Ranitidina bismuto citrato (RBC) è un potenziale agente antivirale per Covid-19

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Un farmaco antimicrobico economico usato per trattare le ulcere gastriche e le infezioni batteriche ha mostrato risultati promettenti nella lotta al coronavirus negli animali, lo hanno annunciato lunedì gli scienziati di Hong Kong.

I ricercatori hanno deciso di esplorare se i metallodrugs – composti contenenti metalli più comunemente usati contro i batteri – potrebbero anche avere proprietà antivirali che potrebbero combattere il coronavirus SARS-CoV-2.

Utilizzando criceti siriani come soggetti di test, hanno scoperto che uno dei farmaci, la ranitidina citrato di bismuto (RBC), era “un potente agente anti-SARS-CoV-2”.

“RBC è in grado di abbassare di dieci volte la carica virale nel polmone del criceto infetto”, ha detto lunedì ai giornalisti Runming Wang, ricercatore dell’Università di Hong Kong, mentre il team ha presentato il loro studio.

“I nostri risultati dimostrano che RBC è un potenziale agente antivirale per Covid-19″.

Il coronavirus ha ucciso più di un milione di persone da quando è emerso per la prima volta in Cina lo scorso dicembre e poi si è diffuso in tutto il mondo.

Mentre gli scienziati si affrettano a trovare un vaccino, hanno anche setacciato farmaci prontamente disponibili che potrebbero alleviare i sintomi causati dalla malattia di Covid-19 o aiutare il corpo a combattere le infezioni.

Remdesivir, un farmaco antivirale ad ampio spettro, e desametasone, un tipo di corticosteroide, sono stati entrambi identificati come aventi un certo successo contro il virus. Entrambi sono stati utilizzati dai medici per curare il presidente degli Stati Uniti Donald Trump dopo aver contratto il Covid-19.

Ma hanno degli svantaggi.

Remdesivir è costoso e c’è una carenza globale, mentre il desametasone ha effetti immunosoppressivi che sono rischiosi per tutti tranne i pazienti più malati. Altri cocktail di droga hanno dimostrato che il danno al fegato può essere un rischio.

Gli scienziati di Hong Kong hanno affermato che l’RBC è un farmaco comunemente disponibile usato contro le ulcere gastriche con un profilo farmacologico sicuro e completo.

“È stato utilizzato per decenni, quindi è abbastanza sicuro”, ha detto Wang.

Hanno aggiunto che la loro ricerca, che è stata pubblicata sulla rivista Nature Microbiology, ha suggerito che anche altri metallodrugs potrebbero avere successo contro il virus e dovrebbero essere ulteriormente esplorati.


I complessi di bismuto inibiscono il coronavirus della SARS

la sindrome respiratoria acuta (SARS) è un tipo grave di polmonite che è stato riconosciuto per la prima volta alla fine del 2002 e successivamente è stato dimostrato essere causato dal coronavirus SARS (SCV) .1

Il genoma di SCV è stato sequenziato entro poche settimane dall’identificazione iniziale2, 3 e ulteriori analisi hanno rivelato che l’SCV è più strettamente correlato ai coronavirus del gruppo 2.4 È noto che i virus simili a SCV hanno una varietà di serbatoi animali tra cui civette delle palme, cani procione, e pipistrelli a ferro di cavallo.5, 6

SCV è anche in grado di infettare i gatti, il che avverte di ulteriori possibili vie di trasmissione del virus.7 Le misure di sorveglianza e controllo delle infezioni hanno contenuto con successo l’SCV nel 2003, ma il trattamento sarà l’unica possibilità se il virus riemerga prima che un vaccino efficace abbia stato sviluppato.

Le proteine ​​SCV S, 8 proteinasi principali, 9, 10 proteinasi cisteina, 11 nucleoside trifosfato idrolasi (NTPasi) / elicasi, 11, 12 e RNA polimerasi13 sono state tutte identificate come potenziali bersagli per la terapia antivirale e sono già state sottoposte a caratterizzazione preliminare.

In precedenza abbiamo sovraespresso e caratterizzato biochimicamente la proteina SCV NTPasi / elicasi (nsp13 ‐ pp1ab) e abbiamo scoperto che appartiene a una classe distinta di elicasi virali da 5 ′ a 3 ′12 che sono analoghe all’elicasi strettamente correlata del coronavirus umano 229E.14

È stato anche dimostrato che la NTPasi / elicasi SCV ha attività di capping dell’RNA ed è in grado di svolgere sia l’RNA che i duplex del DNA.15 Le elicasi sono state precedentemente identificate come bersagli attraenti per la progettazione di farmaci antivirali.16, 17 Abbiamo precedentemente identificato inibitori dell’elicasi SCV che inibisce il virus in colture cellulari da una libreria diversificata di oltre 50.000 composti.18 Inoltre, abbiamo caratterizzato le bananine come una classe di composti che possono inibire sia l’elicasi che il virus nelle colture cellulari.19

Un dominio di legame metallico (MBD) ricco di cisteina 100 residui si trova all’estremità N della proteina SCV elicasi. È stato dimostrato che l’analogo MBD di un arterivirus helicase strettamente correlato è coinvolto nella sintesi dell’mRNA subgenomico, nella replicazione del genoma e nella biogenesi del virione.20

In precedenza abbiamo mostrato un’interazione cisteina-bismuto insolitamente forte nelle metallotioneine21 e quindi abbiamo testato l’ipotesi che gli ioni bismuto potrebbero legarsi all’interno del MBD, influenzando così le attività enzimatiche dell’elicasi.

Nella nostra serie iniziale di saggi, abbiamo testato i composti del bismuto per la loro capacità di inibire l’attività dell’oligonucleotide (oligo‐ (dT) 24) ‐ stimolata ATPasi (ATP = adenosina 5′ ‐ trifosfato) della SCV NTPasi / elicasi (Figura 1) .12, 22 Il rilascio di fosfato dovuto all’idrolisi dell’ATP è stato misurato a varie concentrazioni di ciascuno dei potenziali inibitori ed è espresso come percentuale del tasso di ATPasi in assenza di inibitore

(vedi http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf).

Questo screening primario ha rivelato che i composti a base di bismuto sono inibitori efficaci dell’elicasi SCV.

Nitrilotriacetato di bismuto ([Bi (nta)]), nitrato di bismuto ([Bi (nit)]), complesso di tricisteina di bismuto ([Bi (cys) 3]) e ranitidina citrato di bismuto (RBC) sembravano essere gli inibitori più efficaci di Attività dell’ATPasi, tutti che mostrano una significativa inibizione a una concentrazione di 1 μm (Figura 1 a).

La somiglianza nel potenziale inibitorio di questi tre composti suggerisce che lo ione bismuto gioca il ruolo chiave negli effetti inibitori. Il bismuto etilendiamminotetraacetato ([Bi (edta)]) era un inibitore sorprendentemente scarso, indicando che i gruppi complessanti non dovrebbero legarsi al bismuto (Bi3 +) troppo strettamente. A causa dell’uso clinico di RBC, abbiamo scelto questo composto per ulteriori studi.

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Figura 1
Inibizione dell’attività ATPasi dell’SCV elicasi da parte di vari complessi di bismuto. a) Attività ATPasi dell’SCV elicasi in presenza di una concentrazione di 50 μm (sinistra) o 1 μm (destra) di vari potenziali inibitori. L’attività dell’ATPasi è espressa come percentuale dell’attività in assenza di inibitore (che rappresenta il 100%). b) Titolazione dell’attività ATPasi dell’SCV elicasi con RBC in presenza di 1 μm U24 (□), in presenza di 1 μm (dT) 24 (▵), o in assenza di polinucleotide (○). I dati sono stati normalizzati rispetto all’attività in assenza di inibitore.

Per indagare se i globuli rossi inibissero in modo specifico l’RNA o l’attività stimolata dal DNA o l’attività basale dell’ATPasi dell’elicasi, abbiamo eseguito tre serie identiche di esperimenti in presenza di oligo ‐ U24 (come un RNA mimico) in presenza di oligo‐ (dT ) 24 (come mimico del DNA) o in assenza di oligonucleotide.

Come mostrato nella Figura 1 b, l’RBC inibisce l’attività dell’ATPasi stimolata da DNA e RNA, così come l’attività ATPasi non stimolata dell’elicasi in misura simile. I valori di IC50 sono stati calcolati adattando l’equazione logistica per l’inibizione dei globuli rossi a ciascun set di dati: IC50 = 248 (± 75), 350 (± 82) e 377 (± 92) nM per ATPasi stimolata da U24, (dT) stimolata da 24 ATPasi e ATPasi non stimolata.

Dopo aver stabilito che l’RBC potrebbe inibire efficacemente le attività dell’ATPasi dell’elicasi, abbiamo quindi esaminato se potesse anche inibire l’attività di svolgimento del duplex. Abbiamo utilizzato un saggio radio sviluppato in precedenza (vedere http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf) 12 che misura l’inibizione della capacità dell’elicasi di separare i due filamenti di una piccola molecola di DNA (5T-DNA).

Questo comprendeva un oligonucleotide corto etichettato con 32PO4 all’estremità 5 ‘(Figura 2 a, “ss”, il filo rilasciato) ricotto in un filo più lungo complementare, generando un duplex parziale (Figura 2 a, “ds”) con un filo 5’ sbalzo poly‐ (dT).

Esperimenti di separazione duplex sono stati eseguiti su una gamma di concentrazioni di globuli rossi. Abbiamo osservato che il duplex era quasi completamente svolto in assenza di RBC (Figura 2 a, corsia A); tuttavia, l’attività era significativamente inibita in presenza di RBC da 0,25 μm (Figura 2 a, corsia B) e a concentrazioni più elevate di RBC, l’attività di svolgimento era quasi totalmente inibita (0,5, 1,0 e 2,5 μm RBC per la Figura 2 a corsie C, D ed E, rispettivamente).

Questo set di dati indicava che l’elicaseIC50 era nell’intervallo 0,25–0,75 μm. Per verificare questi risultati di inibizione dello svolgimento del DNA e per ottenere un valore IC50 più preciso, abbiamo utilizzato un test dell’elicasi basato sul trasferimento di energia risonante di fluorescenza (FRET) tra il fluoroforo Cy3 e il quencher black hole quencher 2 (BHQ ‐ 2) come descritto in precedenza utilizzando per una diversa helicase (vedere http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf).

Abbiamo alterato la molecola di substrato parziale del DNA-duplex per renderla compatibile con la polarità da 5 ′ a 3 ′ dell’elicasi SCV. Conducendo la reazione in una cuvetta fluorimetrica, l’elicasi SCV è stata prima lasciata equilibrare con il duplex e, dove indicato, con RBC alla concentrazione appropriata utilizzando lo stesso sistema tampone dei dosaggi ATPasi.

La reazione è stata avviata mediante l’aggiunta di adenosina 5′ ‐ trifosfato (ATP; 0,5 mm) e l’aumento della fluorescenza (λ ex = 550 nm e λ em = 570 nm) dovuto al rilascio del filamento Cy3 è stato misurato dopo un minuto per determinare l’entità della reazione. I dati sono stati raccolti e adattati a un’equazione logistica (Figura 2 b) con il valore dell’elicaseIC50 di 0,6 μm in buon accordo con quello del test radiomarcato dell’attività dell’elicasi discusso in precedenza.

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Figura 2
RBC inibisce le attività di svolgimento del DNA dell’elicasi SCV. a) Titolazione dell’attività di svolgimento del DNA duplex (ds) dell’elicasi SARS con concentrazioni crescenti di RBC osservate mediante radiografia del duplex marcato dopo elettroforesi su gel di acrilammide. La banda inferiore, mostrata la più forte nella corsia A, rappresenta il DNA a filamento singolo (ss) rilasciato (etichettato), mentre la banda superiore, mostrata la più forte nella corsia E, rappresenta il DNA duplex. Corsia A, no RBC; corsie da B a E: 0,25, 0,50, 1,0 e 2,5 μm RBC, rispettivamente. b) Titolazione dell’attività di svolgimento del dsDNA dell’SCV elicasi con concentrazioni crescenti di RBC come osservato da un nuovo saggio FRET. I dati sono espressi come percentuale della reazione di controllo in assenza di inibitore. I f = fluorescenza relativa Cy3.

È noto che lo ione Bi3 + ha un’elevata affinità per lo zolfo tiolato.21, 24 Abbiamo quindi misurato lo spettro di assorbanza UV dell’elicasi SCV, sia in assenza che in presenza di 1 μm di RBC (Figura 3 a). Dopo l’aggiunta di RBC, è stata osservata un’ampia spalla negli spettri di differenza tra le lunghezze d’onda di 300–350 nm, caratteristica della formazione dei legami Bi-S.

Questa spalla è molto simile nel profilo a quella riportata per il legame del bismuto ai residui di cisteina delle metallotioneine.21 L’evento di legame è apparso abbastanza rapido e completo per oltre il 95% entro due minuti dall’aggiunta del RBC. Ulteriori lievissimi aumenti dell’assorbimento sono stati osservati nelle due ore successive. Questo era diverso dal legame del bismuto alla metallotioneina o alla transferrina, che è durato diverse ore.21, 25

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Figura 3
a) L’effetto di RBC sullo spettro di assorbimento UV dell’SCV elicasi. Lo spettro di assorbimento dell’elicasi SCV è stato misurato prima (-) e dopo (- – – -) l’aggiunta di 1 μm di globuli rossi. Tutti gli spettri vengono corretti per la soluzione tampone e il contributo all’assorbimento da RBC stesso. b) La titolazione dello ione Zn2 + nella MBD dell’elicasi SCV monitorata da un saggio PAR / PMPS. Riquadro: rapporto tra ioni Zn2 + e MBD. c) Le variazioni di assorbanza a circa 350 nm dopo l’aggiunta di diversi equivalenti molari di ione Bi3 + (rapporto di Bi3 + rispetto a MBD).

È probabile che il legame dello ione Zn2 + all’SCV helicase MBD sia essenziale per l’attività enzimatica.26 Abbiamo quindi clonato, espresso e purificato l’MBD dall’SCV per studiarne le proprietà biofisiche in isolamento.

(vedi http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf).

L’MBD legato a Zn2 + aveva un tempo di ritenzione di 8,2 min, determinato mediante cromatografia per filtrazione su gel (Superdex 75 10/300 GL), che corrisponde a un peso molecolare di circa 42 kDa (vedere http: //www.wiley-vch. de / contents / jc_2002 / 2007 / z701021_s.pdf).

Ciò indica che l’MBD legato a Zn2 + è un trimero in soluzione. La stechiometria del legame ionico Zn2 + all’MBD è stata misurata utilizzando il chelante di zinco 4‐ (2 ‐ piridilazo) resorcinolo (PAR) insieme al reagente che modifica il tiolo acido p ‐ idrossimercurifenilsolfonico (PMPS) .27, 28

L’assorbanza di Zn (par) 2 a circa 500 nm è aumentata gradualmente con l’aggiunta di PMPS a una soluzione tamponata di MBD e PAR (Figura 3 b). La concentrazione di zinco è stata calcolata utilizzando una curva standard Zn2 + –PAR. Ciò ha rivelato che la concentrazione di zinco totale era circa 2,8 (± 0,2) volte quella del MBD, che è indicativo di circa tre ioni Zn2 + che si legano a ciascun monomero MBD (Figura 3 b, riquadro).

Abbiamo quindi eseguito un esperimento di titolazione simile per misurare il rapporto tra il legame di ioni Bi3 + e l’MBD. Un nuovo picco di assorbanza è apparso a circa 350 nm nello spettro UV / Vis del MBD, che è aumentato di intensità quasi linearmente da 0 a circa 3 moli equivalenti con l’aggiunta graduale dello ione Bi3 +.

Non sono stati osservati aumenti significativi dell’assorbimento dopo l’ulteriore aggiunta dello ione Bi3 +, suggerendo che il monomero MBD lega anche 2,8 (± 0,3) ioni Bi3 + (Figura 3 c) e che lo ione Bi3 + compete efficacemente per i siti di legame dello ione Zn2 +. Preso in combinazione con i dati enzimatici, ciò suggerisce che lo ione Bi3 + si lega fortemente al dominio di legame metallico dell’elicasi, interrompendo e inibendo in tal modo sia le attività della NTPasi che dell’elicasi.

Si può notare che mutazioni puntiformi all’interno del MBD dell’elicasi dall’arterite visus equina (EAV) strettamente correlata hanno portato a gravi carenze nella replicazione virale nelle colture cellulari infette.20, 29

Per studiare ulteriormente le proprietà inibitorie dei globuli rossi, abbiamo valutato le sue attività anti-SCV contro un isolato clinico (ceppo SCV GZ50) in cellule FRhK-4. Per i nostri esperimenti iniziali, abbiamo esaminato gli effetti citopatogeni mediante microscopia a contrasto di fase 36 ore dopo l’infezione con il virus (vedere http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf).

Come mostrato nella Figura 4a, le cellule non infette apparivano lisce mentre le cellule infette mostravano strutture prominenti a forma di cresta lungo le membrane. Tali strutture erano meno prominenti dopo il trattamento con 100 μm di RBC, ma questo effetto era difficile da quantificare a occhio. Per confermare questo risultato, abbiamo utilizzato un test di vitalità virale per misurare gli effetti del trattamento dei globuli rossi.

Abbiamo misurato la riproduzione virale in presenza di globuli rossi utilizzando un protocollo TCID50 per determinare il numero di particelle virali vitali nel supernatante di coltura cellulare 36 ore dopo l’infezione da SCV (vedere http://www.wiley-vch.de/contents /jc_2002/2007/z701021_s.pdf ).30, 31 RBC ha inibito in modo significativo la riproduzione di SCV con il titolo virale ridotto di circa l’80% a 25 μm e le concentrazioni di 500 μm RBC hanno inibito quasi completamente l’infezione, la replicazione e / o il rilascio di SCV.

Questi dati sono stati adattati all’equazione logistica per fornire un valore di concentrazione effettiva del 50% (EC50) di 5,9 (± 4) μM per SCV vitale. Esprimendo questo utilizzando una scala logaritmica per la vitalità cellulare (Figura 4 b), è stato ottenuto un valore di concentrazione effettiva del 90% (EC90) di 50 (± 8) μm.

Per misurare la citotossicità dei globuli rossi in colture cellulari, abbiamo utilizzato un test standard 3‐ (4,5 ‐ dimetiltiazol ‐ 2 ‐ il) ‐2,5 ‐ difeniltetrazolio bromuro (MTT) basato sulla riduzione del sale di tetrazolio MTT al formazano colorante in una reazione catalizzata dalla succinato deidrogenasi mitocondriale, che è presente solo nelle cellule metabolicamente attive (vedere http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf ).32

Sono stati anche confrontati i tassi di crescita delle cellule trattate con RBC e di quelle non trattate. La tossina del fungo α ‐ amanitina è stata utilizzata come controllo positivo. L’adattamento dei dati all’equazione logistica ha prodotto una concentrazione di citotossicità del 50% (CC50) di 5,0 mm (Figura 4 c). L’EC50 per l’inibizione RBC di SCV è stato misurato in 5,9 μm. Questi risultati hanno rivelato una costante di specificità (CC50 / EC50) di 847, indicando che RBC agisce in modo molto efficace e specifico in questo sistema di coltura cellulare di rene di scimmia.

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La Figura 4
RBC inibisce l’infettività e la riproduzione di SCV. a) Effetto di RBC sulla replicazione di SCV nelle cellule FRhK-4. Dove indicato, RBC è stato aggiunto 10 minuti prima dell’infezione e le cellule sono state fissate 36 ore dopo l’infezione. Non infetto: cellule non infette. Infetto: cellule infettate in assenza di RBC. Trattato: cellule infettate in presenza di 100 μm di globuli rossi. b) Effetto di RBC sull’infettività di SCV. L’infettività è stata misurata misurando il titolo virale mediante titolazione di ritorno del supernatante di coltura diluito in serie 36 ore dopo l’infezione. I dati sono espressi come percentuale di un controllo in cui nessun RBC è stato aggiunto al surnatante della coltura cellulare. Riquadro: vitalità virale mostrata utilizzando una scala logaritmica per evidenziare le differenze. c) Citotossicità dei globuli rossi in colture cellulari misurata con un saggio MTT.

Nel tentativo di delineare il meccanismo di inibizione mediata dai globuli rossi della replicazione virale, è stata determinata la cinetica dell’infezione da SCV in presenza di RBC. La PCR quantitativa real ‐ time (Q ‐ RT ‐ PCR) è stata utilizzata per monitorare le quantità relative di RNA virale (come specificato dai primer al gene spike SCV) e RNA cellulare (come specificato dai primer per il gene housekeeping β ‐ actina) ( vedere http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2007/z701021_s.pdf ).30-33 È stato riscontrato che 6 ore dopo l’infezione, l’RBC ha avuto scarso effetto sulle quantità relative di RNA virale ( Figura 5).

Durante questo periodo, anche concentrazioni elevate di RBC (400 μm) non sono state in grado di ridurre i livelli di RNA virale del 50% rispetto a un controllo in assenza del farmaco. Tuttavia, dopo 12 h, l’RBC ha avuto un effetto maggiore, con un RBC compreso tra 50 e 100 μm che ha causato una riduzione del 50% dei livelli di RNA virale.

Dopo 24–48 h, una concentrazione di 12,5–25 μm RBC ha causato una riduzione di circa il 50% dei livelli di RNA virale. Questi dati suggeriscono quindi che RBC gioca un ruolo inibitorio maggiore durante le fasi successive del ciclo replicativo. Poiché l’elicasi SCV agisce nelle fasi successive del ciclo, ciò sarebbe coerente con la funzionalità dell’elicasi dell’SCV che inibisce all’interno della cellula.

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Figura 5
Effetti dei globuli rossi sulla cinetica dell’infezione da SCV misurati mediante Q ‐ RT ‐ PCR. L’infezione da SCV è stata misurata mediante primer specifici per il gene spike SCV e confrontata con il gene β ‐ actina di housekeeping come controllo endogeno. I dati sono stati misurati a 6, 12, 24 e 48 ore dopo l’infezione. Dove indicato, RBC è stato aggiunto 1 ora prima dell’infezione alla concentrazione mostrata.

Un netto vantaggio dello sviluppo di composti a base di bismuto per l’intervento terapeutico è che molti farmaci, come l’RBC, sono già usati clinicamente per trattare i disturbi all’interno del tratto alimentare.34 Ciò è particolarmente rilevante in questo caso poiché si è scoperto che in precedenza SCV era presente in le feci del 97% dei pazienti con SARS ed è possibile che questa sia un’importante via di trasmissione virale.35 Inoltre, i sintomi di diarrea sono stati osservati in oltre il 38% dei pazienti ospedalieri con infezioni confermate da SARS. I composti del bismuto potrebbero essere testati contro SCV in un ruolo profilattico, come parte di una terapia di combinazione o nel trattamento di infezioni causate da altri nidovirus.

In sintesi, abbiamo testato diversi complessi di bismuto come potenziali inibitori della proteina SCV elicasi. Si è scoperto che l’RBC è un inibitore particolarmente forte dell’attività ATPasi della proteina SCV helicase, con un valore IC50 di 0,3 μm. I nostri saggi basati su FRET hanno mostrato che RBC inibiva l’attività di svolgimento del duplex del DNA con un valore IC50 di 0,6 μm. I dati UV / Vis hanno confermato che il bismuto si lega ai residui di cisteina sulla proteina elicasi.

Un comportamento di legame analogo verso il dominio di legame metallico N-terminale indica che il bismuto si lega a questa regione ricca di cisteina. In coltura cellulare, l’RBC ha inibito efficacemente la riproduzione di SCV con un valore EC50 di 5,9 μm e ha mostrato citotossicità moderatamente bassa con un valore CC50 di 5 mm. Gli esperimenti Q ‐ RT ‐ PCR indicano che RBC inibisce un processo in fase avanzata nel ciclo replicativo SCV, il che è coerente con l’elicasi come bersaglio di questi farmaci all’interno della cellula. Prendendo in considerazione il meccanismo d’azione proposto, l’elevata selettività e l’attuale utilizzo clinico, suggeriamo che i farmaci a base di bismuto dovrebbero essere ulteriormente valutati per il trattamento delle infezioni da SCV in vivo.

sezione sperimentale

I complessi di citrato di bismuto ([Bi (cit)]), [Bi (nta)], [Bi (cys) 3], [Bi (edta)] e acetoidrossamato di bismuto ([Bi (aha)]) sono stati preparati mescolando il bismuto sali con le quantità appropriate di ligandi (ad esempio acetohydroxamate (aha)) come descritto in precedenza.36 Ranitidine bismuth citrate è stato fornito da GlaxoWellcome China Ltd.

L’elicasi è stata preparata in Tris ‐ HCl da 20 mm (0,5 mL; pH 6,8; Tris = tris (idrossimetil) aminometano), 200 mm di NaCl a una concentrazione di 0,22 mg mL − 1. L’RBC è stato quindi aggiunto a una concentrazione finale di 1 μm, quindi è stato concesso un ritardo appropriato (minuti) per il legame prima di misurare lo spettro UV / Vis.

L’MBD è stato preparato in Tris-HCl da 20 mm pH 8,5, NaCl 200 mm. Per l’esperimento di titolazione dello ione Zn2 +, PMPS da 10 mm è stato aggiunto gradualmente a una miscela di MBD da 5 μm e PAR da 100 μm (0,4 mL, MBD / PAR = 1:20) in una cuvetta UV / Vis e l’assorbanza a 500 nm è stata registrato. La curva standard Zn2 + –PAR è stata costruita misurando l’assorbanza UV / Vis a 500 nm di 100 μm PAR con varie diluizioni di una soluzione standard di assorbimento atomico di zinco.

Per gli esperimenti di titolazione ionica Bi3 +, 1 mm [Bi (nta)] è stato aggiunto gradualmente a 5 μm MBD in 20 mm di Tris ‐ HCl pH 8,5 e 200 mm di soluzione NaCl (volume totale = 0,4 mL), fino a una concentrazione finale di 40 μm (8 mol equivalenti di MBD). Il legame dello ione Bi3 + a MBD è stato esaminato mediante spettroscopia UV / Vis monitorando le variazioni di assorbimento a circa 350 nm.

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Journal information: Nature Microbiology

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