Prelevando campioni giornalieri dall’impianto di trattamento delle acque reflue dell’area di New Haven, i ricercatori sono stati in grado di monitorare la progressione del COVID-19 fino a sette giorni prima che lo stesso modello fosse riportato dai dati di test compilati dall’area metropolitana di New Haven.
Dal 19 marzo, il team di ricerca ha raccolto campioni dall’impianto di trattamento delle acque reflue che serve New Haven, East Haven, Hamden e parti di Woodbridge, CT.
La curva della progressione osservata nei campioni ha una forma simile al numero di casi confermati riportati dai test, ma le concentrazioni di SARS-CoV-2 guidano il test di circa una settimana. I risultati del progetto in corso sono stati pubblicati online il 18 settembre su Nature Biotechnology.
“Se prendi la nostra curva levigata per SARS-CoV-2 RNA nei fanghi di depurazione e la sovrapponi alle curve levigate dei test, le tendenze sono molto simili, ma siamo da cinque a sette giorni in anticipo”, ha detto Jordan Peccia, il Thomas E. Golden, Jr. Professore di Ingegneria Chimica e Ambientale.
“Quindi non solo possiamo utilizzare la curva del virus dei fanghi di depurazione per eseguire alcune forme di epidemiologia, ma è anche un indicatore significativo”.
Oltre a Peccia, il team comprende i ricercatori di Yale Saad Omer, direttore dello Yale Institute for Global Health; Edward Kaplan, professore di sanità pubblica; e Albert Ko, presidente del dipartimento e professore di epidemiologia.
Il progetto coinvolge anche la Connecticut Agricultural Experiment Station (CAES). Lì, lo scienziato Doug Brackney analizza i campioni di fango per rilevare e quantificare l’ RNA virale SARS CoV-2.
“Questo lavoro è un eccellente esempio di una collaborazione multidisciplinare tra università e partner di ricerca del governo statale per affrontare un problema critico di salute pubblica”, ha affermato il direttore del CAES Jason C. White.
La progressione di COVID-19 in una comunità viene tipicamente monitorata testando casi sintomatici e valutando il numero di test positivi.
Tuttavia, possono essere necessari fino a cinque giorni prima che i sintomi emergano in qualcuno che è infetto e contagioso, quindi il rilevamento precoce del virus in una comunità potrebbe essere fondamentale per rallentarne la diffusione.
I risultati dello studio provengono dal periodo di 10 settimane dal 19 marzo al 1 giugno.
I ricercatori, tuttavia, continueranno a prelevare campioni durante l’autunno, quindi se c’è un aumento nei casi, si aspettano che i campioni di acque reflue lo dimostrino, forse ben prima che questi nuovi casi vengano diagnosticati.
Nello specifico, i ricercatori stanno raccogliendo campioni di fanghi primari, creati quando i solidi nelle acque reflue grezze comunali si depositano per la prima volta negli impianti di trattamento.
Peccia ha detto che il fango è particolarmente utile per i loro scopi perché fornisce un campione altamente concentrato e ben miscelato e ha dimostrato di contenere una vasta gamma di virus umani.
Omer ha osservato che il metodo ha importanti implicazioni per i paesi a basso reddito con lacune significative nei test e può aiutare a prendere decisioni sull’opportunità di riaprire parti di una particolare città o regione.
È un metodo poco costoso e molto simile a quello utilizzato in molti paesi a basso reddito per testare la polio nelle comunità, il che renderebbe l’adozione del metodo del team di ricerca relativamente facile.
La Banca mondiale ha espresso interesse a pilotare il programma molto presto in alcune città dell’Asia meridionale per vedere come si adatta a popolazioni più grandi.
“Una volta sperimentato con successo, può diventare un’opzione politica per molti altri posti”, ha detto.
Omer descrive la collaborazione come una “perfetta confluenza di competenze complementari, esperienza e visione per vedere che ciò potrebbe avere implicazioni piuttosto sostanziali”.
“Ci sono poche istituzioni al mondo in cui questa storia potrebbe accadere, perché ha bisogno di diversi ingredienti”, ha detto Omer. “Ha bisogno dell’ampiezza delle competenze, di una cultura della disponibilità a lavorare insieme e della dedizione per dire ‘Questo è importante'”.
Epidemiologia basata sulle acque reflue: un litro di acque reflue, un oceano di informazioni
Nel quadro della pandemia COVID-19, lo sviluppo di un sistema di allerta precoce e di sorveglianza attraverso l’utilizzo di un approccio di epidemiologia basata sulle acque reflue (WBE) mira ad affrontare importanti questioni di salute pubblica della comunità che sorgono a causa del COVID-19 o di qualsiasi altra futura pandemia, a cui è possibile rispondere attraverso l’indagine e la sorveglianza di indicatori selezionati di salute e comportamento della comunità, riflessi nella composizione delle acque reflue urbane.
Poiché le acque reflue di un’area vengono raccolte in un impianto di trattamento delle acque reflue urbane (UWTP), il campionamento e l’analisi della composizione delle acque reflue possono rivelare la presenza dell’impronta genetica SARS-CoV-2 nelle acque reflue. Dato che sono fornite informazioni sufficienti sulla popolazione servita dall’impianto di trattamento, l’impronta digitale può essere attribuita ad esso, fornendo uno spaccato dello stato di salute pubblica della società.
Attualmente, gli interventi di sanità pubblica vengono avviati in modo ampio; potenzialmente non considerando le comunità che ne trarrebbero vantaggio e le aree gravose in cui il virus potrebbe attualmente non rappresentare un rischio, rendendo così le misure di contenimento che inducono disagio economicamente e socialmente dirompenti. I test diagnostici clinici attualmente utilizzati per COVID-19 si sono già dimostrati insufficienti per un monitoraggio rapido ed economico dell’incidenza del virus a livello di comunità [1].
Un altro problema riguarda l’elevata domanda mondiale di materiali di consumo (es. Tamponi, reagenti) necessari per la raccolta e lo screening di campioni per COVID-19. Dal punto di vista sociale, ci sono stati casi che hanno rivelato che le persone di una comunità erano scettiche a sostenere il test clinico COVID-19 a causa della paura dello stigma sociale associato alla pandemia.
Con limitazioni sui test COVID-19 che rendono difficile sapere quante persone hanno effettivamente la malattia, rivolgersi ai sistemi fognari per un’istantanea veloce sembra essere promettente e un metodo utile per fornire informazioni complementari e aggiuntive ai test clinici.
La firma fecale di SARS-CoV-2 potrebbe effettivamente rivelarsi molto utile, aiutando a monitorare come e dove la malattia si sta diffondendo tra la popolazione.
La WBE è stata utilizzata per decenni per rilevare la poliomielite in paesi come il Brasile e Israele, dove la malattia rimane endemica. Il sistema israeliano di sorveglianza delle acque reflue, istituito nel 1989 dalle autorità sanitarie israeliane per rilevare il poliovirus nelle acque reflue, ha consentito di rintracciare la poliomielite nelle linee fognarie e negli UWTP durante il riemergere della poliomielite nel 2013, e la risposta delle autorità pubbliche all’epidemia è stata immediata [2].
Più recentemente, sono stati compiuti sforzi per istituire un sistema di sorveglianza per altri virus attraverso le acque reflue, come il virus Zika, il cui focolaio su larga scala è stato segnalato nelle Americhe, seguito da 87 paesi in tutto il mondo nel 2015, quando il Brasile ha confermato per la prima volta un romanzo febbrile epidemia di malattia all’OMS e il virus è emerso come causa di gravi difetti alla nascita della microcefalia e del disturbo neurologico della sindrome di Guillain-Barré [3].
Le acque reflue sono una fonte di informazioni sulla salute e le abitudini umane e possono essere trasformate in un osservatorio di salute pubblica e utilizzate come strumento per affinare la risposta della salute pubblica a una pandemia causata da un agente patogeno. Le autorità sanitarie pubbliche potrebbero utilizzare queste informazioni per affinare la loro risposta e per aiutarle a valutare quando e come iniziare ad aumentare o retrocedere politiche e raccomandazioni in stile quarantena.
Tra i vari metodi di valutazione e sorveglianza della salute pubblica e delle malattie infettive, la WBE offre vantaggi significativi per affrontare gli ostacoli affrontati da altre tecniche comunemente applicate, come la fornitura affidabile di tendenze spazio-temporali nel comportamento umano e nelle infezioni, quasi in tempo reale e in tutto dati sulla popolazione, comprese le persone asintomatiche e quelle con sintomi lievi simili ad altre comuni infezioni virali e costo relativamente basso.
Un punto critico in relazione all’applicazione del programma di monitoraggio WBE è la conduzione del campionamento dalla rete fognaria in quartieri specifici. I sistemi fognari offrono dati sull’epidemia quasi in tempo reale, perché ricevono continuamente escrementi umani che contengono particelle virali rilasciate da esseri umani infetti, indipendentemente dal loro stato sintomatologico (sintomatico; asintomatico [nessun sintomo]; paucisintomatico o subclinico [sintomi lievi]; e presintomatico [nessun sintomo per i primi giorni prima di mostrare i sintomi COVID-19]).
Inoltre, è interessante notare che durante i viaggi aerei e le crociere, il monitoraggio delle acque reflue può fornire ai funzionari della sanità pubblica uno strumento aggiuntivo per valutare la prevalenza delle infezioni da SARS-CoV-2 tra i passeggeri che utilizzano le strutture di bordo, che possono essere diffuse in questo modo a livello internazionale [4 ]. Ciò è importante anche in relazione al fatto che almeno un paziente COVID-19 è risultato positivo dopo l’esame del campione fecale, nonostante fosse negativo dopo l’analisi della faringe e dell’espettorato [5].
In questo modo, si prevede che i campioni raccolti sia dalle linee fognarie che dagli impianti di trattamento delle acque reflue consentiranno di rintracciare i focolai virali in una posizione più accurata rendendo possibile l’identificazione delle aree urbane di interesse. Inoltre, si prevede che la diffusione e il destino del virus possano variare tra gli impianti di trattamento delle acque reflue negli ambienti urbani, che utilizzano condotte fognarie sotterranee chiuse e le aree rurali, che utilizzano fosse settiche e bacini idrografici.
La WBE può anche consentire il monitoraggio della circolazione silenziosa del virus grazie alla rilevazione di bassi livelli di RNA virale prima che compaiano i casi. 6, che ha valutato l’impatto del blocco sulle dinamiche di SARS-CoV-2 tramite la quantificazione dell’RNA virale nelle acque reflue, ha rivelato che le unità del genoma erano diminuite contemporaneamente insieme alla quantità dei casi COVID-19 registrati come risultato del misure di blocco.
Inoltre, 7 hanno mostrato l’incidenza della SARS-CoV-2 nelle acque reflue da novembre 2019, prima della registrazione dei primi casi sintomatici di COVID-19 a Santa Catalina, in Brasile. Questa scoperta suggerisce la diffusione del virus da persone paucisintomatiche e asintomatiche nella comunità, mesi prima della segnalazione dei primi casi da parte delle autorità nazionali ([7] [preprint]).
Una caratteristica importante di WBE si basa sul fatto che può rilevare variazioni nei ceppi virali tramite analisi filogenetica, fornendo un vantaggio sostanziale per il riconoscimento di alberi di virus che si sono evoluti nel tempo e tra varie regioni. Nel caso di SARS-CoV-2, sono disponibili solo due studi sull’analisi filogenetica di campioni di acque reflue.
Secondo Nemudryi et al. 8 , i ceppi più diffusi di SARS-CoV-2 rilevati nelle acque reflue di Bozeman, Montana, erano associati a quelli precedentemente osservati in Europa (Francia e Islanda). Il sequenziamento del genoma e l’analisi filogenetica effettuate da 9, hanno rivelato somiglianze tra i ceppi virali isolati con quelli trovati in Europa e nella regione Lombardia nel nord Italia.
La WBE può anche monitorare le fluttuazioni stagionali nelle concentrazioni virali nelle acque reflue, riflettendo i modelli epidemiologici in una comunità. Ad oggi, non ci sono informazioni sull’effetto della stagione sulla concentrazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue, mentre tali informazioni potrebbero essere disponibili se si considerano precedenti analisi rilevanti eseguite per altri virus.
Ad esempio, Nordgren et al. [10] hanno riportato variazioni stagionali dei norovirus (NoV GGI e NoV GGII), con la più alta concentrazione di questi virus registrata rispettivamente durante l’inverno e l’estate.
Inoltre, NoV GGII ha mostrato picchi stagionali più elevati rispetto a NoV GGI. L’aumento del NoV GGI durante l’estate, che è una “bassa stagione” per la gastroenterite causata da norovirus clinicamente segnalata, ha lasciato il posto a infezioni più lievi o asintomatiche rispetto ai ceppi NoV GGII in circolazione durante l’inverno.
Un altro studio condotto da Li et al. [11] in Cina, ha dimostrato che i livelli di concentrazione di rotavirus erano più alti da novembre a marzo, corrispondenti ai dati clinici del virus riportati nel paese [12].
Secondo quanto riferito, la concentrazione di norovirus nelle acque reflue è stata più elevata da novembre ad aprile [13], mentre le concentrazioni di adenovirus ed enterovirus sono state sostanzialmente costanti durante tutto l’anno. Poiché esiste una correlazione tra la diffusione del COVID-19 e la temperatura [14], si prevede che nelle acque reflue si verifichino anche variazioni stagionali del materiale genetico virale, con livelli di rilevamento più elevati nelle posizioni che rientrano nelle zone climaticamente favorite (4-12 ° C).
Dato che SARS-CoV-2 è un nuovo ceppo di coronavirus che non era stato precedentemente identificato negli escrementi umani (e quindi nelle acque reflue), la ricerca nel campo della WBE è agli inizi e la posizione della comunità scientifica non è ancora chiara, soprattutto quando si considera l’istituzione e la convalida di una metodologia per l’isolamento, il rilevamento e la quantificazione del materiale genetico virale nelle acque reflue.
Principali considerazioni relative allo sviluppo di un protocollo metodologico per il rilevamento e la quantificazione dell’RNA di SARS-CoV-2 nelle acque reflue
La potenziale trasmissione per via fecale-orale è stata recentemente sottolineata da Foladori et al. [15], a causa del rilevamento di SARS-CoV-2 nel tratto gastrointestinale umano. Inoltre, la potenziale trasmissione attraverso i bioaerosol dalle feci attraverso lo sciacquone è stata dimostrata a Hong Kong per il cluster epidemico di SARS-CoV ad Amoy Gardens [16,17] ed è stata recentemente proposta per SARS-CoV-2 [18].
Durante questa epidemia, è stato suggerito che la SARS-CoV versata nelle feci di un visitatore di un edificio infetto abbia diffuso il virus ad altri abitanti dell’edificio tramite goccioline e aerosol di acqua da toilette contaminata da virus, che è stata trasmessa a più appartamenti attraverso tubature difettose dei servizi igienici e scarichi a pavimento [19]. Questo scenario di epidemia propone che le acque reflue delle persone infette possano essere un mezzo di trasmissione del virus infettivo nelle feci.
Di conseguenza, si può dedurre che la via gocciolina fecale-respiratoria è potenzialmente possibile. Tuttavia, diversi aspetti richiedono un’indagine più approfondita, come la vitalità e l’infettività del virus nelle feci e nelle acque reflue urbane. Se SARS-CoV-2 è in grado di sopravvivere per lunghi periodi di tempo nelle feci e nelle acque reflue, l’esposizione e la trasmissione tramite goccioline d’acqua e aerosol contaminati dalle feci possono essere più probabili.
Per valutare in modo più efficace i rischi posti da questo percorso di esposizione, sono necessari più dati sulla sopravvivenza e la persistenza del virus nelle acque reflue, in combinazione con prove sulla sopravvivenza del virus all’interno del sistema gastrointestinale e degli escrementi umani. Rimoldi et al. ([9] [preprint]) hanno riportato l’esame del virus infettivo in influenti ed effluenti UWTP, così come in due fiumi, senza campioni positivi per SARS-CoV-2 infettiva. Tuttavia, questo studio ha utilizzato un piccolo volume di acque reflue (2 mL) e nessun controllo positivo del test.
Di conseguenza, risultati negativi di infettività non significano necessariamente l’assenza del virus infettivo, poiché la mancanza di adeguate misure di controllo della qualità e altre considerazioni metodologiche possono complicare la determinazione del virus infettivo nelle acque reflue [20].
Inoltre, poiché lavorare con questo tipo di virus infettivo richiede personale specificamente addestrato che lavora nel contenimento del laboratorio di livello di sicurezza biologica 3 (BSL-3), ci sono sfide analitiche sostanziali coinvolte nello studio della sopravvivenza del virus, mentre le informazioni attualmente disponibili sono ancora limitate [15 ].
A tal fine, anche se sono necessarie maggiori informazioni sugli esatti aspetti della trasmissione del virus vivo attraverso le feci attraverso la via orale-fecale e della sua infettività nelle acque reflue, la presenza di SARS-CoV-2 RNA nelle acque reflue è stata descritta in tutto il mondo; nei Paesi Bassi ([21] [prestampa]; [38]), Italia ([[22], [23]]; [24] [prestampa]; [9] [prestampa]), Francia ([25] [prestampa ]; [6] [prestampa]), Spagna [26], Israele ([27] [prestampa]), Turchia ([28] [prestampa]), USA ([29] [prestampa]; [8] [prestampa] ; [30]; [31] [prestampa]), India ([32] [prestampa]), Giappone ([33] [prestampa]), Brasile ([7] [prestampa]) e Australia [4,34,35 ].
Gli studi qui recensiti, dedicati alla rilevazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue urbane, sono stati pubblicati tra il 30 marzo 2020 e il 15 luglio 2020, e la maggior parte di essi non è stata certificata da formale revisione paritaria. Più specificamente, al momento della preparazione di questa recensione, tredici (13) dei venti (20) studi sono stati pubblicati in letteratura come preprints ([27] [preprint]; [7] [preprint]; [29] [preprint ]; [33] [prestampa]; [28] [prestampa]; [32] [prestampa]; [21] [prestampa]; [8] [prestampa]; [9] [prestampa]; [25] [prestampa] ; [31] [prestampa]; [6] [prestampa]; [24] [prestampa]). È chiaro che c’è un maggiore impegno scientifico e pubblico con i preprint COVID-19.
Anche se esiste la possibilità che alcuni non verranno pubblicati, la presente revisione discute esclusivamente gli aspetti metodologici dell’analisi delle acque reflue riportate in essi, che molto probabilmente non saranno influenzati dal processo di revisione tra pari. Quindi, anche se alcuni potrebbero non apparire in letteratura come manoscritti sottoposti a revisione paritaria, gli aspetti per la considerazione metodologica riportati da questo documento di revisione saranno comunque rilevanti.
Le informazioni complementari relative all’ubicazione, agli UWTP e agli equivalenti abitanti / popolazione corrispondenti, il tipo di campione, la conservazione e il trasferimento del campione al laboratorio, il pretrattamento e la concentrazione del campione, l’estrazione, il rilevamento e la quantificazione dell’RNA sono presentati nella Tabella 1, Tabella 3,, 55 e e 6 .6.
Inoltre, poiché esiste una letteratura limitata sulla rilevazione dell’RNA di SARS-CoV-2 nelle acque reflue e considerando che il virus SARS-CoV-2 può comportarsi in modo simile ad altri coronavirus, è stato fatto uno sforzo per fornire informazioni sui coronavirus precedentemente identificati che può essere rilevante per i risultati definiti da ogni studio.
Gli studi riguardanti la prevalenza di SARS-CoV-2 nei fanghi di depurazione ([36,37] [preprint]) non sono stati inclusi nelle tabelle ma i loro principali risultati sono discussi nel manoscritto. Particolare enfasi è stata data ai principali parametri, processi e sfide associati all’efficienza e alla credibilità di ciascun protocollo metodologico applicato per l’isolamento, il rilevamento e la quantificazione (ove disponibile) dell’RNA del virus nelle acque reflue.
Tabella 1
Informazioni sul campionamento, condizioni di conservazione / trasporto e pretrattamento del campione utilizzato per la rilevazione dell’RNA SARS-CoV-2 nelle acque reflue.
| Riferimento I documenti contrassegnati da un asterisco (*) non sono stati certificati da peer review (preprints) | Posizione data in ordine alfabetico | Informazioni su UWTP (abitanti / equivalenti di popolazione, trattamento, ecc.) | Date di campionamento | Tipo di campione | Tipo di contenitore di campionamento | Congelamento e trasferimento dei campioni | Condizioni di conservazione in laboratorio | Giorni all’analisi | Trattamento termico del campione |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| [34] | Australia | Stazione di pompaggio suburbana e 2 UWTP di bacini urbani nel Queensland sud-orientale | Marzo-aprile 2020 | raccolta di acque reflue non trattate (campioni prelevati) utilizzando un autocampionatore refrigerato convenzionale o un autocampionatore sommergibile ad alta frequenza | non riportato | trasferimento su ghiaccio | conservazione a 4 ° C | non riportato | × |
| [35] | Australia | UWTP a Brisbane, Australia (PE = 325000) acque reflue urbane e industriali; trattamento primario, CAS e disinfezione con cloro e UV | non riportato | 2 L di acque reflue non trattate | non riportato | trasferimento su ghiaccio | conservazione a 4 ° C | 24 h | × |
| [4] | Australia | Nave da crociera e 3 velivoli | Nave da crociera: 23/4/2020 Aerei: 1) 26/4/2020 (117 passeggeri) 2) 7/5/2020 (19 passeggeri) 3) 10/5/2020 (185 passeggeri) | Nave da crociera: due campioni prelevati dall’influente e dall’effluente dell’MBR della nave Aerei: tre campioni delle acque reflue da ciascun aereo | non riportato | Manutenzione a 4 ° C per il trasporto | Manutenzione a 4 ° C per il trasporto | 6-24 ore | × |
| [7]* | Brasile | UWTP a Florianopolis, Santa Catalina, Brasile (che serve 5000 abitanti) Acque reflue grezze | 30 ° mese di ottobre 2019-4 ° di Marzo 2020 | 200 mL di acque reflue urbane | non riportato | non riportato | conservazione a 80 ° C | non riportato | × |
| [25]* | Francia | Acque reflue influenti di UWTP nell’area metropolitana di Montpellier a Lattes | Può 7 ° , 18 ° , 26 ° e giugno 4 ° , 15 ° e 25 ° 2020 | Campioni compositi | non riportato | Manutenzione a 4 ° C per il trasporto | Centrifugazione a 4500xg per 30 min a 4 ° C e setacciatura del surnatante attraverso un filtro Corning da 40 μm seguita da conservazione a -20 ° C | I campioni sono stati processati immediatamente all’arrivo in laboratorio | × |
| [6]* | Francia | 3 UWTP (> 100000 IE) a Parigi | 5 ° marzo 2020 (inizio dell’epidemia) – 23 ° aprile 2020. | non disponibile | non riportato | non riportato | conservazione a 4 ° C | I campioni sono stati elaborati in meno di 24 ore dopo il campionamento | × |
| [32]* | India | UWTP ad Ahmedabad, Gujarat (10 6 milioni di L / giorno) Coperta di fanghi anaerobici a flusso ascendente (UASB); riceve le acque reflue da un ospedale governativo che cura i pazienti COVID-19 | 8 ° e il 27 ° di maggio, 2020 | effluenti influenti e trattati (dopo UASB e stagno di aerazione) | bottiglie sterilizzate | trasferimento su ghiaccio | refrigerazione dei campioni prelevati l’8 ° di maggio a 4 ° C fino al 27 ° di maggio, quando il prossimo lotto di campioni sono stati trasportati al laboratorio e analizzato subito | non riportato | × |
| [27]* | Israele | 11 UWTP a Haifa, Shafdan, Rahat, Arara, Beer Sheva, Ayalon, Zfat, El Hamra, Kidron, Sorek, Og | 10 ° marzo, 25 th March, 30 th March, 3 rd aprile 5 ° aprile 13 ° aprile 15 ° aprile 16 th aprile 21 ° aprile 2020 | raccolta di 200 mL di campione ogni 30 min per 24 ore | non riportato | trasferimento di 6-10 L di campione al laboratorio, con trasferimento di 2 L di campioni in bottiglie di plastica pulite | stoccaggio a -20 ° C o − 80 ° C. | non riportato | × |
| [22] | Italy | 3 UWTP a Milano (Stabilimento A e B; PE = 1.050.000) e Roma (Stabilimento C1 e C2; PE = 900.000) | 3 ° di febbraio – 2 ° di aprile, 2020 | Campioni compositi di acque reflue grezze 24 ore su 24 | non riportato | non riportato | conservazione a -20 ° C | non riportato | √ 56 ° C, 30 min |
| [24]* | Italy | 5 UWTP a Milano (Stabilimenti A e B; PE = 1116928 e 750863, rispettivamente), Torino (Stabilimenti C e D; PE = 2297000 e 180000, rispettivamente) e Bologna (Stabilimenti E; PE = 653809) | 9 ° ottobre 2019-28 ° di febbraio 2020 | Campioni compositi di acque reflue grezze 24 ore su 24 | non riportato | conservazione a -20 ° C | non riportato | √ 56 ° C, 30 min | |
| [9]* | Italy | 3 UWTP (UWTP-A a Monza / Brianza; UWTP-B e C a Milano); flusso = 11 m 3 / s, IE = 2 milioni di trattamento secondario; disinfezione terziaria mediante acido peracetico o disinfezione UV ad alta intensità. Smaltimento UWTP-A e UWTP-B nel fiume Lambro e UWTP-C nel fiume Lambro Meridionale | 14 ° e 22 ° aprile 2020 | raccogliere campioni di acque reflue e di fiume (alle 13:00) | bottiglie in polipropilene per acque reflue, bottiglie in vetro scuro per acque di fiume | trasferimento di campioni in frigorifero | non riportato | non riportato | × |
| [33]* | Giappone | UWTP e fiume nella prefettura di Yamanashi CAS | 17 ° di marzo-7 ° di maggio, 2020 | raccolta di campioni da acque reflue influenti e trattate secondariamente prima della clorazione e campioni di acqua di fiume | Bottiglie di plastica sterilizzate da 1 litro | trasferimento su ghiaccio | non riportato | 6 ore dopo il campionamento | × |
| [26] | Spagna | 6 UWTP a Murcia (PE = 530499; CAS, disinfezione [NaClO]), Cartagena (PE = 163969; CAS, disinfezione), Molina de Segura (PE = 150545; CAS, coagulazione, flocculazione, filtrazione a sabbia, disinfezione [UV, NaClO ]), Lorca (PE = 101161; CAS, coagulazione, flocculazione, filtrazione a sabbia, disinfezione [UV, NaOCl]), Cieza (PE = 69502; CAS, coagulazione, flocculazione, filtrazione a sabbia, disinfezione [UV]), Totana (PE = 28289; CAS, disinfezione [UV]) | 12 ° marzo – 14 ° aprile 2020 | prelevare campioni (alle 7-12 am) 42 campioni di effluenti trattati con influenze, 18 secondarie e 12 terziarie | Contenitori in plastica HDPE | trasferimento di campioni su ghiaccio al laboratorio. | conservazione a 4 ° C | 24 h | × |
| [21]* [38] | Paesi Bassi | UWTP ad Amsterdam (IE = 1014000), L’Aia, Utrecht (IE = 530000), Apeldoorn (IE = 350000), Amersfoort (IE = 335000), Tilburg (IE = 375000), aeroporto di Schiphol (IE = 54000) | 5 ° , 6 ° e il 7 ° di febbraio 2020 (3 settimane prima della prima segnalata COVID-19 caso nei Paesi Bassi), 4 ° e 5 ° marzo 2020 (38 e 82 ha riferito COVID-19 casi, risp.), 15 ° , 16 ° e 25 ° di marzo 2020 (1135, 1413, e 6412 hanno riportato COVID-19 casi, resp.) | Campione di acque reflue composito dipendente dal flusso 24 ore (250 mL) | non riportato | congelamento dei campioni a 4 ° C e trasferimento su ghiaccio fondente | non riportato | non riportato | × |
| [28]* | tacchino | 7 UWTP a Istanbul, Turchia e 2 tombini nelle vicinanze degli ospedali di Istanbul Trattamento preliminare; CAS; rimozione avanzata dei nutrienti | 21 ° e 25 ° di aprile, 2020 | prendi campioni | Bottiglie sterilizzate da 250 ml | non riportato | non riportato | non riportato | × |
| [29]* | USA | 11 punti di campionamento (ovvero, 6 impianti di trattamento delle acque reflue e 5 stazioni di pompaggio in ingresso, o linee di intercettazione) a Syracuse, NY e in altri luoghi nella contea di Onondaga, NY. PE = 12800-223900 (UWTP) PE = 3841-112747 (linee di intercettazione) | 6 ° e il 13 ° maggio, 2020 | Campioni compositi di acque reflue 24 ore su 24 | non riportato | conservazione dei campioni a 4 ° C e trasporto su ghiaccio alla Upstate Medical University (Syracuse, NY) | non riportato | Il Mattino dopo | × |
| [8]* | USA | UWTP a Bozeman, Montana | 18 ° -25 ° di maggio, 2020 | Raccolta di campioni da 0,5 litri di acque reflue pretrattate in 7 giorni in un periodo di 17 giorni, utilizzando due metodi di raccolta (campioni prelevati e compositi di 24 ore) | non riportato | non riportato | non riportato | non riportato | × |
| [30] | USA | 9 campioni compositi e 6 campioni di acque reflue prelevate da due UWTP nel sud della Louisiana, rispettivamente (UWTP A = 244627 PE; UWTP B = 45694 PE) 7 campioni di acque reflue grezze 4 campioni trattati secondari 4 campioni di effluenti finali dopo la clorazione | 13 gennaio ° 2020 3 febbraio rd 2020 2 marzo ° 2020, 8 aprile ° e 29 aprile ° 2020 | non riportato | Flaconi Nalgene sterili da 1 litro | Trasporto su ghiaccio al laboratorio | non riportato | non riportato | × |
| [31]* | USA | UWTP nel Massachusetts | 18 ° marzo-25 ° di marzo 2020 | Campioni compositi 24 ore su 24 di acque reflue grezze | non riportato | non riportato | conservazione a 4 ° C | non riportato | √ 60 ° C, 90 min |
Abbreviazioni ( riportate in ordine alfabetico ): CAS : Convenzionale fanghi attivi; IE : equivalente abitante; PE : popolazione equivalente; UASB : coperta per fanghi anaerobici verso l’alto
Tavolo 2
Informazioni sul metodo di concentrazione utilizzato per la rilevazione dell’RNA SARS-CoV-2 nelle acque reflue.
| Riferimento I documenti contrassegnati da un asterisco (*) non sono stati certificati da peer review (preprints) | Posizione data in ordine alfabetico | Principali fasi di concentrazione del campione | Controllo surrogato | Recupero |
|---|---|---|---|---|
| [34] | Australia | (i) membrane elettronegative : • Regolazione del pH del campione da ∼3,5 a 4 • Filtrazione del campione (100-200 mL) attraverso membrane elettronegative da 90 mm di dimensione dei pori di 0,45 μm • omogeneizzazione dei campioni utilizzando un omogeneizzatore tissutale Precellys 24 3 × 20 sa 8000 rpm a un intervallo di 10 s (ii) ultrafiltrazione : • centrifugazione (4750 × g, 30 min) di acque reflue (100-200 mL) • centrifugazione (3500 × g, 15 min) utilizzando Centricon® Plus- 70 filtro centrifugo (cut-off 10 kDa) • la tazza del concentrato è stata capovolta e posizionata sopra la tazza del filtro del campione • centrifugazione (1000 × g, 2 min) e raccolta del campione concentrato (∼250 μL) | – | – |
| [35] | Australia | • aggiunta di 200 μl di volume di MHV a un’aliquota da 50 ml di acque reflue grezze (i) adsorbimento-estrazione con tre diverse tecniche di pretrattamento (AC) : • acidificazione del campione a pH 4.0 (metodo A), nessun campione pretrattamento (metodo B) e aggiunta di MgCl2 (25 mM) (metodo C) • filtrazione dei campioni attraverso membrane elettronegative (dimensione dei pori 0,45 μm, diametro 47 mm) • posizionamento della membrana in un tallone battente tubo (ii) metodi del dispositivo di filtraggio centrifugo (D, E): • Metodo D: centrifugazione (4500 × g, 10 min) del campione a 4 ° C; concentrazione del surnatante utilizzando un dispositivo di filtraggio centrifugo Amicon® Ultra-15 (cut-off del peso molecolare 30 kDa); centrifugazione (4750 × g, 10 min) a 4 ° C; raccolta del campione concentrato (400 μL); e trasporto in una provetta per sferette da 2 mL • Metodo E: centrifugazione (3500 × g, 30 min) del surnatante a 4 ° C attraverso il dispositivo di filtraggio centrifugo Centricon Plus-70 (cut-off peso molecolare 10 kDa); raccolta del campione concentrato (300 μL) e miscelazione con 100 μL di acqua priva di DNasi e RNasi e trasporto in una provetta per sferette da 2 mL; risospensione del pellet in 800 μl di Trizol; trasporto di 400 μL del campione concentrato in una provetta per sferette da 2 mL (iii) precipitazione PEG (F): • centrifugazione (10000 × g, 20 min) a 4 ° C per la rimozione di grandi particelle e detriti • trasporto del surnatante in una nuova provetta da centrifuga e conservazione a 4 ° C • recupero di MHV dal pellet; risospensione del pellet in estratto di manzo e glicina 0,05 M (pH 9,0) in rapporto 1: 5 • agitazione del pellet su incubatore con agitazione (200 rpm, 30 min) • centrifugazione del pellet (10000 × g, 10 min ) a 4 ° C e trasferimento del surnatante nella provetta centrifuga contenente la fase di centrifugazione iniziale supernatante • neutralizzazione della miscela surnatante utilizzando 2 M HCl (2 M • aggiunta di PEG e NaCl al surnatante a rapporti del 10% e 2% p / v, rispettivamente • incubazione delle provette da centrifuga a 4 ° C per 2 h su un agitatore orbitale impostato a 120 rpm • centrifugazione del campione (10000 × g, 30 min) a 4 ° C (iv) Ultracentrifugazione (G): • centrifugazione del campione (10000 × g, 1 h) a 4 ° C • risospensione del pellet in 3,5 mL di tampone glicina 0,25 N (pH 9,5) • incubazione del campione in ghiaccio per 30 min; neutralizzazione del campione mediante aggiunta di 3 mL di 2 × PBS (pH 7.2) • centrifugazione del surnatante (12000 × g, 15 min) a 4 ° C • ultracentrifugazione (100000 × g 1 h) a 4 ° C • re -sospensione del pellet in 400 μL di 1 × PBS (pH 7,2) e trasporto in una provetta da 2 ml | MHV | 26.7-65.7%, |
| [4] | Australia | • Adsorbimento-estrazione con membrana elettronegativa • Ultrafiltrazione con unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15 | – | – |
| [7]* | Brasile | • Precipitazione con glicina e PEG • Centrifugazione utilizzando il sistema di filtrazione Centriprep YM 50 • Volume finale di 2 mL | Norovirus murino | 1.6 – 2.6 % |
| [25]* | Francia | • Filtro Vivaspin MWCO da 50 kDa, volume fino a 500 μL | – | – |
| [6]* | Francia | • omogeneizzazione dei campioni • centrifugazione (200000 × g, 1 ora) di 11 mL a 4 ° C • risospensione di pellet virali in 400 μL di tampone PBS 1X | – | – |
| [32]* | India | • centrifugazione (4500 × g, 30 min) di campioni di liquame (50 mL) • filtrazione del surnatante utilizzando filtri da 0,22 μm • concentrazione di ciascun filtrato utilizzando due piastre filtranti a 96 pozzetti e metodo PEG (miscelazione di 80 g / L PEG e 17,5 g / L di NaCl in 25 mL di filtrato e incubazione a 17 ° C, centrifugazione a 100 rpm (13000 × g, 90 min) e risospensione del surnatante in 300 μL di acqua priva di RNasi) | – | – |
| [27]* | Israele | • centrifugazione di 0,25-1 L di acque reflue / reflue per rimuovere le particelle di grandi dimensioni • concentrazione del surnatante con precipitazione di PEG o allume (20 mg / L), seguita da centrifugazione aggiuntiva • incubazione della miscela a 4 ° C con 100 rpm agitazione (12 h) e centrifugazione (14000 × g, 45 min) a 4 ° C per far sedimentare le particelle virali • risospensione delle particelle virali in soluzione PBS • filtrazione della fase acquosa (contenente particelle virali) attraverso un filtro da 0,22 μm ulteriormente concentrazione con provette centrifughe Ultra-15 (cut-off 30 kDa) fino a un volume finale di 1 mL | – | – |
| [22] | Italy | • separazione in due fasi (metodo PEG-destrano) (protocollo poliovirus OMS modificato) • centrifugazione di 250 mL di acque reflue in solidi pellet • miscelazione di acque reflue chiarificate con destrano e PEG (la miscela è stata lasciata a riposo per una notte a 4 ° C in un imbuto di separazione) • raccolta dello strato inferiore e dell’interfase e aggiunta al pellet dalla centrifugazione iniziale | – | – |
| [24]* | Italy | • separazione in due fasi (metodo PEG-destrano) (protocollo poliovirus OMS modificato) • centrifugazione di 250 mL di acque reflue in solidi pellet • miscelazione di acque reflue chiarificate con destrano e PEG (la miscela è stata lasciata a riposo per una notte a 4 ° C in un imbuto di separazione) • raccolta dello strato inferiore e dell’interfase e aggiunta al pellet dalla centrifugazione iniziale | Alphacoronavirus HCoV 229E | 2.04 ± 0.70% |
| [9]* | Italy | • prefiltrazione di campioni su filtri in fibra di vetro (dimensione nominale dei pori 0,7 μm, diametro 145 mm) ulteriore filtrazione sui filtri (dimensione nominale dei pori 0,2 μm, diametro 145 mm) | – | – |
| [33]* | Giappone | (i) metodo del vortice di membrana elettronegativa : • aggiunta di 2 mL e 50 mL di 2,5 M MgCl2 a 200 mL di acque reflue influenti e 5.000 mL di campioni di acque reflue trattate secondariamente, rispettivamente • aggiunta di 50 mL di 2,5 M MgCl2 a 5 L di campioni di acqua di fiume • filtrazione di campioni di acque reflue e acque di fiume attraverso una membrana di estere di cellulosa mista (dimensione dei pori 0,8 μm; diametro, 90 mm) • aggiunta di 10 mL di tampone di eluizione in un tubo di plastica da 50 mL contenente la membrana • vigoroso agitazione su vortex della membrana e aggiunta di 5 mL di tampone di eluizione per ottenere un volume finale di ca. 15 mL • centrifugazione (2000 × g, 10 min) a 4 ° C • filtrazione (dimensione dei pori 0,45 μm, diametro 25 mm) del supernatante e concentrazione utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione Centriprep YM-50 (ii) estrazione dell’RNA diretta per adsorbimento: • filtrazione dei campioni di acqua con 25 mM MgCl2 attraverso una membrana mista cellulosa-estere (porosità 0,8 μm; diametro 90 mm) | – | – |
| [26] | Spagna | • inoculo di campioni di acque reflue influenti (200 mL) ed effluenti con PEDV e MgV • regolazione del pH a 6,0 e aggiunta di 0,9 N di AlCl3 (1: 100) • regolazione del pH a 6,0 e miscelazione con un agitatore orbitale (150 rpm, 15 min) • centrifugazione (1700 × g, 20 min) • risospensione del pellet in 10 mL di estratto di manzo al 3% (pH 7.4) • miscelazione dei campioni (150 rpm, 10 min) • centrifugazione (1900 × g, 30 min) • risospensione del pellet in 1 mL di PBS | Ceppo PEDV CV777 MgV | influente: PEDV = 11 ± 2,1% MgV = 11 ± 3,5% effluente: PEDV = 3,3 ± 1,6% MgV = 6,2 ± 1,0% |
| [21]* [38] | Paesi Bassi | • centrifugazione (4654 × g, 30 min) per rimuovere particelle di grandi dimensioni • filtrazione di 100-200 mL di supernatante con ultrafiltro centrifugo Centricon® Plus-70 (cut-off 10 kDa) mediante centrifugazione (1500 × g, 15 min) | F-specific RNA | 73 ± 50% |
| [28]* | tacchino | • centrifugazione (3200 × g, 45 min) di 250 mL di acque reflue influenti per la rimozione di particelle di grandi dimensioni • filtrazione di 250 mL di surnatante con Amicon® Ultra-15 (cut-off 10 kDa) mediante centrifugazione (3200 × g, 25- 40 min) • raccolta di 200-600 μl di concentrato | – | – |
| [29]* | USA | • miscelazione dei campioni per risospendere i particolati • 20 mL sono stati aliquotati in una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL • aggiunta di un cuscino di saccarosio da 12 mL (50% di saccarosio in tampone TNE [20 mM Tris-HCl (pH 7,0), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA]) • purificazione dei campioni mediante centrifugazione (150000 × g, 90 e 45 min) a 4 ° C utilizzando una serie Sorvall WX Ultra con rotore Sorvall Surespin ™ 630 • decantazione del surnatante e risospensione dei pellet in 200 μL 1X PBS • conservazione dei pellet a −20 ° C per <12 ore prima dell’estrazione dell’RNA | – | – |
| [30] | USA | Metodo A: • Ultrafiltrazione con 250 mL di campione a 3000 g x30 min • Concentrazione del campione (70 mL) con Centricon Plus-70 tramite centrifugazione (1500 g x15 min) • Ulteriore centrifugazione a 1000 g x2 min per la raccolta di 350 μL di concentrato virale Metodo B: • Adsorbimento-eluizione utilizzando una membrana elettronegativa • Aggiunta di 2,5 M MgCl2 • Filtrazione attraverso un filtro elettronegativo • Rimozione di ioni Mg mediante passaggio di 200 mL di 0,5 mM H2SO4 • Eluizione di virus con 10 mL di 1 mM NaOH (pH 10.8) • L’eluato è stato recuperato in una provetta contenente 50 μL di H2SO4 100 mM e 100 μL di tampone Tris-EDTA 100 x • Centrifugazione di 10 mL di campione utilizzando Centriprep YM-30 fino a un volume finale di 650 μL | – | – |
| [31]* | USA | • filtrazione attraverso una membrana da 0,2 μm per rimuovere i detriti batterici • aggiunta a 40 mL di filtrato di 4 g di PEG 8000 e 0,9 g di NaCl • centrifugazione (12000 × g, 2 ore) • risospensione del pellet virale | – | – |
| [8]* | USA | • filtrazione del campione di acque reflue (500 mL) attraverso filtri a membrana da 20 μM, 5 μM e 0,45 μM • concentrazione a 150-200 μL utilizzando concentratori Corning Spin-X UF (cut-off 100 kDa) |
Abbreviazioni ( riportate in ordine alfabetico ): MgV : Mengovirus; MHV : virus dell’epatite murina; PBS : soluzione salina tamponata con fosfato; PEDV : virus della diarrea epidemica suina ; PEG : polietilene glicole
Tabella 3
Condizioni di estrazione dell’RNA degli studi disponibili.
| Riferimento I documenti contrassegnati da un asterisco (*) non sono stati certificati da peer review (preprints) | Posizione data in ordine alfabetico | Kit di estrazione di RNA | Uso del controllo surrogato | Volume di eluizione finale | Conservazione dei campioni estratti |
|---|---|---|---|---|---|
| [34] | Australia | Metodo A • Provetta con microsfere da 5 mL dal kit RNeasy PowerWater per membrana elettronegativa • Precellys 24 per l’omogeneizzazione del campione a 3 x 20 sec a 8000 rpm (intervalli di 10 sec) • Kit RNeasy PowerMicrobiome per l’estrazione dell’RNA Metodo B • Estrazione dell’RNA con il kit RNeasy PowerMicrobiome • Piattaforma QIAcube Connect per l’estrazione | Non riportato | 100 μl | −80 °C |
| [35] | Australia | • Kit RNeasy PowerMicrobiome | Non riportato | 100 μl | Non riportato |
| [4] | Australia | • Provetta con microsfere da 5 mL dal kit RNeasy PowerWater per membrana elettronegativa aggiungendo 990 μL di tampone PM1 e 10 μL di β-mercaptoetanolo • Precellys 24 per l’omogeneizzazione del campione a 3 x 20 sec a 10000 rpm (intervalli di 10 sec) • 10000xg per 5 min al pellet detriti e granuli del filtro • Kit RNeasy PowerMicrobiome e piattaforma QIAcube Connect per l’estrazione di RNA da 450 μL di lisato | Non riportato | 100 μl | Non riportato |
| [7]* | Brasile | • Mini kit RNA virale QIAmp | Non riportato | 200 μl | Non riportato |
| [25]* | Francia | • Nucleospin RNA Virus Kit | VP40 che codifica per RNA o virus Ebola | Non riportato | Non riportato |
| [6]* | Francia | • Kit PowerFecal Pro • Kit di rimozione dell’inibitore della PCR OneStep | Non riportato | Non riportato | Non riportato |
| [32]* | India | • NucleoSpin RNA Virus kit | Fago MS2 | Non riportato | Non riportato |
| [27]* | Israele | Mini kit RNeasy e kit easyMAG | Non riportato | Non riportato | −80 °C |
| [22] | Italy | • 20 min di lisi • Centrifugazione a 2000 xg per 1 min • Aggiunta di granuli di silice magnetica al surnatante • Purificazione dell’RNA utilizzando il kit OneStep PCR Inhibitor Removal | Non riportato | Non riportato | Non riportato |
| [24]* | Italy | • NucliSENS miniMAG con silice magnetica • Quantità di tampone di lisi doppia rispetto al volume del campione • Fase di lisi prolungata per 20 minuti • 100 μL di sfere di silice magnetica per campione | Non riportato | Non riportato | Non riportato |
| [9]* | Italy | Mini kit QIamp RNA virale | Non riportato | Non riportato | Non riportato |
| [33]* | Giappone | • Kit RNeasy PowerWater • Mini kit QIAmp Viral RNA | Non riportato | • 60 μL • 50 μL | Non riportato |
| [26] | Spagna | • 150 μL di campione concentrato miscelato con 25 μL di RNA vegetale Isolamento ausiliario e 600 μL di tampone di lisi seguito da vortex a impulsi • Centrifugazione per 5 min a 10000 xg per rimuovere i detriti • Estrazione di RNA con il kit Nucleospin RNA virus | Virus della diarrea epidemica suina (PEDV) e mengovirus vMC0 (MgV) | 100 μl | Non riportato |
| [21]* [38] | Paesi Bassi | • Kit RNeasy PowerMicrobiome • Kit Nuclisens | Non riportato | 100 μl | Non riportato |
| [28]* | tacchino | • Mini kit QIAmp cador Pathogen • Kit QuantiNova Pathogen + IC | Virus della bronchite infettiva | Non riportato | Non riportato |
| [29]* | USA | AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit | Non riportato | 50 μl | Non riportato |
| [30] | USA | Kit ZR Viral RNA | Batteriofago Pseudomonas Φ6 | 100 μl | Non riportato |
| [31]* | USA | Trizol | Non riportato | Non riportato | Non riportato |
| [8]* | USA | Mini kit RNeasy | Non riportato | 40 μl | Non riportato |
Tabella 5
Condizioni di reazione RT-PCR degli studi disponibili.
| Riferimento I documenti contrassegnati da un asterisco (*) non sono stati certificati da peer review (preprints) | Posizione data in ordine alfabetico | Volume modello utilizzato | Volume della miscela di reazione | Primer selezionati | Miscela di reazione PCR | Strumentazione | Parametri di ciclismo | Misure di controllo della qualità | Altre analisi |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| [34] | Australia | 6 μl | 40 μl | 1N_Sarbeco2NIID_2019-nCOV_N | Miscela di reazione monofase iTaq Universal Probes | Termociclatore BioRad CFX 96 | N_Sarbeco 10 min a 50 ° C 3 min a 95 ° C X 45 cicli di: 15 sec a 95 ° C 30 sec a 58 ° C NIID_2019-nCOV_N 10 min a 50 ° C 15 min a 95 ° C X 45 cicli di: 15 secondi a 95 ° C 60 secondi a 60 ° C | • Frammenti genici gBlocks come + ve controlli e standard • Determinazione dell’inibizione dell’RNA mediante saggio RT-qPCR Sketa22 ( Ochorhynchus keta) • Bianchi reagenti • Bianchi di estrazione • Laboratori separati per l’estrazione dell’RNA e le analisi RT-qPCR • LOD di N_Sarbeco: 8.3 copie / reazione • LOD di NIID_2019-nCOV_N: non noto | Sequenziamento utilizzando le piattaforme di sequenziamento Sanger e Illumina |
| [35] | Australia | 5 μl | 25 μl | Virus MHV | Miscela di reazione monofase iTaq Universal Probes | Termociclatore BioRad CFX 96 | 10 min a 50 ° C 5 min a 95 ° C X 40 cicli di: 15 sec a 95 ° C 60 sec a 60 ° C | • Frammenti genici gBlocks come + ve controlli e standard • Controlli negativi • Determinazione dell’inibizione dell’RNA mediante saggio RT-qPCR Sketa22 ( Ochorhynchus keta) • Bianchi reagenti • Bianchi di estrazione • Laboratori separati per l’estrazione dell’RNA e le analisi RT-qPCR | Non riportato |
| [4] | Australia | 3 μl | 20 μl | CDC N1, N2 ed E NIID_2019-nCoV N assay | Miscela di reazione monofase iTaq Universal Probes | Termociclatore BioRad CFX 96 | Non riportato | • Frammenti genici gBlocks come + ve controlli e standard • Controlli negativi • Determinazione dell’inibizione dell’RNA mediante saggio RT-qPCR Sketa22 ( Ochorhynchus keta) • Bianchi reagenti • Bianchi di estrazione • Laboratori separati per l’estrazione dell’RNA e le analisi RT-qPCR | • Analisi RT-ddPCR • Sequenziamento NextSeq Illumina |
| [7]* | Brasile | Non riportato | Non riportato | N1, RdRp, S | Kit QPCR Quantinova OneStep | Non riportato | Non riportato | Norovirus murino | Non riportato |
| [25]* | Francia | Non riportato | Non riportato | N1 e N3 | Non riportato | Non riportato | Non riportato | RNA codificante per VP40 del virus Ebola come standard di normalizzazione | Non riportato |
| [6]* | Francia | 5 μl | 25 μl | E e RdRp | Master mix veloce in 1 fase | Sistema PCR in tempo reale Viaa7 | 10 min a 55 ° C 3 min a 95 ° C X 45 cicli di: 15 sec a 95 ° C 58 sec a 30 ° C | Controllo positivo interno | Non riportato |
| [32]* | India | Non riportato | Non riportato | ORF1ab, N, S | Kit TaqPath Covid-19 RT-PCR | Non riportato | Non riportato | Positive controls Negative controls | Non riportato |
| [27]* | Israele | Non riportato | Non riportato | E gene | Fast Start Universal Probe Master | Sistema PCR in tempo reale Step One Plus | Non riportato | • Controlli positivi • Controlli negativi | Non riportato |
| [22] | Italy | 2,5 μL 5 μL del primo prodotto PCR | 25 μl 50 μl | ORF1ab (ampio intervallo e specifico per SARS-CoV-2) e NIID_WH-1 | • Kit Platinum SuperFit Green PCR Master Mix • DreamTaq Polimerasi e tampone | Non riportato | 30 sec a 98 ° C X 35 cicli di: 10 sec a 95 ° C 10 sec a 50 ° C 10 sec a 54 ° C 30 sec a 72 ° C 5 min a 72 ° C 30 sec a 98 ° C X 45 cicli di: 10 sec a 95 ° C 10 sec a 50 ° C 10 sec a 54 ° C 30 sec a 72 ° C 5 min a 72 ° C | Controlli negativi | Sequenziamento |
| [24]* | Italy | 2 μl e 5 μl | 25 μl | ORF1ab, E e RdRp | • Kit Platinum SuperFit Green PCR Master Mix • Sistema qRT-PCR in una fase Ultrasense • Sistema RT-PCR in una fase AgPath-ID | Non riportato | 30 sec a 98 ° C X 35 cicli di: 10 sec a 98 ° C 10 sec a 54 ° C 30 sec a 72 ° C 5 min a 72 ° C 30 min a 50 ° C X 45 cicli di: 15 sec a 95 ° C 60 o 95 sec a 58 ° C 30 sec a 60 ° C | • Controlli sintetici positivi • Controlli negativi | Sequenziamento |
| [9]* | Italy | 2,5 μl | Non riportato | N1, N2, N3, ORF1ab, E | Non riportato | Non riportato | Non riportato | Non riportato | • Sequenziamento dell’intero genoma • Assemblaggio del genoma e analisi filogenomica • Coltura cellulare e isolamento del virus |
| [33]* | Giappone | 2,5 μl | 25 μl | N_Sarbeco e NIID_2019-nCOV_N, N1, N2 | Sonda qPCR Mix con UNG | Dice Real Time System TP800 | 10 min a 25 ° C 30 sec a 95 ° C X 45 cicli di: 5 sec a 95 ° C 60 sec a 60 ° C | • Controllo non inibitorio • Controllo del virus pepper mottle mottle • Controlli negativi • Frammenti del gene GBlocks contenenti sequenze della regione di amplificazione utilizzate per generare la curva standard | Non riportato |
| [26] | Spagna | Non riportato | 25 μl | N1, N2, N3 | Kit RT-PCR OneStep PrimeScript | Sistema LightCycler 480 | 10 min a 50 ° C 3 min a 95 ° C X 45 cicli di: 3 sec a 95 ° C 30 sec a 55 ° C | • Controllo positivo • Controlli negativi | Non riportato |
| [21]* [38] | Paesi Bassi | 5 μl | 20 μl | N1, N2, N3 ed E | TaqMan Fast Virus Master Mix in 1 fase | Termociclatore BioRad CFX 96 | 5 min a 50 ° C X 45 cicli di: 10 sec a 95 ° C 30 sec a 60 ° C | • Controlli positivi • Controlli negativi • RNA sintetizzato in vitro dal virus denge di tipo 2 | Non riportato |
| [28]* | tacchino | 5 μl | 20 μl | RdRp | Kit QuantiNova Pathogen + IC | Termociclatore BioRad CFX 96 | Non riportato | • Controlli interni | Non riportato |
| [29]* | USA | 2,5 μl | 25 μl | IP2 e IP4 di RdRp | Reliance One-Step Multiplex RT-qPCR Supermix | QuantStudio3 o QuantStudio5 | 10 min a 50 ° C 10 min a 95 ° C X 45 cicli di: 10 sec a 95 ° C 30 sec a 59 ° C | • Campioni arricchiti con CrAssphage | Non riportato |
| [30] | USA | 2,5 μl | 25 μl | N1, N2 | PerfecTa qPCR ToughMix | Termociclatore BioRad CFX 96 | 10 min a 95 ° C X 45 cicli di: 10 sec a 95 ° C 30 sec a 55 ° C | • Batteriofago Pseudomonas Φ6 | Non riportato |
| [31]* | USA | Non riportato | Non riportato | N1, N2, N3 | Non riportato | Non riportato | Non riportato | • Controlli positivi N1, N2, N3 | Sequenziamento di Sanger |
| [8]* | USA | 5 μl | 40 μl | Kit nCoV CDC EUA 2019 (N1 e N2) | Master Mix TaqPath RT-qPCR in 1 fase | Sistema ABI 7500 Fast Real-Time PCR | 2 min a 25 ° C 15 min a 50 ° C 2 min a 2 ° C X 45 cicli di: 3 sec a 95 ° C 30 sec a 55 ° C | • Controlli negativi • Misurazioni triplicate | Sequenziamento di Sanger |
Tabella 6
Quantificazione dei risultati di RT-qPCR negli studi disponibili.
| Riferimento I documenti contrassegnati da un asterisco (*) non sono stati certificati da peer review (preprints) | Posizione | Quantificazione degli obiettivi (sì / no) | Unità di reporting | Valori Ct del campione positivi e risultati della quantificazione |
|---|---|---|---|---|
| [34] | Australia | sì | Valori Ct | 37,5 Ct = 12 copie / 100 mL di WW 39 Ct = 1,9 copie / 100 mL di WW (1 campione positivo per N_Sarbeco e 1 positivo per NIID_2019-nCOV_N) |
| [35] | Australia | sì | Copie / MHV recuperate | Efficienza di recupero: Metodo C> Metodo B> Metodo D> Metodo F> Metodo G> Metodo E> Metodo A |
| [4] | Australia | sì | Valori Ct Copie / 100 mL | 4/5 campioni di aeromobili positivi per target N o E Entrambi i metodi di concentrazione hanno recuperato l’RNA di SARS-CoV-2 dalle acque reflue degli aeromobili (N_Sarbeco e E_Sarbeco) Valori Cq dei campioni positivi: 36-39 CDC N1, N2 e NIID_2019-nCoV I dosaggi N non hanno fornire risultati positivi 7/21 campioni di navi da crociera sono risultati positivi per tutti i test 14/21 campioni sono stati positivi per almeno un test |
| [7]* | Brasile | No | Valori Ct Copie genoma / L | Aumento di 1 log osservato da novembre 2020 a marzo 2020 5,49 log 10 copie del genoma / l (novembre 2019) a 6,68 log 10 copie del genoma / l (marzo 2020) |
| [25]* | Francia | sì | Valori Ct RNA copie / 100 mL | Nessuna relazione temporale diretta tra il rilevamento di SARS-CoV-2 e le caratteristiche epidemiologiche di COVID-19 |
| [6]* | Francia | sì | Unità genoma / L | 5,4 × 10 4 – 3 × 10 6 unità genoma / L |
| [32]* | India | sì | Valori Ct Copie / L | 27,92-29,52 Ct 2,42 × 10 8 copie / L |
| [27]* | Israele | No | Valori Ct | 32.76-38.5 Ct |
| [22] | Italy | No | Valori Ct | Segnali positivi 4/8 giorni impianto A Segnali positivi 4/8 giorni impianto B Segnali positivi 2/8 giorni impianto C1 Segnali positivi 2/8 giorni impianto C2 |
| [24]* | Italy | sì | Copie genomiche / μL | 15/40 campioni segnali positivi LOD a 5,9 × 10 3 copie genomiche / L a 5,6 × 10 4 copie genomiche / L |
| [9]* | Italy | No | Valori Ct | ORF1ab, N ed E segnale positivo nell’influente grezzo Nessun segnale positivo nelle acque reflue trattate |
| [33]* | Giappone | sì | Copie / L | 1/5 WW trattati secondari erano positivi 0/5 campioni influenti erano positivi per SARS-CoV-2 |
| [26] | Spagna | sì | Valori Ct Copie genomiche / L | 35/42 campioni positivi influenti per almeno un gene target 2/18 campioni positivi trattati secondari per almeno un gene target Concentrazione: 5,1-5,5 log 10 copie genomiche / L |
| [21]*, [38] | Paesi Bassi | Sì (N1-N3) No (E) | Valori Ct Copie geniche / mL | Concentrazione di N1, N2 e N3: 1,2 × 10 1 copie del genoma / mL E: 18/29 segnali positivi UWTP |
| [28]* | tacchino | sì | Valori Ct Copie / L | 34.67-39.54 Ct 3.11 × 10 2 – 7.78 × 10 3 copie / L |
| [29]* | USA | sì | Copie / mL | 18/22 campioni positivi 42,7 ± 32,9-112,35 ± 8,01 genomi / mL |
| [30] | USA | sì | Valori Ct Copie / L | Campioni positivi nel mese di aprile (Metodo A) 2,5-3,2 log 10 copie / L |
| [31]* | USA | No | Valori Ct | 33,87-38,39 Ct (campioni filtrati meridionali e non filtrati nord positivi rispettivamente per N1, N2 e N3 e N1 e N3) |
| [8]* | USA | sì | Genomi virali / L | Non fornito |
L’obiettivo principale degli studi condotti nel campo della WBE relativi a SARS-CoV-2 è stato l’isolamento e la rilevazione dell’RNA virale all’ingresso delle UWTP (acque reflue grezze), pochissime di queste hanno fornito informazioni sulla prevalenza del virus durante le varie fasi del trattamento applicato all’UWTP.
In generale, mancano dati sull’effetto di varie tecnologie di trattamento delle acque reflue applicate alle UWTP su SARS-CoV-2 poiché i primi sforzi sono stati per identificare in primo luogo il virus nell’influente di UWTP. L’efficienza di rimozione di SARS-CoV-2 con i processi di trattamento biologico tradizionali come il processo convenzionale a fanghi attivi (CAS) e il processo a membrana bio-reattiva (MBR), rimane poco chiara a causa dell’assenza di dati sperimentali (40 [preprint]).
Più specificamente, la maggior parte dei dati disponibili si concentra su una vasta gamma di virus surrogati di batteriofagi e virus coltivati in laboratorio come Enterovirus, Adenovirus e poliomavirus umano JC, con un’ampia varietà di rimozione esibita, da 0,9 a 5,8 log [41] . Allo stesso tempo, tuttavia, non vi è alcuna conferma che SARS-CoV-2 si comporti in modo diverso rispetto ad altri coronavirus [42].
L’impatto della presenza di SARS-CoV-2 sulla comunità microbica nei fanghi di depurazione durante il trattamento CAS o MBR è un’altra questione che resta da chiarire, in quanto eventuali effetti possono portare ad alterazioni della comunità microbica che esegue la degradazione biologica di contaminanti nelle acque reflue in entrata. Lavori precedenti hanno dimostrato che i virus introdotti o “estranei” possono influenzare in modo significativo le popolazioni batteriche, tramite la lisi cellulare batterica e il trasferimento genico orizzontale (HGT) [43].
Si suggerisce ai virus di lisare selettivamente i batteri le cui popolazioni nel loro habitat è grande, influenzando in questo modo la ricchezza della loro popolazione, mentre le loro concentrazioni nei fanghi attivi hanno dimostrato di aumentare nel corso del trattamento CAS delle acque reflue, suggerendo la promozione di virus riproduzione in presenza di ospiti batterici [44].
Tuttavia, il grado esatto in cui virus specifici hanno un tale impatto sulle comunità batteriche ospiti rimane ancora poco chiaro, poiché sono necessari ulteriori studi e lavori sperimentali per dimostrare l’azione di specifiche specie virali come SARS-CoV-2 sulle comunità microbiche dei fanghi.
Gundy et al. [45] hanno confrontato la vitalità (percentuale di virus vivi in un’intera popolazione virale) del coronavirus umano 229E (HCoV) e del virus della peritonite infettiva felina (FIPV) nell’acqua del rubinetto e nelle acque reflue, e i loro risultati hanno indicato che i coronavirus sono sopravvissuti più a lungo quando presenti nelle acque reflue trattate primarie rispetto alle acque reflue trattate secondarie, un fatto che può essere attribuito al maggior contenuto di solidi che può offrire protezione virale dall’inattivazione.
Un altro studio di 39, disponibile il 17 aprile 2020, ha indicato la riduzione del carico di RNA SARS-CoV-2 di 100 volte negli effluenti trattati di tre UWTP parigini rispetto alle acque reflue di fogna grezze. Tuttavia, questa scoperta non è stata discussa nella seconda versione (6 maggio 2020) dello stesso manoscritto ([6] [preprint]).
Lo smaltimento di SARS-CoV-2 nelle acque reflue fognarie non trattate è fonte di preoccupazione nei paesi in cui le acque reflue non trattate vengono smaltite nei fiumi, a causa dell’elevato rischio di infezione della popolazione e degli animali (bestiame e fauna selvatica) a contatto con le acque reflue a valle. Il nuoto in acque contaminate da liquami è stato precedentemente collegato a malattie respiratorie, con studi precedenti sull’infezione respiratoria nei Grandi Laghi associati ad adenovirus [46].
Più recentemente, i ricercatori dell’Ecuador, un paese che pratica comunemente questo tipo di smaltimento, hanno mostrato la presenza di SARS-CoV-2 RNA in tre località lungo il fiume Quito, a concentrazioni da 2,84 × 105 a 3,19 × 106 copie geniche / L per Target N1 e da 2,07 × 105 a 2,23 × 106 copie geniche / L per il target N2 [47]. Gli autori suggeriscono che le concentrazioni misurate riflettono una grande frazione non diagnosticata di pazienti COVID-19, così come casi asintomatici o pre-sintomatici.
Un altro studio di Haramoto et al. 33 ha mostrato l’assenza di SARS-CoV-2 dall’acqua del fiume nella prefettura di Yamanashi in Giappone in tre diverse occasioni di campionamento tra il 17 e il 7 maggio 2020, utilizzando quattro quantitativi (N_Sarbeco, NIID_2019-nCoV_N, CDC N1 e N2) e due saggi PCR annidati (ORF1a e proteina S). Rimoldi et al. 9 ha anche esaminato l’acqua del fiume per la presenza di SARS-CoV-2. I campioni del fiume Lambro e del fiume Lambro Meridionale sono stati prelevati il 14 e il 22 aprile 2020.
Segnali positivi sono stati ottenuti il 14 aprile 2020 in campioni di entrambi i fiumi, mentre solo i campioni del fiume Labro sono risultati positivi per il virus il 22 aprile. La presenza del virus RNA nei campioni di fiume è stata attribuita, secondo gli autori, allo scarico nei fiumi di liquami non trattati, situazione che si è aggravata durante un’anomala e lunga siccità osservata nel periodo di campionamento e alla mancanza di separazione di le acque urbane di deflusso dagli effluenti domestici, che portano a straripamenti fognari combinati.
Secondo l’Organizzazione mondiale della sanità (OMS), è probabile che SARS-CoV-2 possieda una scarsa stabilità nelle acque reflue e sia più suscettibile ai disinfettanti (es. Cloro) rispetto ai virus enterici umani senza involucro (es. Adenovirus, rotavirus, norovirus ed epatite A) ([48,49]).
Le condizioni fisico-chimiche prevalenti nelle acque reflue come pH, solidi e la presenza di microinquinanti [15] possono avere un impatto significativo sulla stabilità e sopravvivenza di virus come norovirus, astrovirus, rotavirus e virus dell’epatite nelle acque reflue, con l’alcalinità che mostra un forte danno effetto sulla persistenza del virus nella componente delle acque reflue solide e liquide, a causa dell’inattivazione di un’ampia frazione della popolazione virale ad alti livelli di alcalinità [50].
In uno studio di Wang et al. [51], il virus più strettamente legato a SARS-CoV-2, essendo SARS-CoV-1, si è dimostrato molto vulnerabile alla disinfezione con cloro e biossido di cloro, rispetto a E. coli e colifago [51]. Il biossido di cloro (40 mg / L, 5 min) è risultato meno efficiente per l’inattivazione di SARS-CoV-1 rispetto al cloro (20 mg / L, 1 min). L’effetto della disinfezione delle acque reflue su SARS-CoV-2 non è stato ancora chiarito, poiché fino ad oggi non ci sono stati rapporti sul fatto che questo virus sia sensibile o persistente durante l’applicazione di tali processi.
Nello studio di Randazzo et al. [26], l’11% dei campioni raccolti dopo il trattamento secondario è risultato positivo a SARS-CoV-2, mentre nessuno dei campioni di effluenti terziari (filtrazione a sabbia, flocculazione / coagulazione, disinfezione NaClO accoppiata, è in alcuni casi, con UV) è risultato positivo al virus. Sebbene questi risultati non decifrino l’effetto della dose del disinfettante e del tempo di contatto sulla sopravvivenza del virus, mostrano che il trattamento terziario e il processo di disinfezione possono essere adeguati.
Inoltre, la cinetica di inattivazione di SARS-CoV-2 (log inattivazione vs valori Ct) durante vari processi di disinfezione come clorurazione, ozonizzazione, trattamento con acido peracetico e irradiazione UV in combinazione con ossidanti (p. Es., Perossido di idrogeno) dovrebbe essere esaminata in modo che si ottiene una solida conoscenza del virus specifico.
Silverman e Boehm [52] hanno fornito una rassegna completa sui tassi di decadimento dei coronavirus umani e dei loro surrogati virali (coronavirus animali e il fago Pseudomonas avvolto Φ6) durante la disinfezione con cloro e l’irradiazione UV in acqua / acque reflue, suggerendo che anche se c’è dati disponibili limitati sull’inattivazione dei coronavirus in seguito alla loro esposizione a disinfettanti, si prevede che l’inattivazione dei coronavirus possa essere efficiente quando vengono applicate le dosi di disinfettante raccomandate per i virus senza involucro.
È anche fondamentale che gli impianti di trattamento delle acque reflue implementino una disinfezione efficace per garantire che il virus non si diffonda attraverso lo scarico delle acque reflue o schemi di riutilizzo. Inoltre, una riduzione delle quantità utilizzate di disinfettanti può essere ottenuta mediante l’uso di tecnologie a membrana come il Membrane Bioreactor (MBR) che utilizza l’ultrafiltrazione per separare i virioni di dimensioni di 60-140 nm [15].
Attualmente, la potenziale via di trasmissione della SARS-CoV-2 all’uomo negli ambienti che ricevono le acque reflue attraverso la pratica del riutilizzo per l’irrigazione agricola non è stata chiarita. Oliver et al. 40 ha riferito che la selezione della tecnica di irrigazione è fondamentale per ridurre al minimo la diffusione del virus nell’ambiente e ha suggerito di prendere in considerazione tecniche di irrigazione alternative, ad esempio la microirrigazione.
Tenendo conto che i virus con involucro hanno maggiori probabilità di ripartirsi in solidi e più suscettibili al trattamento delle acque reflue rispetto alle loro controparti enteriche senza involucro, gli autori di questo documento di revisione sono dell’opinione che i processi di trattamento delle acque reflue multi-barriera saranno efficaci nel rimuovere la SARS -CoV-2, in modo che i rischi associati all’ambiente e alla salute pubblica per il riutilizzo delle acque reflue siano probabilmente trascurabili.
Effetto del campionamento delle acque reflue, delle condizioni di conservazione e del pretrattamento del campione sulla vitalità dell’RNA SARS-CoV-2
Effetto del metodo di campionamento
Entrambi grab ([8] [preprint]; [34]; [9] [preprint]; [26] ) e composito ([27] [prestampa]; [29] [prestampa]; [21] [prestampa]; [23,38]; [8] [prestampa]; [31] [prestampa]) sono stati segnalati metodi di campionamento per la raccolta di campioni di acque reflue per la rilevazione di SARS-CoV-2. Nel caso di campioni compositi, sono stati utilizzati sia campioni di tempo (cioè volume di aliquota fissa a un intervallo di tempo definito, ad esempio 24 h) che proporzionali al flusso (cioè volume di aliquota fisso a un intervallo di volume di flusso definito).
Tra gli studi condotti, ([8] [preprint]) hanno dimostrato che la concentrazione media più affidabile dell’RNA del virus nelle acque reflue era fornita dai campioni compositi rispetto ai campioni prelevati. I titoli virali nei campioni compositi sono risultati inferiori (∼1500 genomi virali / L) rispetto a quelli dei campioni prelevati (∼2 × 104 genomi virali / L), mentre la variazione tra i replicati era notevolmente inferiore.
In generale, la letteratura sull’impatto del tipo di campionamento sulla rilevazione dei virus nelle acque reflue è limitata. Gerba et al. [53] hanno suggerito che i campioni compositi di 24 ore possono consentire di catturare i flussi di picco e, nel caso in cui si utilizzano acque reflue non trattate per determinare il livello dei requisiti di inattivazione virale, si dovrebbero considerare le concentrazioni di picco dei virus piuttosto che quelle medie.
Anche la selezione del tempo di campionamento è di importanza cruciale per la metodologia applicata per la rilevazione del virus. Ad esempio, nel caso in cui vengano utilizzati campioni prelevati, la concentrazione virale sarà una semplice istantanea del particolare campione.
Nella maggior parte delle città, la portata delle acque reflue è massima nelle ore mattutine e serali. Si noti che solo pochi studi hanno riportato il tempo di campionamento per la rilevazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue; 7-12 pm [26] e 13:00 ([9] [prestampa]).
Inoltre, la registrazione del tempo di campionamento dal prelievo consente la rappresentazione accurata del carico fecale giornaliero di picco nelle acque reflue tramite la misurazione di indicatori che sono abbondanti nelle acque reflue specificamente a causa della dispersione umana, sono molto abbondanti nelle acque reflue urbane e presentano una variabilità geografica specifica [54] (cioè attraverso l’enumerazione di indicatori di carico fecale quali: i) coliformi fecali, ii) fagi cross-assembly (CrAssphages), iii) norovirus, iv) Pepper Mild Mottle Virus ev) concentrazioni di enterovirus), che possono essere potenzialmente collegati a la più alta diffusione di SARS-CoV-2 in un giorno, dalle persone infette all’interno di una comunità.
D’altra parte, la raccolta di campioni compositi rappresenterà la concentrazione media dell’RNA del virus durante il periodo di raccolta, senza essere in grado di discriminare i valori di picco registrati entro la durata del campionamento.
Effetto della temperatura di conservazione dei
campioni I campioni raccolti per determinazioni virali in matrici ambientali vengono solitamente analizzati in un breve lasso di tempo, ma, nella maggior parte dei casi, è necessario conservarli in laboratorio prima di ulteriori elaborazioni e analisi. Secondo le linee guida di virologia e microbiologia [55,56], i campioni destinati all’analisi virale entro meno di 48 ore vengono solitamente conservati a 4 ° C al buio, mentre la conservazione a temperature inferiori (20 ° C o -80 ° C) è ritenuto necessario per periodi più lunghi al fine di mantenere l’integrità del campione.
In generale, vi è una scarsità di informazioni disponibili sull’effetto del processo di congelamento sulla vitalità del virus (capacità fisiologica dei virus esaminati vivi [57]. Lo studio di Olson et al. [58] sull’effetto della temperatura di conservazione sulla vitalità del batteriofago MS2 nelle acque reflue, ha rivelato che la degradazione virale non sembra verificarsi quando i campioni vengono conservati a 4 ° C per una settimana prima che la degradazione del virus eguagli la perdita iniziale del virus dovuta al congelamento a -80 ° C.
È stato anche osservato che i titoli del virus erano sostanzialmente inferiori dopo la conservazione del campione per un periodo di circa 40 giorni a 4 ° C rispetto a quelli osservati durante la conservazione del campione a -80 ° C. È interessante notare che la degradazione virale ha dimostrato di aumentare a -20 ° C rispetto a 4 ° C e -80 ° C, a causa della formazione di grandi cristalli di ghiaccio, che provocano danni virali. Anche i crioprotettori (ad es. Glicerolo) sono stati impiegati per mantenere nel tempo l’infettività dei fagi [59].
Tuttavia, questi agenti non sono stati utilizzati in campioni ambientali (es. Acque reflue) e non è chiaro se tali conservanti forniranno uno scudo protettivo ai virus dagli effetti dannosi del congelamento e della conservazione senza compromettere l’integrità del campione.
Nel caso di SARS-CoV-2, la conservazione dei campioni di acque reflue è stata eseguita a 4 ° C ([34,35]; [21] [preprint]; [29] [preprint]; [26]; [6] [ prestampa]), -20 ° C [23] e −80 ° C ([27] [prestampa]) senza informazioni fornite sull’effetto della temperatura sulla vitalità e vitalità virale.
Gundy et al. [45] hanno dimostrato che i coronavirus (il coronavirus umano 229E e il virus della peritonite infettiva felina) erano più sensibili alla temperatura rispetto al poliovirus 1 (PV-1) e la loro sopravvivenza nella matrice acquosa ha dimostrato di essere influenzata dal livello del contenuto organico e la presenza di microrganismi batterici antagonisti.
L’inattivazione dei coronavirus (diminuzione del 99,9%; T99,9) è risultata più rapida in acqua di rubinetto a 23 ° C (10 giorni) rispetto allo stesso mezzo a temperatura inferiore (4 ° C;> 100 giorni), mentre sono stati completamente inattivati nelle acque reflue, con valori di T99.9 compresi tra 2 e 4 giorni.
Effetto del pretrattamento termico del campione
In alcuni studi, i campioni sono stati sottoposti a trattamento termico (56 ° C per 30 min o 60 ° C per 90 min), prima della concentrazione virale, per aumentare la sicurezza del personale di laboratorio durante la manipolazione del campione ( [22]; [31] [prestampa]). Il trattamento termico del campione ha dimostrato di ridurre l’infettività di SARS-CoV-2 con oltre 5 log senza influenzare la sua struttura di RNA ([60] [preprint]).
Esperimenti utilizzando un virus surrogato (Mengovirus), hanno confermato che non si verificava alcuna perdita dell’RNA virale quando i campioni venivano trattati a 56 ° C per 30 min [23]. Allo stesso modo, i campioni di liquame grezzo sono stati pastorizzati a 60 ° C per 90 min per inattivare SARS-CoV-2 ([31] [preprint]).
Il trattamento termico dei campioni è coerente con studi precedenti riguardanti la sopravvivenza del virus avvolto nelle acque reflue pastorizzate [61]. Ye et al. [62] hanno riportato discrepanze nell’inattivazione del virus MS2 senza involucro rispetto ai virus con involucro (MHV e ϕ6) nelle acque reflue pastorizzate e non pastorizzate, suggerendo che ciò può essere attribuito all’attività enzimatica extracellulare batterica nonché ai protozoi o predazione metazoica.
Il tempo necessario per l’inattivazione virale al 90% (T90) variava tra 7-13 h per i virus con involucro ϕ6 e MHV in acque reflue non pastorizzate a 25 ° C, mentre un aumento dei valori di T90 a 28-36 h è stato osservato a 10 ° C . Ciò suggerisce che i virus avvolti escreti nelle feci possono quindi raggiungere le UWTP in uno stato infettivo, specialmente nelle regioni con zone climatiche fredde.
Effetto della materia organica e dei solidi sospesi L’
inattivazione del Coronavirus (FIPV e HCoV) è risultata maggiore nell’acqua di rubinetto che è stata sottoposta a filtrazione rispetto all’acqua non filtrata e la sopravvivenza dei coronavirus è risultata influenzata dal livello di solidi sospesi e organici materia poiché i virus sono sopravvissuti più a lungo nelle acque reflue trattate primarie rispetto alle acque reflue trattate secondariamente [45].
Inoltre, è stato osservato che il titolo dei coronavirus è diminuito significativamente del 99,9% nelle acque reflue, rispetto al PV-1 (diminuzione del 10%) probabilmente a causa della presenza di composti organici che possono interagire con l’involucro virale e provocare l’inattivazione.
Questa osservazione indica anche che i coronavirus adsorbono più prontamente del PV-1 ai solidi originariamente presenti nelle acque reflue, a causa del carattere idrofobo dell’involucro virale, che rende i coronavirus meno solubili in acqua e potrebbe quindi aumentare la propensione di questi virus ad adsorbirsi a i solidi. Ye et al. [62] hanno riportato che il virus MHV e il fago Pseudomonas Φ6, che possiedono una struttura avvolta, hanno mostrato un maggiore partizionamento ai solidi presenti nelle acque reflue rispetto ai virus senza involucro (il 26% di MHV e Φ6 è stato adsorbito ai solidi rispetto al 6% dei due virus senza involucro).
Sulla base di questi risultati, si può dedurre che una parte significativa di SARS-CoV-2 può essere adsorbita a solidi e fanghi di depurazione. Inoltre, gli esperimenti sulla cinetica di adsorbimento eseguiti da Ye et al. [62] sia nei campioni contenenti solidi che in quelli privi di solidi ha rivelato che una volta raggiunto l’equilibrio, i virus avvolti sembrano avere una maggiore affinità per i solidi rispetto ai virus senza involucro, e quindi si può presumere che questi ultimi sarebbero stati rimossi a un misura minore rispetto al primo durante il trattamento primario.
L’eterogeneità dei campioni di acque reflue raccolti negli aerei a causa di una grande frazione di particolato come la carta igienica, è stata riportata anche da Ahmed et al. [4], che considerano questa presenza un fattore limitante per l’ottenimento di campioni rappresentativi. È stato anche dimostrato che i fanghi di depurazione agiscono come trasportatori di particelle virali SARS-CoV-2. Peccia et al. 37 hanno dimostrato che la concentrazione di SARS-CoV-2 RNA variava da due a tre ordini di grandezza maggiore nei fanghi primari rispetto alle acque reflue grezze a causa del più alto contenuto di solidi.
La presenza dell’RNA del virus nei fanghi sia primari che secondari è stata segnalata anche in 36, che hanno riscontrato che il numero di copie di SARS-CoV-2 in entrambi i tipi di fango era simile (Ct compreso tra 33,5 e 35,8 corrispondenti ai titoli di SARS- CoV-2 compreso tra 1,17 × 104 e 4,02 × 104 per litro).
Va notato a questo punto che la presenza della sequenza genetica del virus nei solidi dei fanghi non garantisce la virulenza del virus stesso [42]. Inoltre, sulla base dei dati attualmente disponibili, non è attualmente possibile definire con precisione il livello di contaminazione virale per i fanghi non trattati, né specificare un periodo di conservazione oltre il quale il virus viene inattivato. Ad oggi mancano anche le informazioni in relazione al campionamento, stoccaggio e trattamento dei fanghi di depurazione per la rilevazione di SARS-CoV-2.
Concentrazione di RNA virale nelle acque reflue come passaggio chiave nella metodologia di rilevamento
Concentrazione in matrici ambientali
Sono stati utilizzati vari metodi di concentrazione del campione in relazione alla rilevazione e quantificazione del virus in matrici ambientali complesse come le acque reflue.
La sfida principale dell’applicazione di tali metodi riguarda la bassa abbondanza di particelle virali e l’istituzione di Limiti di Rilevazione (LOD) sufficientemente bassi, che richiedono quindi l’utilizzo di metodi di concentrazione affidabili prima dell’estrazione dell’RNA virale [63].
Le acque reflue, a causa della loro elevata complessità chimica e biologica, possono provocare basse rese di recupero virale, o rese scarsamente riproducibili o entrambe [64], che possono ostacolare l’associazione di virus trasmessi dall’acqua a epidemie di malattie specifiche.
Inoltre, la complessa composizione delle acque reflue ostacola il facile rilevamento dei virus in tali matrici, poiché sia i componenti particolati che quelli disciolti intrinsecamente presenti nelle acque reflue si concentrano insieme al virus bersaglio e possono influenzare la resa di recupero del virus del metodo di concentrazione.
È quindi fondamentale per i metodi che producono un LOD sufficientemente basso da riflettere le concentrazioni più basse possibili del virus che possono essere presenti nelle acque reflue, che stimeranno accuratamente una prevalenza molto bassa di casi di COVID-19 all’interno della comunità.
Vari metodi, individuali o combinati (cioè primari e secondari), sono stati riportati nella letteratura scientifica per la concentrazione di virus da matrici acquatiche [65,66], tra cui la precipitazione di polietilenglicole (PEG) [67,68], ferrica precipitazione di cloruri (FeCl3) [69], flocculazione del latte scremato (SMF) [70], filtrazione con lana di vetro (GW) [71] o filtrazione per adsorbimento monolitico (MAF) [72], ultrafiltrazione (UF) [73] e ultracentrifugazione [ 74].
Il metodo di concentrazione per essere considerato efficace e applicabile deve essere tecnicamente semplice e veloce, essere in grado di trattare grandi volumi di acqua, fornire un’elevata resa di recupero virale, essere applicabile a una varietà di virus, essere ripetibile (all’interno di un laboratorio) ed essere riproducibile (tra laboratori) ed essere efficiente in termini di costi e tempi.
Finora non è stato dimostrato che un singolo metodo di concentrazione soddisfi tutti questi requisiti. Un’importante osservazione fatta è che l’effetto sulla diversità virale, specificità, rilevamento e composizione della comunità virale è risultato essere fortemente influenzato dal tipo di concentrazione e dal metodo di estrazione e viceversa (Hjelmsø et al., 2016).
Inoltre, è stato chiaramente dimostrato che le rese di recupero durante la concentrazione differiscono in modo significativo tra i virus senza involucro e quelli con involucro, con gli studi incentrati sui virus con involucro, come SARS-CoV-2, essendo limitati. Poiché i virus senza involucro e quelli con involucro possiedono caratteristiche strutturali distinte, è logico presumere che entrambi i tipi virali non si comportino in modo simile.
Pertanto, si prevede che il recupero di SARS-CoV-2 sarà diverso da quello dei virus senza involucro, un fatto che potrebbe comportare discrepanze elevate (ad esempio un ordine di grandezza) nella concentrazione del virus nelle acque reflue non trattate. Dato che è stato segnalato che il recupero dei virus senza involucro varia tra il tipo di virus e la matrice in esame [75], è evidente che è necessario utilizzare controlli della concentrazione virale per valutare l’efficienza del recupero.
Il recupero di vari virus e dei loro controlli surrogati in varie matrici, comprese le acque reflue e i fanghi di depurazione, è fornito nella revisione completa di Haramoto et al. [75]. Tuttavia, attualmente mancano informazioni rilevanti sui virus con involucro.
La precipitazione con PEG è risultata efficace per concentrare i virus umani in campioni ambientali, con una resa di recupero dell’86% per il virus dell’epatite A, dell’87% per il rotavirus scimmiesco e del 68% per il poliovirus [68]. È stato inoltre dimostrato che il metodo della concentrazione di PEG ha una percentuale notevolmente più alta di letture virali rispetto ai metodi SMF e GW, e il più alto recupero di norovirus murino (MNV) e adenovirus 35 (HAdV) è stato ottenuto con PEG seguito da MAF, GW, e SMF [63]. Invece, Falman et al. [69] hanno riferito che l’SMF ha determinato un recupero maggiore del poliovirus di tipo 1 (106 ± 24,8%) rispetto alla precipitazione di PEG / NaCl (59,5 ± 19,4%) nelle acque reflue.
Anche l’UF, che impiega il flusso tangenziale (cioè il flusso incrociato), è stato utilizzato con successo per la concentrazione di virus nelle acque reflue, ma le sfide dell’ingegneria come l’incrostazione della membrana e l’adsorbimento non reversibile di virus all’unità dei componenti di filtrazione possono influenzare la durata del concentrazione del campione e risultati in basse rese di recupero [64].
L’uso della prefiltrazione prima dell’UF per minimizzare i fenomeni di fouling può provocare la perdita di virus, soprattutto quando questi ultimi sono presenti in basse concentrazioni nella materia organica effluente che può essere trattenuta dalle membrane [46]. Fumian et al. [76] hanno impiegato l’ultracentrifugazione (100000 × g per 1 h), nonché una membrana elettronegativa seguita da concentrazione secondaria con un ultrafiltro centrifugo.
Il primo metodo di concentrazione ha determinato un recupero medio del 47% (intervallo del 34-60%) del rotavirus A dalle acque reflue, mentre è stato osservato un recupero medio inferiore del virus (3,5%, intervallo dell’1,5-5,5%) utilizzando la combinazione della membrana e dell’ultrafiltro. Nello studio di Prata et al. [74], è stato osservato un recupero virale medio (Adenovirus, Rotavirus) del 69% e del 76% rispettivamente per i campioni di acque reflue e di acque ricreative, mentre il metodo di flocculazione SMF ha portato a un recupero molto inferiore di entrambi i virus (38 e 22%, rispettivamente).
I risultati hanno anche mostrato che la filtrazione GW ha portato a recuperi più elevati del virus senza involucro Poliovirus 3 (57,9%) rispetto agli altri virus senza involucro (Coronavirus bovino = 18,1%, Rotavirus bovino gruppo A = 22,1%, virus della diarrea virale bovina [ tipo 1 e 2] = 15,6-19,7%) [77]. Blanco et al. [78] hanno utilizzato l’adsorbimento / eluizione su precipitazione GW e PEG per la concentrazione del virus della gastroenterite trasmissibile del coronavirus suino (TGEV) e del virus dell’epatite A senza involucro (HAV) in campioni ambientali.
I risultati hanno mostrato che il recupero di TGEV è stato migliorato aumentando il GW e il tempo di contatto dell’eluente e il pH di eluizione, aumentando la concentrazione di PEG o eseguendo l’eluizione mediante ricircolo o sotto agitazione. Inoltre, è stato riferito che l’aggiunta di un detergente (Tween 80) ha ostacolato il recupero del TGEV, degradando l’involucro contenente lipidi del virus.
Ye et al. [62] hanno valutato la precipitazione PEG, l’ultracentrifugazione e l’ultrafiltrazione per concentrare il virus MHV avvolto e il fago MS2 senza involucro nelle acque reflue.
I loro risultati hanno indicato che il metodo di ultracentrifugazione ha portato a rese di recupero trascurabili (∼5%) per entrambi i virus studiati, probabilmente a causa dell’effetto dell’elevata forza g applicata durante l’ultracentrifugazione sulla sopravvivenza virale. Inoltre, è stato rilevato che il 26% del coronavirus murino è stato adsorbito ai solidi rispetto al 6% per MS2, suggerendo che una parte delle particelle virali potrebbe essere stata rimossa dalla fase di centrifugazione.
Il metodo di precipitazione PEG ha anche prodotto un recupero basso (∼5%) per il virus MHV avvolto, mentre nel caso di MS2, il recupero è stato significativamente più alto (43,1%). Tuttavia, il metodo di ultrafiltrazione ha portato a un recupero del 25,1% di MHV e del 55,6% di MS2, indicando che è possibile ottenere recuperi più elevati per i virus senza involucro utilizzando questo metodo di concentrazione.
A seguito dell’epidemia di SARS-CoV-1 del 2003, Wang et al. [51] hanno valutato il recupero di SARS-CoV-1 e di un virus surrogato, il batteriofago f2, nelle acque reflue urbane e ospedaliere, utilizzando una particella di media filtrante elettropositiva (Al (OH) 3) impacchettata in una colonna di vetro. È interessante notare che il recupero del virus variava dallo 0% (acque reflue di un complesso residenziale) al 21,4% (acque reflue dell’ospedale), mentre il recupero del fago f2 nelle stesse condizioni è risultato essere significativamente più alto (33,6% -> 100%) .
Concentrazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue
Nel caso di SARS-CoV-2, sono stati utilizzati vari metodi di concentrazione, con l’ultracentrifugazione il metodo più studiato ([29] [preprint]; [21] [preprint]; [38]; [6] [prestampa]). In generale, le diverse matrici delle acque reflue, i diversi metodi di concentrazione e il fatto che esistono pochi studi che forniscono la resa di recupero del virus con i metodi di concentrazione utilizzati, non consentono un confronto sistematico tra i vari studi effettuati.
Il volume di acque reflue da concentrare può influenzare la resa del recupero virale e sembra che ci sia una discrepanza nella letteratura scientifica sul volume appropriato che ogni metodo di concentrazione richiede.
Secondo Haramoto et al. [79], concentrare un volume di <100 mL di acque reflue non trattate sembra essere considerato adeguato per rilevare virus enterici, mentre volumi più elevati (1 L) di campione sono stati suggeriti come in grado di ottenere un’alta concentrazione di virus enterici sia nelle acque reflue non trattate che trattate [80], a seconda ovviamente del metodo di concentrazione.
Nel caso del SARS-CoV-2, sono stati concentrati fino a 500 mL (volume minimo utilizzato: 100 mL) di acque reflue grezze ([21] [preprint]; [38]; [8] [preprint]; [26] ; [31] [prestampa]; [6] [prestampa]), mentre in un solo studio sono stati raccolti 2 litri di acque reflue non trattate [35]. Si evidenzia che un volume maggiore di campione di acque reflue dovrebbe essere utilizzato per la concentrazione del campione nelle regioni in cui il numero di casi registrati COVID-19 è basso e quindi si prevede che anche la prevalenza di SARS-CoV-2 nelle acque reflue sia bassa.
Un virus surrogato che possiede caratteristiche strutturali / molecolari simili (ad esempio forma, gruppi funzionali, carica superficiale, ecc.) Come SARS-CoV-2 è stato utilizzato come indicatore per valutare la resa di recupero dei metodi di concentrazione. Il virus dell’epatite murina avvolto (MHV), che appartiene alla famiglia dei Coronaviridae come SARS-CoV-2, è stato utilizzato come virus surrogato per valutare la resa di recupero di SARS-CoV-2 nelle acque reflue [35]. Il norovirus murino (famiglia Caliciviridae) è stato utilizzato anche come virus modello per virus sia con involucro che senza involucro [62,81].
Inoltre, per il valutare il recupero di SARS-CoV-2 nelle acque reflue [26]. Ci sono molti punti che devono essere presi in considerazione quando si utilizzano virus surrogati, come il livello del surrogato soprattutto quando vengono elaborati volumi elevati di acque reflue.
I valori di recupero riportati finora in relazione ai surrogati di SARS-CoV-2 variano notevolmente (3,3-73%), e attualmente non c’è consenso sulla soglia di resa di recupero. Questa grande variabilità dei recuperi dai diversi metodi applicati negli studi disponibili, impone l’ottimizzazione del metodo di rilevamento e quantificazione per misurazioni più affidabili che sono confrontabili tra loro, poiché un metodo con un 5% di recupero da virus surrogato a spillo non può essere direttamente comparabile con un metodo che ha mostrato un recupero del 73% della stessa surrogata.
Randazzo et al. [26] hanno utilizzato il ceppo CV777 del virus della diarrea epidemica suina (PEDV) e il mengovirus (MgV) vMC0 (CECT 100000) per valutare il metodo di adsorbimento-precipitazione dell’idrossido di alluminio seguito da ultracentrifugazione (1700 × g per 20 min e 1900 × g per 30 min).
Sia MgV che PEDV nell’influenza delle acque reflue hanno prodotto valori di recupero simili di 11 ± 2,1% e 11 ± 3,5% per PEDV e MgV, rispettivamente, indicando che sono necessarie più prove per il miglioramento del valore di recupero dei virus avvolti e dei loro surrogati nel complesso matrici come le acque reflue. D’altra parte, c’era una differenza significativa tra il recupero di PEDV (3,3 ± 1,6%) e MgV (6,2 ± 1,0%) negli effluenti delle acque reflue. Il recupero dei fagi RNA specifici per F mediante ultracentrifugazione (4654 × g per 30 min seguiti da 1500 × g per 15 min) è risultato essere del 73 ± 50% [38].
Secondo Medema et al. [38], non sono state osservate tendenze specifiche per il volume del campione elaborato e il recupero dei fagi, ed è stato suggerito che i fagi a RNA F-specifici non avvolti possono portare a una sovrastima dell’efficienza di recupero di SARS-CoV-2 avvolti.
In un altro studio condotto da Ahmed et al. [35], vari metodi di concentrazione (ad esempio adsorbimento-estrazione, precipitazione PEG, metodo del dispositivo di filtraggio centrifugo e ultracentrifugazione), sono stati valutati in relazione alla loro efficienza nel recuperare MHV da acque reflue non trattate. Il recupero dell’MHV è stato calcolato sulla base delle copie quantificate mediante RT-qPCR dividendo le copie del gene dell’RNA virale totale recuperate con quelle seminate.
I risultati hanno dimostrato che il recupero di MHV era compreso tra 26,7 e 65,7%, con i metodi più efficaci il metodo di adsorbimento-estrazione (sia in presenza che in assenza di pretrattamento con MgCl2) seguito da Amicon® Ultra- 15 dispositivo di filtraggio centrifugo. Il metodo di adsorbimento-estrazione con acidificazione e PEG ha prodotto il più basso recupero di MHV.
Un’osservazione interessante fatta è stata che il recupero di MHV ottenuto usando la precipitazione PEG (44%) era molto più alto del valore riportato in Ye et al. 62, e questo può essere attribuito al fatto che MHV era concentrato sia dalla frazione di acque reflue liquide che da quella solida, mentre in Ye et al. [62], la concentrazione del virus è stata eseguita solo dalla parte liquida.
I risultati di questo studio hanno evidenziato che la concentrazione del virus dovrebbe essere effettuata non solo nella fase liquida delle acque reflue, ma anche la frazione solida non dovrebbe essere trascurata.
27 Centrifugazione applicata con successo per rimuovere le particelle di grandi dimensioni nei campioni di acque reflue e concentrazione secondaria utilizzando allume o PEG (20 mg L-1), seguita da centrifugazione aggiuntiva, risultando in valori Ct positivi di SARS-CoV-2 di 33,6 e 33 per allume e PEG, rispettivamente.
Nello studio di La Rosa et al. [22], la concentrazione dei campioni è stata eseguita utilizzando il metodo PEG-destrano, secondo le linee guida dell’OMS per il poliovirus (quest’ultimo è stato adattato ai virus con involucro, e il trattamento con cloroformio incluso nel protocollo è stato trascurato per mantenere l’integrità dei virus ).
Il metodo della concentrazione di PEG in combinazione con la centrifugazione (40 mL, 12000 × g per 120 min) è stato utilizzato anche da 31. La concentrazione del campione con membrane elettronegative e ultrafiltrazione ha prodotto risultati incoerenti secondo lo studio di Ahmed et al. [34], poiché sono stati osservati valori diversi (positivi / negativi) per SARS-CoV-2.
Secondo gli autori, la logica alla base dell’uso della membrana elettronegativa era che i virus con involucro (ad esempio MHV, fago Φ6) mostrano un maggiore adsorbimento ai solidi rispetto ai virus senza involucro [62]. Ciò è anche in accordo con i risultati di Haramoto et al. [79], che hanno osservato un elevato adsorbimento del virus dell’herpesvirus koi avvolto (KHV) alle membrane elettronegative [79].
È ovvio che per la sua concentrazione nell’acqua di scarico è necessario un metodo su misura per il SARS-CoV-2 e l’ottimizzazione dovrebbe avvenire in termini di caratteristiche del campione e volume effettivo, considerando sia gli inibitori organici che quelli inorganici che potrebbero influenzare l’efficienza del recupero virale e successivamente rilevamento di virus.
Preoccupazioni in relazione all’estrazione dell’RNA di SARS-CoV-2 nei campioni di acque reflue
A seguito della concentrazione dei campioni di acque reflue, il processo di estrazione dell’RNA virale mira a ottenere l’RNA dalla matrice del campione, senza danneggiarlo. La scelta di un protocollo appropriato può essere una sfida, poiché la rottura delle particelle virali deve essere considerata senza danneggiare gli acidi nucleici, massimizzando al contempo il recupero degli acidi nucleici.
Le tre principali tecniche utilizzate per l’estrazione dell’RNA attualmente includono l’estrazione organica con l’uso di soluzioni come isotiocianato di fenolo-guanidina, tecniche di colonna di rotazione basate su membrana di silice e l’uso di particelle paramagnetiche.
Il primo, essendo il più popolare, presenta lo svantaggio della contaminazione del campione con proteine e altre sostanze come solventi organici come fenolo-cloroformio, sali ed etanolo [82]. Le colonne di silice e le tecniche di estrazione dell’RNA basate su particelle paramagnetiche non fanno uso di solventi organici e sono più semplici da usare, efficienti ed a basso costo, mentre hanno livelli inferiori di contaminazione da composti proteici e altri.
Tuttavia, nonostante i loro vantaggi, portano lo svantaggio di livelli potenzialmente elevati di contaminazione del DNA genomico [82].
I passaggi principali dell’estrazione dell’RNA in qualsiasi tipo di campione, sono i seguenti (altri metodi possono utilizzare alcuni passaggi o simili) (Tabella 3):
Lisi cellulare: la fase di lisi cellulare o interruzione cellulare porta alla rottura del confine esterno della membrana cellulare per il rilascio di RNA dalla cellula. Perline in ceramica, acciaio o silice (magnetiche e non) con spigoli vivi sono particolarmente utili per il danneggiamento fisico della membrana virale, per il rilascio degli acidi nucleici contenuti all’interno delle particelle virali.
Attualmente, una fase di lisi è incorporata nel processo di estrazione, dopo una fase di estrazione cellulare dalla matrice o direttamente all’interno della matrice, seguita dal recupero dell’acido nucleico rilasciato. La lisi cellulare virale può essere altrimenti ottenuta con l’uso di tamponi o reagenti come isotiocianato di guanidinio, cloruro di guanidinio, solfato di sodio dodecile (SDS) e altri.
A tal fine, soluzioni come TRIzol possono essere utilizzate per il mantenimento dell’integrità dell’RNA. Vari passaggi possono essere aggiunti da ciascun produttore, allo scopo di migliorare la purezza, la resa e il rilevamento degli analiti [ 83 ].
Denaturazione del DNA e delle proteine: la DNasi può essere utilizzata per la degradazione del DNA, mentre comunemente la proteinasi K è utilizzata per la digestione delle proteine. Altrimenti, l’estrazione organica utilizzando fenolo e cloroformio o sciogliendo il campione in tamponi che contengono sali di guanidio può essere utilizzata per la rimozione delle proteine.
Denaturazione e inattivazione delle RNasi: l’uso di qualsiasi agente caotropico organico come fenolo e cloroformio può essere efficace per l’inattivazione e la denaturazione della RNasi.
Separazione o rimozione di componenti cellulari: per separare l’RNA dal resto dei componenti cellulari presenti in una soluzione, è possibile aggiungere cloroformio seguito da centrifugazione, al fine di separare le fasi organiche da quelle acquose (componente RNA).
Recupero dell’RNA: il recupero dell’RNA dalla fase acquosa viene effettuato utilizzando alcol isopropilico o con acetato di ammonio o cloruro di litio per la precipitazione selettiva dell’RNA dal DNA.
Eluizione dell’RNA: il trattamento finale dell’RNA viene eseguito nella fase di eluizione, in cui l’RNA totale ottenuto durante l’estrazione dell’RNA viene eluito in 40-100 μL di tampone eluente.
Per quanto riguarda SARS-CoV-2, vari sistemi di estrazione sono stati qualificati e convalidati dal Center for Disease Control (CDC) degli Stati Uniti per l’uso con il pannello diagnostico RT-PCR in tempo reale 2019-nCoV. Tuttavia, il rapido aumento dei test durante la pandemia COVID-19 ha portato a una carenza globale di kit di estrazione disponibili in commercio. Pertanto, altri kit per l’estrazione di RNA non convalidati da CDC sono stati studiati da vari autori in relazione alla rilevazione e all’enumerazione di SARS-CoV-2 mediante RT-PCR.
Tuttavia, nessuno studio finora ha confrontato diversi metodi di estrazione dell’RNA al fine di stabilire la loro efficienza di estrazione dell’RNA nelle acque reflue influenti. A tal fine, non esiste alcuna standardizzazione dei protocolli di estrazione dell’RNA, per consentire un’estrazione comparabile del SARS-CoV-2 dalle acque reflue influenti, una matrice altamente complessa che contiene anche un’elevata varietà di composti, organici e inorganici, inibitoria verso l’analisi RT-qPCR.
Le principali difficoltà che possono essere affrontate durante l’estrazione dell’RNA e successivamente il rilevamento di SARS-CoV-2 in acque reflue influenti utilizzando una varietà di protocolli di estrazione di RNA e kit disponibili in commercio, includono l’ottenimento di quantità sufficienti di acido nucleico che possono derivare dalla lisi cellulare incompleta e dalla superficie legame di acidi nucleici, basse rese di acidi nucleici e variabilità inter e intra-processo [83].
Inoltre, un grado potenzialmente elevato di ripiegamento dell’RNA secondario che porta a bassa resa e difficile analisi a valle, una copia imprecisa durante la replicazione che porta a tassi di mutazione elevati può portare a una sottostima del contenuto di RNA e ad analisi RT-PCR imprecise.
Oltre alle sostanze interferenti introdotte dalla matrice, è necessario prestare attenzione durante l’estrazione dell’RNA di matrici complesse come le acque reflue influenti, che contengono varie molecole enzimatiche comprese le RNasi che degradano l’RNA, poiché l’RNA, una molecola a filamento singolo è più soggetto a danni e disintegrazione del DNA, una molecola a doppio filamento. Oltre al fatto che le RNasi sono abbondanti nelle matrici ambientali e anche sulle mani e sulle superfici, sono difficili da rimuovere o distruggere completamente.
Altri inibitori introdotti includono polvere per guanti, sali come cloruro di sodio e cloruro di potassio, molecole detergenti come EDTA, etanolo, fenolo e alcol isopropilico [84]. Pertanto, un’attenta manipolazione dei campioni e l’utilizzo di tecniche asettiche è fondamentale, insieme all’uso di reagenti e soluzioni privi di RNasi, nonché di vetreria e puntali per pipette privi di RNasi.
Tutte le sostanze che possono causare problemi al processo RT-PCR sono state collettivamente chiamate inibitori della PCR e l’impatto principale dell’inibizione parziale o totale della reazione è rispettivamente una ridotta sensibilità o risultati falsi negativi [85].
I composti inibitori della PCR includono ioni calcio, sali biliari, urea, fenolo, etanolo, polisaccaridi, sodio dodecil solfato (SDS) e altre proteine tra cui collagene, mioglobina, emoglobina e proteinasi [85,86].
Diverse fasi del processo possono essere influenzate dalla presenza di inibitori. Le nucleasi possono degradare l’RNA stampo prodotto dopo l’estrazione dell’RNA mentre i fenoli possono reticolarsi con l’RNA in condizioni ossidanti, portando a ostacolare il processo di estrazione dell’RNA.
I polisaccaridi presenti nelle acque reflue possono limitare la risospensione della capacità di RNA precipitato, mentre la melanina può inibire la trascrizione inversa. Il legame competitivo degli inibitori all’RNA stampo invece della ricottura del primer porta alla necessità di un’attenta progettazione del primer che mira a temperature di fusione più elevate [87].
La rilevazione di basse concentrazioni virali nelle acque reflue trattate o nelle acque dolci può richiedere la concentrazione di grandi volumi di campioni. Tuttavia, aumentare il volume del campione significa anche che la concentrazione del campione porta alla concentrazione di diversi inibitori nel campione, che interferiscono con le reazioni RT-PCR, come gli acidi umico e fluvico.
I metodi suggeriti per trattare la presenza di inibitori nei campioni includono estrazione con solvente, cromatografia su colonna e colonne di silice, resine a scambio cationico e sfere magnetiche di silice che purificano campioni complessi come le acque reflue.
La logica alla base del trattamento dei campioni prima dell’estrazione dell’RNA è utilizzare il capside virale per proteggere gli acidi nucleici virali. Un altro metodo ampiamente accettato di riduzione delle interferenze è la diluizione di campioni di acidi nucleici estratti, con conseguente diluizione immediata delle sostanze inibitorie.
Nonostante il vantaggio della riduzione dell’inibizione, c’è una diminuzione della sensibilità dovuta alla diluizione della concentrazione di acido nucleico negli estratti. Per questo motivo, è stata suggerita l’aggiunta di composti nell’RNA estratto che possono contrastare l’inibizione come betaina, albumina sierica bovina (BSA), glicerolo, detergenti non ionici, polietilenglicole (PEG) e inibitori della proteinasi [85,88] .
Aspetti RT-qPCR durante l’analisi SARS-CoV-2
Il principale metodo di rilevamento e quantificazione di SARS-CoV-2 in acqua e acque reflue è l’RT-qPCR, che si basa sulla presenza del test della sonda di rilevamento TaqMan. Questo tipo di analisi è specificamente progettato per aumentare la specificità delle reazioni qPCR e si basa su: a) l’attività di esonucleasi 5′-3 ‘della Taq polimerasi per scindere una sonda a doppia etichetta durante la fase di ibridazione di qPCR eb) fluoroforo- rilevamento basato. Durante la fase esponenziale del processo PCR, la quantificazione del prodotto è resa possibile attraverso il segnale fluorescente emesso.
Inoltre, questo saggio prevede l’etichettatura delle sonde con due diversi coloranti fluorescenti che emettono a diverse lunghezze d’onda. Più specificamente, la sonda è una sequenza (DNA o RNA oligo) che ha lo scopo di ibridare nella regione bersaglio del DNA tra due primer PCR.
Normalmente, la temperatura di annealing della sonda è più alta rispetto a quella dei primer PCR (primer forward, F e reverse, R). In questo modo, la sonda si ibrida con l’inizio dell’estensione dei primer. I due diversi coloranti fluorescenti sono il colorante “reporter” (R) che è attaccato all’estremità 5 ‘della sequenza della sonda e all’altra estremità della sequenza, viene sintetizzato un colorante “quencher” (Q).
I coloranti comuni per il test della sonda di rilevamento TaqMan includono tra gli altri i coloranti reporter 6-carbossifluoresceina (FAM), carbossirodamina (ROX) e tetraclorofluoresceina (TET) [89]. I quencher, il cui ruolo è l’estinzione della fluorescenza emessa dal reporter quando eccitato da una sorgente di luce quando il fluoroforo si trova in prossimità del quencher, includono Black Hole Quencher (BHQ), TAMRA e Deep Dark Quencher I e II [90 ].
I dosaggi TaqMan che sono stati utilizzati finora per la rilevazione e la quantificazione degli acidi nucleici SARS-CoV-2 nelle acque reflue, mirano ai geni della proteina nucleocapside del virus (N1, N2 e N3), alla RNA polimerasi (RdRp) dipendente dall’RNA busta (E) del virus [91].
La discriminazione del materiale genetico SARS-CoV-2 da altri tipi di SARS-CoV, incluso SARS-CoV correlato ai pipistrelli, è stata resa possibile grazie alla disponibilità di due diverse sonde fluorescenti per il gene RdRp. Tuttavia, è stato dimostrato che il test RT-qPCR per il gene E può reagire con SARS-CoV-2 e con SARS-CoV [46]. Ci sono rapporti che solo i tre test di rilevamento del gene della proteina N hanno funzionato bene per il rilevamento di SARS-CoV-2 [46,92].
Ahmed et al. [4] riportano che tra cinque diversi test RT-qPCR (CDCN1, CDC N2, N_Sarbeco, NIID_2019-nCoV_N e E_Sarbeco), il test CDC N1 ha dimostrato di essere il più sensibile mentre N_Sarbeco ha mostrato la sensibilità minore, mentre i campioni tra i campioni di acque reflue di una nave da crociera e tre aeromobili erano vicini al LOD del test (da 37 a 40 cicli), fornendo risultati incoerenti tra i test testati.
A tal fine, vari protocolli e regioni del gene bersaglio sono stati raccomandati per la ricerca da parte di organizzazioni nazionali e internazionali, tra cui il primer del protocollo Charité, Berlino (OMS) e il pannello di sonde che include primer e sonde RdRp e E_Sarbeco (gene E) e il CDC ha pubblicato un pannello diagnostico RT-PCR in tempo reale che include tutti i materiali, i reagenti e le linee guida necessarie per il rilevamento qualitativo di SARS-CoV-2 [48,49].
I primer e le sonde inclusi nelle linee guida CDC includono i primer e le sonde per il rilevamento specifico dei geni N1, N2 e RdRp, il cui controllo di qualità e autorizzazione sono stati completati (US CDC, 2020). Tuttavia, va sottolineato che questi saggi sono stati sviluppati per campioni clinici e non per quelli ambientali, rendendo la loro applicazione una che richiede ulteriore attenzione nelle analisi basate sulle acque reflue.
È importante notare che un risultato positivo per uno su tutto il dosaggio dei geni target, non garantisce la presenza di SARS-CoV-2 nei campioni analizzati. Risultati falsi positivi possono influenzare il processo analitico in assenza di procedure di controllo di qualità valide e coerenti, a causa della potenziale contaminazione incrociata dei test qPCR.
Inoltre, la mancata conferma del risultato positivo di un gene target con un secondo gene target, può far dubitare dell’effettiva presenza del virus.
Per evitare l’errata interpretazione della contaminazione di laboratorio dei campioni come risultati falsi positivi, si raccomanda l’uso di sequenze specie-specifiche di controlli positivi (sintetici o naturali), che contengono una sequenza facilmente rilevabile con la metodologia RT-qPCR applicata [93].
D’altra parte, 24 suggeriscono la conferma della specificità della reazione e quindi l’eliminazione di qualsiasi preoccupazione circa la reattività crociata dei saggi SARS-CoV-2 con organismi non testati o virus non caratterizzati, attraverso l’assenza di amplificazione nel controllo negativo o ‘bianco ‘ campioni.
Un elenco completo dei test disponibili per primer e sonda disponibili da istituzioni e organizzazioni riconosciute e adottati dall’Organizzazione mondiale della sanità (OMS), è fornito nella Tabella 4.
Nonostante la disponibilità di pochi set di test di primer e sonde disponibili per il rilevamento e la quantificazione del SARS-CoV-2, c’è una mancanza di coerenza nelle combinazioni di set di test utilizzati, in ogni studio disponibile, finora. Più in dettaglio, ogni studio disponibile utilizza una diversa combinazione di saggi primer e sonda (Tabella 5).
Questa eterogeneità analitica porta anche lo svantaggio intrinseco della sensibilità differenziata di ciascun dosaggio, in particolare a un numero ridotto di copie / volume di SARS-CoV-2 del campione, che è determinato dal LOD della reazione RT-qPCR, l’efficienza dell’elaborazione del campione (concentrazione del campione ed estrazione di RNA) e le condizioni di ciclo presenti.
È stata osservata una differenza nelle prestazioni dei test SARS-CoV-2 a causa delle differenze nell’efficienza di innesco, nei protocolli utilizzati e nella struttura secondaria e / o stabilità dell’RNA virale. Come affermato da Bustin e Nolan [94], i primer sono il singolo componente più critico di un saggio RT-qPCR affidabile, poiché le loro proprietà influenzano la specificità e la sensibilità del metodo. Di conseguenza, uno scarso disegno sperimentale in combinazione con reazioni scarsamente ottimizzate può portare a risultati falsi negativi [95].
Tabella 4
Adottato dall’Organizzazione mondiale della sanità (2020).
| Istituzione | Obiettivi genetici |
|---|---|
| US CDC, USA | N1, N2, N3 |
| Carità, Berlino, Germania | RdRp, E, N |
| China CDC, China | ORF1ab e N |
| Istituto Pasteur, Francia | Due obiettivi in RdRp (IP2 e IP4) |
| Istituto nazionale di malattie infettive, Giappone | Pancorona e bersagli multipli, proteina Spike |
| HKU, Hong Kong | ORF1b-nsp14, N |
| Istituto nazionale di sanità, Thailandia | N |
Come già affermato nel lavoro precedente, è necessario un LOD sufficientemente basso per testare campioni con una bassa concentrazione di virus, principalmente a causa degli effetti di diluizione della concentrazione del virus e della bassa prevalenza del COVID-19. Ciò può essere ottenuto migliorando ulteriormente la sensibilità analitica dei saggi SARS-CoV-2 esistenti nelle acque reflue, utilizzando metodi di concentrazione ed estrazione in grado di recuperare più del 50% dell’RNA di SARS-CoV-2 dalle acque reflue [4].
Tuttavia, molti degli studi documentano in modo inefficace le misure di controllo della qualità del loro studio, incluso il LOD del loro metodo. I rapidi sviluppi durante la pandemia COVID-19 e la necessità di applicare test e screening rapidi dei campioni, hanno portato a una mancanza di raccolta coerente dei dati negli studi prodotti e quindi a una mancanza di informazioni sul LOD e sul controllo di qualità nei lavori pubblicati.
L’utilizzo di controlli di processo per tenere traccia dei livelli di recupero dell’obiettivo e dell’efficienza della misurazione è fondamentale. L’applicazione di tali misure di controllo della qualità previene la comparsa di risultati falsi negativi e assicura all’analista che anche concentrazioni molto basse di SARS-CoV-2 in matrici complesse come le acque reflue influenti possono essere rilevate con i metodi utilizzati, per rilevare accuratamente basse incidenze di COVID-19 all’interno delle comunità esaminate.
La potenziale inibizione della misurazione derivante da ogni fase del processo di trattamento / analisi del campione è anche più evidente dopo l’uso dei controlli di processo, che secondo Haramoto et al. [75] tre tipi: i) controlli surrogati dell’intero processo da inoculare in un campione di acqua prima della concentrazione del virus, ii) controlli del processo molecolare inoculati nel concentrato virale e iii) controlli RT-qPCR che devono essere inoculati prima di RT-qPCR.
Soprattutto l’inoculo prima della RT-qPCR di un virus di controllo surrogato positivo, insieme ai controlli negativi appropriati e ai controlli senza templato, fornisce prove adeguate della potenziale contaminazione del campione e del reagente, della bassa efficienza di reazione e della necessità di un’ulteriore ottimizzazione del processo.
Per aumentare la robustezza dei risultati RT-qPCR e garantire l’assenza di risultati falsi positivi di una selezione così diversificata di saggi applicati finora nei diversi lavori di ricerca, il sequenziamento dei campioni positivi è stato altamente raccomandato. Oltre alla conferma della presenza del virus specifico, è possibile identificare l’origine filogenetica e le mutazioni dei ceppi del virus SARS-CoV-2 presenti nei campioni positivi amplificando le regioni filogeneticamente informative ([8] [preprint]).
Anche il controllo delle prestazioni e dell’efficienza del processo è fondamentale nella procedura di garanzia della qualità, poiché il confronto di due o più reazioni in cui una condizione è cambiata (ad esempio miscele di reazione diverse, strumenti diversi ecc.) È abilitato solo una volta che è stato assicurato che tutto il processo sono stati verificati i passaggi e i parametri associati. Per ottenere il confronto intra e interlaboratorio di processi e risultati di successo, è quindi importante valutare i seguenti parametri associati all’efficienza del processo [96]:
i) L’intervallo dinamico lineare è la variazione matematica della pendenza o dell’efficienza durante il test di diluizioni seriali dello stesso campione, in repliche. L’analisi ripetuta della stessa diluizione fornisce una deviazione standard che fornisce informazioni sulla capacità di ripetere una singola misurazione.
ii) R2value è un termine statistico che indica quanto è buono un valore nel predirne un altro e varia da 0 a 1. Un valore R2 superiore a 0,99 fornisce una buona fiducia statistica nella correlazione tra due valori.
iii) La precisione è stimata attraverso la deviazione standard tra le misurazioni. Più la maggior parte delle misurazioni si avvicina al valore medio, minore è la deviazione standard. Ad esempio, in un’analisi PCR efficiente al 100%, la differenza tra le successive misurazioni di diluizione seriale è prossima a 1.
iv) La sensibilità è la capacità di un sistema di amplificare e rilevare con successo una copia del modello iniziale. Per ottenere un’elevata sensibilità di misurazione, sarebbe necessario un numero elevato di repliche per un’elevata significatività statistica.
Per quanto riguarda l’aspetto analitico RT-qPCR del SARS-CoV-2 nelle acque reflue, è stata dimostrata negli ultimi mesi un’enorme varietà di reagenti selezionati utilizzati per la rilevazione e il conteggio degli acidi nucleici del virus. Dopo l’estrazione dell’RNA, la qualità dell’RNA (concentrazione o rapporti 260/280 e 230/260).
Come mostrato nella Tabella 5, è evidente che ogni studio utilizza miscele di reazione PCR differenti, che possono avere una diversa efficienza di reazione con i primer specifici. La composizione di ciascuna miscela di reazione PCR (concentrazione di sale, livello di pH) può avere un impatto sulla soglia dei valori Ct e quindi delle relative concentrazioni virali, nei casi di quantificazione.
La varietà osservata nei reagenti e nella metodologia, evidenzia la necessità di ottimizzazione del metodo e dei reagenti tra i laboratori di prova, per garantire che le analisi vengano svolte in modo coerente e corretto, con tutti i controlli e controlli di qualità necessari lungo tutto il processo.
Reporting dei risultati
Un aspetto chiave tra gli studi condotti sulla presenza e la quantità di SARS-CoV-2 nelle acque reflue è il tipo di report e la capacità di eseguire confronti interlaboratorio tra gli studi. Finora, i risultati degli studi disponibili sono stati riportati in due modi distinti, in base al tipo di risultato ricercato (Tabella 6):
i) assenza o presenza del virus sotto forma di valori Ct riportati direttamente dallo strumento qPCR utilizzato e
ii) copie geniche / volume di campione, con l’utilizzo di una curva di calibrazione quantitativa dei valori Ct rispetto a concentrazioni note del virus per il calcolo delle copie geniche presenti in un determinato volume campione (quantificazione relativa).
Il valore Ct comprende un’intersezione tra la curva di amplificazione qPCR e una linea di soglia ed è una misura relativa della concentrazione del gene target, attraverso l’emissione di fluorescenza basata sulla concentrazione del frammento del gene target nei campioni analizzati.
Il segnale di fluorescenza viene registrato durante ogni ciclo e rappresenta la quantità di prodotto amplificata durante la fase esponenziale della reazione qPCR fino a quel punto, mentre una quantità maggiore di templato porta a un minor numero di cicli (valori Ct) necessari per registrare un segnale fluorescente al di sopra del sfondo.
Tuttavia, gli aspetti importanti dei risultati del valore Ct non sono sempre presentati negli studi disponibili, finora. Più specificamente, secondo Bustin e Nolan [94], i valori Ct sono soggetti a variazione tra le serie e non dovrebbero essere trasmessi senza adeguati standard di calibrazione.
Inoltre, gli artefatti nella miscela di reazione preparata possono modificare la fluorescenza associata a Ct e ai successivi calcoli di quantificazione, determinando variazioni di Ct indipendenti dal modello. Inoltre, la quantificazione effettuata in condizioni di bassa efficienza può portare a una curva di calibrazione diversa con una pendenza diversa rispetto a una in condizioni di alta efficienza, per la stessa concentrazione target.
Basse concentrazioni della sequenza target possono portare ad un accoppiamento inadeguato dei primer con il templato durante i primi cicli qPCR. Di conseguenza, diverse frazioni del modello possono essere amplificate, portando a una grande variabilità che offre un elevato margine di incertezza.
Il calcolo delle copie geniche / volume di campione deve essere preparato con cura, inizialmente con il calcolo del Ct medio da repliche tecniche associate, seguito dal calcolo della quantità relativa di copie geniche dopo la stima dell’efficienza del processo ed infine dal enumerazione delle copie geniche per volume di campioni insieme all’esecuzione di analisi statistiche.
Oltre ad applicare le misure di controllo della qualità necessarie per garantire la qualità dei risultati, è importante quando si pubblicano dati sperimentali qPCR, assicurarsi che i dati siano conformi alle linee guida MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative real-time PCR) [97].
Queste linee guida forniscono un quadro chiaro della conduzione dell’esperimento qPCR e linee guida sull’uso dei risultati qPCR nei manoscritti scientifici, con lo scopo di ottenere dati riportati di alta qualità coerenti, confrontabili e omogeneizzati.
Secondo le linee guida MIQE, è importante fornire informazioni dettagliate sui metodi di analisi dei dati, la stima della fiducia e il software utilizzato. Anche il reporting della precisione del dosaggio con l’uso di metodi statistici per l’analisi delle varianze è fondamentale, insieme al report della concentrazione delle copie geniche / volume del campione, per i risultati riportati quantitativi e qualitativi.
L’analisi qualitativa (segnalazione della presenza / assenza dei bersagli del gene SARS-CoV-2) ha dimostrato di essere un metodo di segnalazione molto utilizzato. Tuttavia, una valutazione qualitativa della presenza dei geni bersaglio del virus richiede ancora la valutazione della sensibilità del test qPCR a concentrazioni target molto basse per dimostrare se effettivamente il metodo applicato può rilevare anche poche copie geniche del virus.
Pertanto, è essenziale riportare nella letteratura scientifica le caratteristiche delle prestazioni del test, compreso l’intervallo dinamico lineare, l’R2, la precisione, la sensibilità e il LOD del metodo applicato. Inoltre, le differenze nell’abbondanza e nell’efficienza di recupero di SARS-CoV-2 tra i diversi studi, potrebbero non essere dovute all’effettiva concentrazione del virus trovato nelle acque reflue, ma a causa di discrepanze metodologiche attualmente esistenti, inclusi i metodi di concentrazione, le strategie di estrazione dell’RNA e ha utilizzato test RT-qPCR [30].
Sfortunatamente, le restrizioni pandemiche COVID-19 all’accesso al laboratorio, all’acquisto di standard e reagenti appropriati per validare efficacemente i saggi applicati, hanno reso difficile il confronto di studi diversi, migliorando allo stesso tempo i controlli di qualità utilizzati all’interno di ogni esigenza di laboratorio da migliorare secondo standard convalidati come le linee guida MIQE.
Gli studi attualmente disponibili forniscono una buona base per la valutazione preliminare della concentrazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue, in relazione al numero di pazienti COVID-19 nel bacino di utenza. Per poter utilizzare le informazioni ottenute al framework SARS-CoV-2 WBE, è necessario essere in grado di associare con precisione le copie geniche / volume dei risultati del campione, alla prevalenza dei casi COVID-19 all’interno del WWTP- comunità servita.
Questa stima richiede una conoscenza di base a cui resta ancora da rispondere, per raggiungere la rete fognaria, il numero di individui malati, il tasso di diffusione del virus nelle feci umane e l’intervallo di tempo all’interno di questo spargimento. Uno sforzo è stato fatto da Medema et al. ([21] [preprint]; [38]) per stimare la prevalenza di persone infette tra una popolazione UWTP che può produrre segnali positivi durante l’analisi delle acque reflue per il virus.
I risultati hanno mostrato una prevalenza di 0,1 casi su 100000 quando si utilizzano target N1 e N2 [38], mentre i target N3 ed E hanno fornito un segnale positivo a 3,5 casi su 100000 persone [21] [preprint]. Un altro studio di Jorgensen et al. [99] [preprint] ha stimato che un segnale positivo dell’RNA virale nelle acque reflue può essere prodotto se ci sono circa 3 casi ogni 10000 persone. Tuttavia, è evidenziato dagli autori che questa stima si basa su ipotesi che possono probabilmente trasmettere una precisione inferiore a quella normalmente accettata.
Inoltre, è necessaria la quantità di tempo di viaggio una volta nella rete fognaria, verso l’UWTP. Tuttavia, un aspetto importante del COVID-19 da considerare è il tempo di permanenza del virus in ciascun individuo malato, tenendo presente che anche le persone asintomatiche o paucisintomatiche (pochi sintomi) che non sono state incluse nelle stime del COVID-19 contribuiscono al SARS-CoV-2 nelle acque reflue.
A livello comunitario, per guidare lo sviluppo della metodologia analitica di SARS-CoV-2 nelle acque reflue in avanti, la determinazione del numero minimo di casi COVID-19 presenti all’interno di una comunità che consenta il rilevamento e la quantificazione esatta di SARS-CoV- 2 nelle acque reflue resta da esplorare.
Negli studi attualmente disponibili, è stato osservato un cambiamento nella concentrazione di SARS-CoV-2 RNA al variare del numero di casi di COVID-19 ([27] [preprint]; [38]). È interessante notare che nello studio di Medema et al. [38], è stato dimostrato che le pendenze del gene target quantificato N1 e N2 cambiano in base alla prevalenza di COVID-19, di 0,1 casi per 100000 persone equivalenti, qualcosa che non è stato notato nel caso del gene target N3, suggerendo una ridotta sensibilità della concentrazione di questo gene alla prevalenza dei casi nell’area UWTP servita.
Inoltre, in uno studio di 27, i valori Ct di SARS-CoV-2 RNA (gene E) sono stati correlati al numero generale di individui positivi a COVID-19 a Tel Aviv, con un alto valore di correlazione R2 (R2 = 0,998) . 6 ha anche dimostrato un aumento della concentrazione di SARS-CoV-2 insieme ai casi COVID-19, fornendo anche prove indirette di una significativa riduzione della trasmissione del virus (tramite concentrazioni di SARS-CoV-2 nelle acque reflue) a seguito delle misure di blocco a Parigi.
D’altra parte, Randazzo et al. [26] hanno mostrato una concentrazione media di 5,4 ± 0,2 log10 copie geniche / L (N1, N2, N3) nelle acque reflue influenti in Spagna senza un’associazione ai casi COVID-19 nel bacino di utenza UWTP, evidenziando la necessità di un miglioramento quantitativo modello che include ulteriori informazioni sulle variabili che influenzano i dati delle acque reflue, per una migliore interpretazione delle informazioni disponibili.
Tuttavia, le limitazioni che abbracciano la metodologia di rilevamento in generale, come discusso nel presente documento, impongono limitazioni al nesso di causalità che possono prevalere nei casi COVID-19, alla concentrazione di SARS-CoV-2. Nonostante i risultati attuali, tutti gli studi disponibili riconoscono il fatto che un confronto assoluto tra i casi COVID-19 con SARS-CoV-2 RNA è ancora difficile, a causa della variabilità nel test e nella segnalazione dei casi COVID-19 in ciascun paese, nonché il quadro normativo in vigore per quanto riguarda i test di COVID-19.
Prossimi passi nello sviluppo della metodologia
La discussione qui fornita ha presentato gli aspetti principali della metodologia di rilevamento e quantificazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue da considerare. La revisione delle informazioni disponibili ha quindi portato all’ideazione e alla proposta di punti chiave che, se considerati collettivamente, possono portare a miglioramenti significativi del lavoro di ricerca prodotto, a livello mondiale. I punti chiave suggeriti, in base alla fase del processo a cui appartengono, sono forniti in Fig.1.
Punti chiave suggeriti in base a ciascuna fase del processo della metodologia SARS-CoV-2 da considerare.
Deve essere effettuata una valutazione sistematica di ogni fase della metodologia applicata per assicurare la qualità dei risultati e la loro accuratezza. Ciò può essere ottenuto mediante l’applicazione di controlli dell’efficienza di recupero del virus esaminato e dei relativi surrogati, e di controlli di qualità in ogni fase della metodologia (LOD, LOQ, controlli positivi, controlli negativi). Anche la valutazione dei parametri associati all’efficienza del processo è di fondamentale importanza per la credibilità del processo e del risultato.
Questi parametri (es. Intervallo dinamico lineare, valore di R2, precisione, sensibilità) forniscono la base per confronti intra e interlaboratorio di processi e risultati differenti, poiché vengono valutati risultati grezzi. Inoltre, l’omogeneità della comunicazione dei risultati è un altro aspetto chiave che deve essere ottimizzato tra i gruppi di ricerca e gli studi.
Il reporting omogeneo consente il confronto globale e la valutazione dei risultati nonostante l’uso di metodi diversi tra i gruppi di ricerca, fornendo anche una base per ulteriori collaborazioni e la creazione di database che mireranno alla raccolta di tutte le informazioni rilevanti in un unico luogo per tutte le parti interessate.
Una maggiore affidabilità metodologica e una stima affidabile dei casi infetti in una data popolazione che sono necessari per un segnale analitico positivo nelle acque reflue, forniranno inoltre uno strumento aggiuntivo al settore sanitario per la valutazione dello stato di una malattia infettiva come COVID-19 prima la sua diffusione nella comunità, specialmente in aree che includono zone vulnerabili a malattie infettive come campi profughi, residenze per anziani e strutture mediche [98].
In questo modo, le zone di infezione ‘picchi’ che potrebbero non avere pazienti sintomatici possono essere rilevate in modo tempestivo, consentendo misure e precauzioni precoci per prevenire l’ulteriore diffusione della malattia, rendendo WBE uno strumento davvero potente per la protezione della popolazione. e salute ambientale.
link di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7384408/
Ulteriori informazioni: Jordan Peccia et al. La misurazione dell’RNA di SARS-CoV-2 nelle acque reflue tiene traccia delle dinamiche di infezione della comunità, Nature Biotechnology (2020). DOI: 10.1038 / s41587-020-0684-z
