione idrofobica sovrapposta, che stabilizza l’inibitore nel sito attivo della proteasi. Un attento esame del sito secondario per SARS-CoV-2 M pro rivela che le regioni consentono il futuro sviluppo di inibitori ( dati estesi, figura S6 ).

Per confermare la formazione di un hemithioacetal covalente come singolo enantiomero nel sito attivo, GC373 è stata preparata con 13 etichetta C (> 99%) al carbonio aldeide e miscelato in eccesso 7.8- piega con M pro proteasi da SARS-coper- 2 in tampone deuterato. L’analisi NMR HSQC (700 MHz) ha mostrato la comparsa di un singolo segnale di crosspeak (un solo isomero) per il carbonio emitioacetale a 76 ppm ( 13 ° C) e 5,65 ppm ( 1 ora ) in conformità con i precedenti rapporti di chemical shift per emitioacetali 7 ( dati estesi , Figura S7 ).

SARS-CoV-2 M pro ha una maggiore attività catalitica rispetto a SARS-CoV M pro

Una recente analisi strutturale dei cristalli ha riportato differenze nei residui che risiedono tra l’interfaccia dimero di SARS-CoV-2 M pro rispetto a SARS-CoV M pro13 . Precedenti studi di mutagenesi, che alteravano i residui all’interfaccia dimero di SARS-CoV M pro , hanno potenziato l’attività catalitica di 3,6 volte 19 .

In accordo con questo, la nostra analisi mostra che il tasso di turnover catalitico per SARS-CoV-2-M pro (135 ± 6 min -1 ) è quasi 5 volte più veloce di SARS-CoV M pro (30 ± 2 min -1 ) con il nostro substrato Abz-SVTLQSG-Tyr NO2 R ( Tabella 1 ). Con questo substrato FRET, dimostriamo una maggiore efficienza catalitica con SARS-CoV-2 M pro (1,8 ± 0,4 min -1 µM -1 ) rispetto a SARS-CoV M pro (0,6 ± 0,2 min -1 µM -1 ).

Questo risultato è in contrasto con i rapporti recenti in cui non sono state osservate differenze nell’efficienza catalitica tra SARS-CoV M pro e SARS-CoV-2 M pro utilizzando un substrato diverso: 3011 ± 294 s -1 M -1 (0,18 ± 0,02 min -1 µM -1 ) e 3426 ± 416,9 s -1 M -1 (0,2 ± 0,03 min -1 µM -1 ), rispettivamente) 13 . Resta da determinare se questo influenza la virulenza di SARS-CoV-2.

GC373 e GC376 sono potenti inibitori di SARS-CoV-2 nella coltura cellulare

Per testare la capacità di GC373 e GC376 di inibire SARS-CoV-2, sono stati eseguiti saggi di riduzione della placca su cellule Vero E6 infette in assenza o in presenza di concentrazioni crescenti di GC373 ( Figura 4A ) o GC376 ( Figura 4B ) per 48 ore. I risultati sono stati tracciati come inibizione percentuale del numero di unità formanti placca per pozzetto. L’EC 50 per GC373 era 1,5

mM mentre l’EC 50 per GC376 era 0,92 mM. Per esaminare la citotossicità cellulare, la produzione di ATP è stata misurata utilizzando il test CellTiter-Glo su cellule Vero E6 o cellule A549 incubate in presenza degli inibitori per 24 ore. I CC 50 di entrambi GC373 e GC376 erano maggiori di 200 mM. Per esaminare ulteriormente le loro attività antivirali, è stata eseguita la RT-PCR quantitativa

supernatanti da cellule non trattate e colture cellulari trattate con GC373 ( Figura 4C ) o GC376 ( Figura 4D ). È stato osservato che sia GC373 che GC376 sono potenti inibitori dei titoli virali decrescenti di SARS-CoV-2 3 log, rispetto a una diminuzione di 2 log nei risultati pubblicati di recente utilizzando altri composti aldeidici 16 . Questi risultati indicano che sia GC373 che GC376 sono potenti inibitori di SARS-CoV-2 con un indice terapeutico> 200.

Numerosi farmaci sono stati originariamente progettati per inibire SARS-CoV M pro 3 . Tuttavia, l’epidemia di SARS del 2002 è stata controllata da misure di salute pubblica e questi composti non sono mai stati autorizzati. GC376 è stato utilizzato per curare la FIP nei gatti poiché l’M pro della FIP è efficacemente inibito dal suo prodotto di degradazione GC373.

Gli analoghi di questi farmaci hanno anche inibito il MERS CoV M pro e bloccato la replicazione virale nelle cellule con una EC 50 di 0,5 µM 12 . I nostri studi dimostrano che GC376 e GC373 sono inibitori efficaci di SARS-CoV-2 M pro . Chiaramente questi farmaci devono essere introdotti rapidamente nelle sperimentazioni umane per COVID-19. SARS-CoV-2 è la causa di COVID-19 ed è un virus con un tasso di mutazione significativo 20 .

Inoltre, in alcuni pazienti il ​​virus è persistito per più di 2 mesi con qualche possibilità di reinfezione 21 . I vaccini sono di fondamentale importanza, ma probabilmente ancora tra un anno o più poiché questo virus presenterà probabilmente sfide vaccinali.

Ci sono molti studi clinici che testano farmaci riproposti dalle loro indicazioni originali. Remdesivir, un inibitore della polimerasi sviluppato come trattamento per il virus Ebola 22, sta mostrando risultati iniziali molto promettenti e sarà probabilmente confermato negli studi clinici 23 . Un altro farmaco progettato per inibire la RNA polimerasi RNA dipendente, incluso nei coronavirus, è l’EIDD 2801 (un N4-idrossicitidina trifosfato che è incorporato nell’RNA virale per promuovere errori nell’RNA della progenie).

Questi esempi di antivirali ad azione diretta (DAA) per COVID-19 sono di fondamentale importanza 24 . Entrambi i composti GC373 e GC376 sono anche DAA progettati specificamente per i coronavirus. È probabile che per il trattamento della SARS-CoV-2 siano necessari diversi farmaci molto potenti

e per prevenire l’evoluzione della resistenza potrebbe essere necessario utilizzarli in combinazione. Riteniamo che GC373 e GC376 siano antivirali candidati che dovrebbero essere accelerati negli studi clinici per COVID-19.

  ProteasiK0.5 (µM)kcat (min-1)kcat /K0.5 (min-1µM-1)  Coefficiente di collina
  SARS-CoV-2 Mpro70±10135±61.8±0.42.2
  SARS-CoV Mpro  52±17  30±2  0.6±0.2  1.9

Tabella 1. Parametri catalitiche di SARS-CoV e SARC-CoV-2 M PRO mediati scissione di un substrato peptidico FRET. I parametri catalitici sono stati determinati per SARS-CoV Mpro e SARS-CoV-2 Mpro con il substrato Abz-SVTLQSG-Y (NO2) -R. Gli esperimenti sono stati condotti in duplicato con un N = 3. I valori sono rappresentati come media ± SEM.

Proteine ​​/ legantiSARS-CoV-2 MproSARS-CoV2 Mpro-GC373SARS-CoV2 Mpro-GC376
Voce PDB6WTM6WTK6WTJ
Statistiche di raccolta dati   
Sorgente di raggi X.SSRL 12-2SSRL 12-2SSRL 12-2
Lunghezza d’onda [Å]0.979460.979460.97946
Vm [Å3/Da]2.01.972.04
Contenuto di solventi [%]38.5637.4539.64
Gruppo spazialeP2 1C2C2
Dimensioni della cella unitaria a, b, c (Å) α, β, γ (°)  44.84 53.60 114.80 90 101.20 90.  113.35 53.03 45.23 90 102.033 90  114.90 53.81 45.50 90 101.70 90
Intervallo di risoluzione [Å]3849-1.85 (1.89-1.85)34.04-2.0 (2.09-2.03)34.36-1.9 (1.95-1.90)
Numero di osservazioni a304078 (21067)115236 (7722)141537 (9860)
Numero di unici riflessi88303 (6137)34459 (2488)41270 (2925)
Completezza [ a97.8 (92.2)96.0 (89.7)97.9 (93.4)
Media I / σ (I)6.42 (1.0)5.60 (1.0)7.18 (1.0)
R-misure%15.116.211.8
CC1 / 2 a99.6 (24)99.2(25)99.6 (25)
Statistiche di affinamento   
Numero di unici riflessi usati per la raffinatezza880303362241326
lavoro / R gratis [%]20.80/25.1820.13/25.9920.67/25.47
rmsd in lunghezze di legame [Å] angolo di legame (°)0.008/1.0340.009/1.0740.009/1.113
Clashscore5.9411.88.8
Numero di atomi di proteine476123672386
Numero di atomi di ligandoN / A2929
Numero di acqua molecole2903458
Trama di Ramachandran   
Regioni preferite [%]95.0197.7095.68
Regioni consentite [%]4.491.323.32
Regioni anomale [%]0.500.991.33

Tabella S1. Dati di diffrazione e statistiche di raffinamento del modello

un Raccoglitore ad alta risoluzione tra parentesi

mis = Σ hkl [N / (N-1)] 1/2 ∑ i | Io i , (hkl) – I (hkl) | / Σ hkl Σ i Ii (hkl)

c R-lavoro = Σ (| Fo | – k | Fc |) / Σ | Fo |

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Ulteriori informazioni:  Wayne Vuong et al, Feline coronavirus drug inibisce la proteasi principale di SARS-CoV-2 e blocca la replicazione del virus,  Nature Communications  (2020). DOI: 10.1038 / s41467-020-18096-2

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