I dati aggiornati sulla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS‐CoV‐2) negli esseri umani sono forniti nella tabella 1.

Questa sinossi riassume le ultime scoperte su fonti animali che potrebbero rappresentare un rischio per l’infezione umana da SARS‐CoV‐2 e malattia da coronavirus ‐ 2019 ( COVID‐19 ).

Le informazioni fornite possono essere importanti durante lo xenotrapianto o per individui immunocompromessi che possiedono o lavorano regolarmente con animali. È ampiamente accettato che le specie di coronavirus possano essere identificate sia nell’uomo che in varie specie animali e siano comunemente associate a malattie respiratorie o gastrointestinali, o entrambe. 1

Con i casi di SARS‐CoV‐2 negli esseri umani in continuo aumento su base giornaliera, è importante capire quali specie animali possono essere potenzialmente sensibili all’infezione da SARS‐CoV‐2 e quindi possono fungere da serbatoio per le infezioni umane.

Tabella 1

Fatti sui CoV umani ad alta patogenicità

Virus	Tempo di circolazione	Casi confermati in laboratorio	Deceduti	Tasso di mortalità del caso (%)	Distribuzione per paese
SARS – CoV  a	2002‐2003	8096	774	9.6	26
MERS – CoV  b	2012 ‐ in corso	2494	853	35	27
SARS – CoV – 2  c	2019 ‐ in corso	25 602 665	852 758	3.3	Pandemia globale

^a Fonte:  https://www.who.int/csr/sars/country/table2004_04_21/en/ . ^b Fonte:  https://www.who.int/emergencies/mers‐cov/en/ . ^c Fonte:  https://covid19.who.int  (Accesso 2020/09/03) Questo articolo è stato reso disponibile gratuitamente tramite PubMed Central come parte della risposta all’emergenza di sanità pubblica COVID-19. Può essere utilizzato per il riutilizzo e l’analisi senza restrizioni della ricerca in qualsiasi forma o con qualsiasi mezzo con riconoscimento della fonte originale, per la durata dell’emergenza sanitaria pubblica.

In precedenza, è stato determinato che gli animali delle famiglie Felidae (gatti domestici; tigri e leoni in cattività), Canidae (cani da compagnia) e Mustelidae (visoni d’allevamento) possono essere naturalmente infettati dalla SARS ‐ CoV ‐ 2. La maggior parte, se non tutti i casi segnalati in precedenza, 2 erano dovuti allo stretto contatto di animali domestici o di allevamento con pazienti infetti da COVID-19.

La tabella 2 fornisce informazioni aggiornate per felidi, canidi e mustelidi, ma anche altre specie studiate. I risultati precedenti sono stati ulteriormente confermati in un recente studio condotto nel Nord Italia dove sono stati campionati più di 500 animali da compagnia al momento della frequente infezione umana da SARS-CoV2 . 3

Mentre SARS‐CoV‐2 RNA non è stato trovato in nessun animale, il 3,4% di tutti i cani e il 3,9% dei gatti indagati avevano titoli anticorpali neutralizzanti misurabili, inoltre, la presenza di COVID ‐ 19 in una famiglia è stata identificata come fattore di rischio. 3

Inoltre, in condizioni sperimentali, i furetti si sono dimostrati un modello adatto per imitare la replicazione della SARS‐CoV‐2 nel tratto respiratorio degli esseri umani.

Tuttavia, i segni clinici o la mortalità non sono sempre visibili. 4 Inoltre, uno studio recente ha indicato che SARS‐CoV‐2 si trasmette tramite contatto diretto entro 1-3 giorni tra furetti alloggiati nella stessa gabbia, ma anche via aria entro 3-7 giorni se alloggiati in gabbie separate condividendo lo stesso flusso d’aria . 5

La robusta trasmissione aerea di SARS‐CoV‐2 mostrata in quello studio conferma ulteriormente che le misure di distanza fisica sono importanti. 5

Tavolo 2

Sintesi dei risultati negli animali fino ad oggi (adattato dalla scheda tecnica dell’OIE, Infezione da SARS‐CoV‐2 negli animali)

Famiglia	Specie	Tipo di infezione	Caratteristiche dell’infezione sperimentale	Suscettibilità	Segni clinici	Trasmissione	Sorveglianza sierologica
Animal # (riferimento)	Itinerario	Dose a	Nessuno, basso, alto	Numero positivo / totale testato	Riferimento
Suidi	Suini	Sperimentale	9 65 4	Intra-nasale	10 5  TCID 50 10 5  PFU	Nessuna	No	No	0/187	26
Pollame	Polli	Sperimentale	17 65 410 7	Oculo-oronasale Intra-nasale	10 5  TCID 50 10 4.5  PFU10 5.4  TCID 50	Nessuna	No	No	0/153	26
Anatra	Sperimentale	5 410 7	Intra‐nasalIntra‐choanal	10 4.5  PFU10 6  TCID 50	Nessuna	No	No	0/153	26
Tacchini	Sperimentale	10 7	Intra-choanal	10 5.4  TCID 50	Nessuna	No	No	N / A
Quaglia giapponese	Sperimentale	10 7	Intra-choanal	10 5.4  TCID 50	Nessuna	No	No	N / A
Oche cinesi bianche	Sperimentale	10 7	Intra-choanal	10 6  TCID 50	Nessuna	No	No	N / A
Ruminanti	Bestiame	N / A	0/107	26
Pecore	0/133	26
Capre	N / A
Caninae	Cani	Naturale e sperimentale	5 4	Intra-nasale	10 5  PFU	Basso	No o mite	No	8/1800/497	326
Felidae	Gatti (domestici)	Naturale e sperimentale	14 43 27	Intra-nasalNA	10 5  FIND	Alto	No o mite	sì	6/600/87	326
Tigri e leoni	Naturale	Alto	sì	sì	0/8	26
Musteliadae	Furetti	Sperimentale	10 69 4	Intra-nasale	10 5  TCID 50 10 5  PFU	Alto	No o mite	sì	0/2	26
Visoni (visoni americani,  visone Neovison )	Naturale	Alto	sì	Sì, anche visone umano	0/81	26
Pteropodidae	Pipistrelli della frutta egiziani ( Rousettus aegyptiacus )	Sperimentale	9 6	Intra-nasale	10 5  TCID 50	Alto	No	sì	N / A
Cricetidae	Criceti siriani dorati	Sperimentale	4 59 1215 1113 13	Intra-nasale	6 × 10 5  TCID 50 8 × 10 4  TCID 50 10 5  PFU10 5  PFU	Alto	No o mite	sì	N / A
Vecchia parola monkeysSubfamily  Cercopithecines	Macachi ( Macaca fascicularis  e  Macaca mulatta )	Sperimentale	5 15	Intra-nasale	10 6  TCID 50	Alto	sì	sì	N / A
3 163 163 1610 18	Intra ‐ nasale e intra ‐ tracheale	1,1 × 10 6  PFU1,1 × 10 5  PFU1,1 × 10 4  PFU

Abbreviazione: NA, non disponibile.
^a Dose infettiva di coltura tissutale mediana (TCID ₅₀ ) per animale o unità di formazione di placche (PFU).
Questo articolo è stato reso disponibile gratuitamente tramite PubMed Central come parte della risposta alle emergenze sanitarie pubbliche COVID-19. Può essere utilizzato per il riutilizzo e l’analisi senza restrizioni della ricerca in qualsiasi forma o con qualsiasi mezzo con riconoscimento della fonte originale, per la durata dell’emergenza sanitaria pubblica.

Fortunatamente, gli studi sperimentali di infezione da SARS‐CoV‐2 nel pollame utilizzando polli e anatre hanno dimostrato una mancanza di suscettibilità di queste specie al virus (Tabella 2). 4, 6 Uno studio pubblicato di recente con una coorte più ampia, condotto negli Stati Uniti , ha ulteriormente confermato questi risultati negativi ampliando la gamma di specie di pollame testate includendo anche tacchini, quaglie e oche (Tabella 2). 7

Dal nostro ultimo aggiornamento, sono stati scoperti ulteriori allevamenti di visoni infetti da SARS‐CoV‐2 con un totale di 25 allevamenti nei Paesi Bassi 8, 9 (https://promedmail.org/promed‐post/?id=7588293), 3 fattorie in Danimarca (https://www.oie.int/fileadmin/Home/MM/Update_1_Letter_to_OIE_about_the_COVID‐19_situation_in_Denmark.pdf) e una fattoria in Spagna (https://promedmail.org/promed‐post/?id=7584560) . Complessivamente, finora sono stati abbattuti un milione di visoni olandesi e 100000 visoni spagnoli (https://www.theguardian.com/world/2020/jul/17/spain‐to‐cull‐nearly‐100000‐mink‐in‐coronavirus -epidemia).

In generale, gli allevamenti di visoni colpiti sono considerati eventi di ricaduta dalla pandemia umana e la fonte dell’infezione è stata probabilmente infetta da esseri umani che entrano nell’allevamento. 8

Tuttavia, sono stati identificati anche esseri umani infetti da visoni 10 e ciò potrebbe essere accaduto 2-6 volte con la via di trasmissione non del tutto stabilita (https://www.government.nl/latest/news/2020/05/19/new ‐Risultati ‐ dalla ‐ ricerca ‐ in ‐ covid ‐ 19 ‐ su ‐ visone ‐ fattorie).

Oltre alle segnalazioni di più casi di animali infetti naturalmente, sono stati segnalati nuovi modelli animali SARS‐CoV‐2 (Tabella 2).

Recentemente, manifestazioni cliniche e patologiche di COVID‐19 sono state riprodotte in un modello di criceto siriano dorato. 11

I criceti infetti hanno sviluppato lievi segni clinici e perdita di peso, ma alla fine si sono ripresi e hanno sviluppato anticorpi neutralizzanti il ​​siero 14 giorni dopo la sfida. 11

Risultati simili sono stati ottenuti anche da un altro gruppo che ha dimostrato l’antigene SARS‐CoV‐2 mediante immunoistochimica nella mucosa nasale e nelle cellule epiteliali bronchiali tra 2 e 5 giorni dopo l’infezione. 12

Da allora, il modello dorato del criceto siriano è stato utilizzato per dimostrare che le maschere chirurgiche riducono il rischio di trasmissione per contatto della SARS ‐ CoV ‐ 2. 13

In effetti, una divisione della maschera chirurgica tra criceti sfidati e naïve ha ridotto significativamente la trasmissione al 25%. 13

Da notare che i topi, sebbene membri della famiglia Cricetiadae, non sono suscettibili alla SARS‐CoV‐2 a meno che il virus non sia geneticamente adattato mediante passaggio seriale. 14

Questo forse indica che una specie non può essere classificata come suscettibile o resistente a causa della sua famiglia.

I primati non umani (macachi rhesus) sono stati infettati con successo da SARS-CoV‐2 e sono stati osservati segni respiratori caratteristici sia nei macachi rhesus di 3-5 anni che in quelli di 15 anni (Tabella (Tabella 22). 15

La replicazione virale nel tratto respiratorio era più pronunciata nelle scimmie più anziane ed è durata 14 giorni. Questi risultati confermano che i macachi rhesus possono essere infettati da SARS‐CoV‐2. 15

In linea con questa ricerca, un gruppo statunitense ha utilizzato il modello SARS‐CoV‐2 di macaco rhesus per testare l’immunità protettiva dopo la riesposizione. 16

I macachi rhesus presentavano elevate cariche virali nel tratto respiratorio superiore e inferiore ed evidenze patologiche di polmonite virale dopo il challenge iniziale.

Dopo la ripetizione del challenge, si è verificata una riduzione di circa 5 log10 delle cariche virali SARS‐CoV‐2 mediane nel lavaggio broncoalveolare e nei campioni di mucosa nasale rispetto alle cariche virali dopo l’infezione primaria. 16

Risultati simili sono stati ottenuti anche da un gruppo cinese. 17 Inoltre, un candidato vaccino contro la SARS‐CoV‐2 DNA è stato testato con successo nel modello di macaco rhesus indicando riduzioni> 3,1 log10 (lavaggio broncoalveolare) e> 3,7 log10 (mucosa nasale) nella carica virale mediana rispetto ai controlli placebo. 18

Diversi gruppi scientifici hanno utilizzato un approccio alternativo per identificare possibili animali sensibili alla SARS-CoV‐2. 

Piuttosto che cercare animali infettati naturalmente o eseguire prove sperimentali di infezione, il recettore dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2), che si lega al dominio di legame del recettore (RBD) della proteina spike di SARS‐CoV‐2, essenziale per l’ingresso nella cellula ospite e l’inizializzazione della replicazione, è stata studiata confrontando la sua struttura tra le specie animali.

I primi studi sull’infettività dei virus hanno utilizzato cellule HeLa che esprimevano proteine ​​ACE2 da specie selezionate o meno per dimostrare che SARS‐CoV‐2 utilizza proteine ​​ACE2 per l’ingresso nelle cellule negli esseri umani, nei pipistrelli a ferro di cavallo cinesi, negli zibetti e nei maiali, ma non nei topi. 19

In uno studio di follow-up, sono state utilizzate strutture a raggi X dell’ACE2 umano legato all’RBD di SARS‐CoV‐2 per prevedere il suo legame alle proteine ​​ortologhe ACE2 di diversi animali. 20 Dei 20 amminoacidi in ACE2 che entrano in contatto con la proteina spike, solo 13 sono necessari affinché ACE2 funzioni come recettore della SARS‐CoV‐2, indicando probabilmente una barriera minima di specie.

I suini e i cani sono stati considerati eccezioni in quanto hanno una bassa espressione di ACE2 nel tratto respiratorio. 20

Inoltre, utilizzando la citometria a flusso per rilevare le interazioni delle proteine ​​RBD-Fc con gli ortologhi ACE2 espressi sulla superficie delle cellule 293T, e saggi con pseudovirus che esprimono la proteina spike, sono state identificate specie con un recettore ACE2 ortologo: ruminanti (cammelli, bovini, capre, pecore), cavalli, maiali, gatti e conigli; questo recettore supporta anche l’ingresso virale di SARS ‐ CoV ‐ 1, bat ‐ CoV (Bat ‐ CoV RaTG13) e Pangolin ‐ CoV. 21 Utilizzando un test di legame ACE2 di superficie con cellule HeLa trasdotte con lentivirus che esprimono ACE2 da specie diverse, uno studio diverso ha studiato uccelli, rettili (alligatori, tartarughe, lucertole), mammiferi, anfibi, pesci ossei celacanti e pesci cartilaginei.

Gli ortologhi ACE2 sono stati identificati in 80 specie di mammiferi, inclusi animali domestici, bestiame e animali che si trovano comunemente negli zoo e negli acquari. 22 Nel complesso, i risultati finora indicano che molte più specie di mammiferi possono essere potenzialmente suscettibili all’infezione e alla replicazione della SARS ‐ CoV ‐ 2 e possono quindi fungere anche da possibili serbatoi.

Recentemente sono state rese disponibili nuove informazioni sulla possibile origine della SARS ‐ CoV ‐ 2. Subito dopo la scoperta di SARS ‐ CoV ‐ 2, i pipistrelli erano stati suggeriti come l’ospite serbatoio più probabile. Come previsto, 7/9 pipistrelli della frutta (Rousettus aegyptiacus) hanno avuto un’infezione transitoria da SARS-CoV-2 dopo l’inoculazione sperimentale e anche 1/3 di pipistrelli da contatto sono stati infettati. 6

Recentemente, la specie di pangolino è stata suggerita come un serbatoio naturale di SARS ‐ CoV ‐ 2. Nei pangolini malesi sono stati identificati coronavirus associati a pangolino appartenenti a due sotto-lignaggi di coronavirus correlati a SARS ‐ CoV ‐ 2. 23, 24

In particolare, cinque residui amminoacidici chiave del RBD coinvolti nell’interazione con l’ACE2 umano sono coerenti tra Pangolin ‐ CoV e SARS ‐ CoV ‐ 2 rispetto a solo uno dei cinque residui chiave tra SARS‐CoV‐2 e Bat‐CoV RaG13. 25

Inoltre, a livello dell’intero genoma, Pangolin ‐ CoV è identico al 91,0% a SARS ‐ CoV ‐ 2 mentre RaTG13 e Pangolin ‐ CoV sono identici solo al 90,6%. 25

In sintesi, da quando la SARS‐CoV‐2 è emersa nella popolazione umana verso la fine del 2019, si è diffusa ad un ritmo elevato e i tassi di infezione negli esseri umani continuano ad aumentare.

Esistono prove confermate che SARS‐CoV‐2 da esseri umani infetti da COVID‐19 può estendersi a determinate specie animali all’interno delle famiglie Mustelidae, Felinae e Caninae. Comunemente, le infezioni negli ospiti animali sono subcliniche ma occasionalmente si possono osservare segni clinici.

Inoltre, gatti, cani, furetti, pipistrelli della frutta egiziani, criceti siriani dorati e macachi sono stati infettati sperimentalmente e alcune di queste specie sono ora utilizzate per la ricerca sulla SARS‐CoV‐2.

Tuttavia, ci sono sorprendentemente poche informazioni su altre specie che si prevede possano potenzialmente fungere da serbatoi per l’uomo. Da notare, la dimensione del campione delle specie che sono state testate era bassa.

Questa mancanza di conoscenza richiede attenzione, in caso di xenotrapianto la maggior parte degli organi o dei prodotti di origine animale dovrebbero essere testati per la presenza di SARS‐CoV‐2 prima del loro utilizzo nei pazienti.

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Indagine sui focolai

A seguito del rilevamento iniziale di SARS-CoV-2 nei visoni in due allevamenti rispettivamente il 23 e il 25 aprile, come parte del monitoraggio sanitario di routine effettuato dal servizio Royal GD Animal Health e successive indagini da parte di Wageningen Bioveterinary Research (WBVR), il servizio nazionale laboratorio di riferimento per le malattie animali soggette a notifica, è stato convocato un team di indagine sull’epidemia di One Health ( 39 , 40 ).

Successivamente, i segni respiratori e l’aumento della mortalità nei visoni sono stati notificati dal ministero olandese dell’Agricoltura, della natura e della qualità alimentare e le fattorie sono state messe in quarantena (nessun movimento di animali e letame e restrizioni ai visitatori).

Il 7 maggio altri due allevamenti di visoni nella stessa regione sono stati confermati infetti.

Entro la fine di maggio il ministro olandese dell’Agricoltura ha deciso che tutti i visoni negli allevamenti infetti da SARS-CoV-2 dovevano essere abbattuti. Inoltre, poiché la manifestazione clinica dell’infezione era altamente variabile all’interno e tra gli allevamenti, comprese le infezioni asintomatiche, i test settimanali degli animali morti per le infezioni da SARS-CoV-2 sono diventati obbligatori per tutti gli allevamenti di visoni nei Paesi Bassi. Inoltre, è stato implementato un divieto di trasporto a livello nazionale di letame di visone e visone e un rigoroso protocollo di igiene e visita.

I primi allevamenti di visoni infetti sono stati abbattuti dal 6 giugno in poi. Dal decimo allevamento infetto (NB10) in poi, l’abbattimento è avvenuto entro 1-3 giorni dalla diagnosi. In questo manoscritto, vengono presentati i dati fino al 26 giugno, quando un totale di 16 allevamenti di visoni nei Paesi Bassi sono risultati positivi per le infezioni da SARS-CoV-2.

Tracciamento del contatto veterinario e umano

L’Autorità olandese per la sicurezza alimentare e dei prodotti di consumo (NVWA) ha rintracciato contatti relativi agli animali con altri allevamenti di visoni. Il tracciamento avanti e indietro di possibili contatti ad alto rischio è stato effettuato nel quadro dell’indagine epidemiologica standard della NVWA (ad es.

incentrato sulla circolazione dei veicoli, visitatori come veterinari, lavoratori (temporanei), condivisione di attrezzature tra aziende agricole e trasporto e consegna di materiali, come mangimi, pelli, carcasse e letame).

Alle persone con possibile esposizione derivante da questa indagine, nonché ai proprietari di aziende agricole e ai lavoratori agricoli residenti è stato chiesto di segnalare i reclami sanitari al servizio sanitario comunale per i test e – in caso di infezioni confermate – per la consulenza sanitaria e l’ulteriore tracciamento dei contatti.

Proprietari di aziende agricole e lavoratori di allevamenti di visoni infetti sono stati informati dei rischi potenziali e hanno ricevuto consulenza sull’importanza e sull’uso dei dispositivi di protezione individuale e sull’igiene durante la manipolazione degli animali ( 41 ).

La struttura di contatto negli allevamenti è stata valutata attraverso interviste approfondite, per identificare ulteriori persone con possibile esposizione al visone. Al fine di fornire un set migliorato di sequenze del genoma di riferimento, sono stati recuperati dai laboratori clinici campioni anonimi di pazienti a cui era stato diagnosticato COVID-19 nell’area degli stessi codici postali a quattro cifre delle fattorie NB1-NB4 a marzo e aprile 2020 nella regione.

Diagnostica e sequenziamento SARS-CoV-2

La presenza di RNA virale nei campioni di visone è stata determinata utilizzando una RT-PCR mirata al gene E come precedentemente descritto ( 42 ). Per i campioni umani, è stata eseguita la RT-PCR diagnostica per il gene E e RdRp ( 42 ). Inoltre, è stata eseguita la sierologia, utilizzando Wantai Ig total e IgM ELISA, seguendo le istruzioni del produttore ( 43 ).

Per tutti i campioni con un valore Ct <32, il sequenziamento è stato eseguito utilizzando una PCR multiplex specifica per SARS-CoV-2 per il sequenziamento dei nanopori, come descritto in precedenza ( 3 ).

Le librerie sono state generate utilizzando i kit di codici a barre nativi di Nanopore (EXP-NBD104 e EXP-NBD114 e SQK-LSK109) e sequenziate su una cella a flusso R9.4 multiplexing di 24 campioni per corsa di sequenza. Le celle a flusso sono state lavate e riutilizzate fino a quando meno di 800 pori erano attivi. I dati di sequenza grezza risultanti sono stati demultiplexati utilizzando

Porechop (https://github.com/rrwick/Porechop). I primer sono stati tagliati dopo di che è stato eseguito un allineamento basato sui riferimenti. Il genoma di consenso è stato estratto e le posizioni con una copertura <30 sono state sostituite con una “N” come descritto in precedenza ( 44 ).

Mutazioni nel genoma rispetto alla sequenza GISAID EPI_ISL_412973 sono state confermate controllando manualmente le letture mappate e le regioni omopolimeriche sono state controllate manualmente e risolte consultando i genomi di riferimento.

La differenza SNP media è stata determinata utilizzando snp-dists (https://github.com/tseemann/snp-dists). Tutte le sequenze generate in questo studio sono disponibili su GISAID.

Analisi filogenetica

Sono stati selezionati tutti i genomi SARS-CoV-2 olandesi a lunghezza quasi intera disponibili il 1 ° luglio (n = 1.775) e allineati con le sequenze di questo studio utilizzando MUSCLE ( 45 ). Le sequenze con> 10% “Ns” sono state escluse.

L’allineamento è stato controllato manualmente per le discrepanze, dopodiché è stato utilizzato IQ-TREE ( 46 ) per eseguire un’analisi filogenetica di massima probabilità con il modello GTR + F + I + G4 come modello migliore previsto utilizzando l’opzione bootstrap ultraveloce con 1.000 repliche.

Gli alberi filogenetici sono stati visualizzati in Figtree ( http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Per motivi di chiarezza, tutti i valori di bootstrap inferiori a 80 sono stati rimossi.

Per esaminare le potenziali relazioni con i lavoratori migranti, anche tutte le sequenze polacche di GISAID ( 47 ) sono state incluse nell’allineamento ( tabella supplementare 1 ).

Mappatura di modelli di mutazione specifici negli allevamenti di visoni e nei dipendenti degli allevamenti di visoni

Le coordinate degli amminoacidi sono descritte in relazione al genoma di riferimento Genbank NC_045512.2. I frame di lettura aperti sono stati estratti dall’allineamento del genoma utilizzando l’annotazione del genoma fornita con il genoma di riferimento. Uno script R personalizzato è stato utilizzato per distinguere

sinonimo di mutazioni non sinonime e mutazioni non sinonime sono state visualizzate utilizzando una mappa a tessere dal pacchetto ggplot2 ( 48 ).

Panoramica geografica degli allevamenti di visoni nei Paesi Bassi e allevamenti positivi per SARS-CoV-2

Per proteggere la riservatezza, gli allevamenti di visoni positivi alla SARS-CoV-2 sono stati aggregati a livello comunale. I dataset “ Landbouw; gewassen, dieren en grondgebruik naar gemeente “ e” Wijk- en Buurtkaart 2019 “ di Statistics Netherlands (CBS) sono stati utilizzati ( 49 ). Le mappe sono state create utilizzando i pacchetti R sp ( 50 ), raster ( 51 ) e rgdal ( 52 ) e il software ArcGIS 10.6 di ESRI.

Risultati

La SARS-CoV-2 è stata diagnosticata per la prima volta in due allevamenti di visoni nei Paesi Bassi rispettivamente il 23 aprile (NB1) e il 25 aprile (NB2). Dopo il rilevamento iniziale di SARS-CoV-2 in questi allevamenti è stata avviata un’indagine approfondita per cercare potenziali vie di trasmissione e per eseguire una valutazione del rischio ambientale e professionale. Qui, descriviamo i risultati dell’indagine sull’epidemia dei primi 16 allevamenti di visoni infetti da SARS-CoV-2 combinando la diagnostica SARS-CoV-2, WGS e interviste approfondite.

Screening dei lavoratori agricoli e dei contatti

I proprietari di allevamenti dei 16 allevamenti di visoni positivi alla SARS-CoV-2 sono stati contattati dai servizi sanitari municipali per condurre indagini di contatto e sono stati prelevati campioni per la diagnostica SARS-CoV-2 basata su RT-PCR e sierologica. In totale, 97 individui sono stati testati mediante test sierologici e / o RT-PCR. In totale, 43 campioni del tratto respiratorio superiore su 88 (49%) sono risultati positivi alla RT-PCR mentre 38 campioni di siero su 75 (51%) sono risultati positivi per gli anticorpi specifici per SARS-CoV-2. In totale, 66 su 97 (67%) delle persone testate avevano evidenza di infezione da SARS-CoV-2 ( tabella 1 ).

Tabella 1 . Panoramica del campionamento umano negli allevamenti di visoni positivi a SARS-CoV-2.

Azienda agricola:	Prima diagnosi negli animali:	Data (e) di campionamento di dipendenti e familiari :	PCR positivo (%)	Sierologia positiva (%)	Dipendenti e familiari sono risultati positivi (PCR e / o sierologia)
NB1	24-04-2020	28-04-2020 – 11-05-2020	5/6 (83%)	5/5 (100%)	6/6 (100%)
NB2	25-04-2020	31-03-2020 – 30-04-2020	1/2 (50%)	8/8 (100%)	8/8 (100%)
NB3	07-05-2020	11-05-2020 – 26-05-2020	5/7 (71%)	0/6 (0%)*	5/7 (71%)
NB4	07-05-2020	08-05-2020	1/3 (33%)	2/2 (100%)	2/3 (66%)
NB5	31-05-2020	01-06-2020	2/7 (29%)	3/6 (50%)	3/7 (43%)
NB6	31-05-2020	01-06-2020	1/6 (17%)	4/6 (66%)	4/6 (66%)
NB7	31-05-2020	10-06-2020 – 01-07-2020	8/10 (80%)	N / A **	8/10 (80%)
NB8	02-06-2020	03-06-2020	5/10 (50%)	5/9 (56%)	8/10 (80%)
NB9	04-06-2020	07-06-2020	1/7 (14%)	1/7 (14%)	2/7 (29%)
NB10	08-06-2020	11-06-2020	1/8 (13%)	3/8 (38%)	4/8 (50%)
NB11	08-06-2020	11-06-2020	1/3 (33%)	0/2 (0%)	1/3 (33%)
NB12	09-06-2020	11-06-2020	6/9 (66%)	2/8 (25%)	7/9 (78%)
NB13	14-06-2020	11-06-2020 – 18-06-2020	3/3 (33%)	0/2 (0%)	3/3 (33%)
NB14	14-06-2020	14-06-2020	1/3 (100%)	5/6 (83%)	5/6 (83%)
NB15	21-06-2020	10-06-2020 – 30-06-2020	2/2 (100%)	N / A **	2/2 (100%)
NB16	21-06-2020	23-06-2020	0/2 (0%)	N / A **	0/2 (0%)
Totale:			43/88 (49%)	38/75 (51%)	66/97 (68%)

* La sierologia è stata eseguita circa una settimana prima del test PCR positivo.

** Non è stata eseguita alcuna sierologia

Trasmissione antropozoonotica di SARS-CoV-2

Durante l’intervista del 28 aprile, quattro dipendenti su cinque di NB1 hanno riferito di aver avuto sintomi respiratori prima che l’epidemia fosse rilevata nei visoni, ma nessuno di loro era stato testato per SARS-CoV-2.

Il primo giorno di sintomi delle persone che lavorano su NB1 variava dal 1 aprile al 9 maggio. Per 16 dei visoni, campionati il ​​28 aprile, e un dipendente dell’azienda agricola, campionato il 4 maggio, è stato ottenuto un WGS (hCov- 19 / Netherlands / NoordBrabant_177 / 2020).

La sequenza umana si raggruppa all’interno delle sequenze di visone sebbene avesse 7 nucleotidi di differenza con la sequenza di visone più vicina ( Figura 1 e cluster A nelle figure 2 e 3 ). Nell’allevamento NB2, il 25 aprile è stata diagnosticata la SARS-CoV-2. L’analisi retrospettiva ha mostrato che un dipendente di NB2 era stato ricoverato in ospedale con SARS-CoV-2 il 31 marzo.

Tutti i campioni degli 8 dipendenti prelevati il ​​30 aprile sono risultati negativi alla RT-PCR ma sono risultati positivi agli anticorpi SARS-CoV-2. La sequenza del virus ottenuta dagli animali era distinta da quella dell’allevamento NB1, indicando un’introduzione separata ( Figure 2 e 3 , gruppo B).

Trasmissione zoonotica di SARS-CoV-2

Nell’allevamento di visoni l’infezione NB3 SARS-CoV-2 è stata diagnosticata il 7 maggio. Inizialmente tutti e sette i dipendenti sono risultati negativi per SARS-CoV-2, ma quando sono stati riesaminati tra il 19 e il 26 maggio dopo aver sviluppato sintomi correlati a COVID-19, 5 individui su 7 che lavorano o vivono nella fattoria sono risultati positivi per SARS-CoV-2 RNA .

Le WGS sono state ottenute da questi cinque individui e il raggruppamento di queste sequenze con le sequenze derivate dal visone da NB3, insieme al risultato del test negativo iniziale e l’inizio dei sintomi, indicano che i dipendenti sono stati infettati da SARS-CoV-2 dopo il visone nella fattoria sono stati infettati.

Inoltre, è stata osservata un’ulteriore infezione basata sul tracciamento dei contatti: uno stretto contatto di uno dei dipendenti – che non ha visitato la fattoria – è stato infettato dal ceppo SARS-CoV-2 trovato su NB3.

Le sequenze animali e umane della fattoria NB3 erano correlate a quelle della fattoria NB1, ma facevano entrambe parte del cluster A.

Allo stesso modo, negli allevamenti di visoni si è verificata molto probabilmente la trasmissione zoonotica NB7 dal visone all’uomo.

In questa fattoria, l’infezione da SARS-CoV-2 nel visone è stata diagnosticata il 31 maggio e i dipendenti sono inizialmente risultati negativi per SARS-CoV-2, ma hanno iniziato a sviluppare sintomi in una fase successiva. I campioni sono stati prelevati tra il 10 giugno e il 1 luglio da 10 dipendenti di cui 8 sono risultati positivi per SARS-CoV-2 RNA.

Da 2 campioni è stato possibile generare WGS dai dipendenti che si sono raggruppati insieme alle sequenze degli animali di questa fattoria.

Confronto con database di riferimento nazionale e campionamento regionale potenziato

Le sequenze generate dagli allevamenti di visoni e dai dipendenti degli allevamenti di visoni sono state confrontate con il database nazionale composto da circa 1.775 WGS. Inoltre, per discriminare tra infezioni acquisite localmente e infezione SARS-CoV-2 correlata ad allevamenti di visoni e per determinare il rischio potenziale per le persone che vivono vicino ad allevamenti di visoni, il WGS è stato eseguito anche su 34 campioni positivi a SARS-CoV-2 di individui che vivono nella stessa area del codice postale a quattro cifre rispetto ai primi quattro allevamenti di visoni.

Queste sequenze locali riflettevano la diversità generale osservata nei Paesi Bassi e non erano correlate ai gruppi di sequenze di visoni trovati negli allevamenti di visoni, pertanto non davano alcuna indicazione di propagazione alle persone che vivevano in prossimità di allevamenti di visoni (sequenze mostrate in magenta , Figura 2 ).

Le sequenze dell’indagine sull’allevamento di visoni sono state anche confrontate con le sequenze dalla Polonia (n = 65), poiché molti dei lavoratori dell’allevamento di visoni erano migranti stagionali dalla Polonia, ma non erano correlati.

Mink farm relative sequenze cluster

L’analisi filogenetica dei genomi di visone SARS-CoV-2 ha mostrato che le sequenze di visone di 16 allevamenti raggruppate in 5 diversi cluster ( Figura 2 e 3 ). I virus degli allevamenti NB1, NB3, NB4, NB8, NB12, NB13 e NB16 appartenevano al cluster A, le sequenze di NB2 erano un cluster separato (B), quelle degli allevamenti NB6, NB7, NB9 e NB14 raggruppati nel cluster C, NB5, NB8, NB10 e NB15 raggruppati nel cluster D e NB11 avevano sequenze designate come cluster E.

Nell’azienda NB8, i virus SARS-CoV-2 sono stati trovati sia dal cluster A che dal cluster D.

È stato realizzato un inventario dettagliato delle possibili caratteristiche comuni, come proprietario dell’azienda agricola, personale condiviso, fornitore di mangimi e fornitore di servizi veterinari. In alcuni casi, è stato osservato un collegamento con gli stessi proprietari di diverse aziende agricole, ad esempio per il cluster A per NB1 e NB4 e per NB8 e NB12.

Sebbene NB7, NB11 e NB15 fossero anch’essi collegati allo stesso proprietario, i virus di questi allevamenti appartenevano rispettivamente al cluster C, D ed E. Non è stato possibile identificare alcun fattore comune per la maggior parte delle aziende agricole e il raggruppamento non può essere spiegato nemmeno dalle distanze geografiche poiché sono stati rilevati più cluster in diverse aziende agricole vicine l’una all’altra ( Tabella 2 e figura 4 ).

Tabella 2. Panoramica dei cluster rilevati nelle diverse aziende agricole.

Azienda agricola:	Data della diagnosi:	Sequenza cluster:	Stesso proprietario:	Fornitore di mangimi:	Veterinario **:	Numero di sequenze (umane):	Diversità della sequenza (media):	Dimensione della popolazione di visone:	Rilevamento ***:
NB1	24-04-20	UN	NB1, NB4	1	io	17 (1)	0-9 (3.9)	75,711	Notifica
NB2	25-04-20	B		1	II	8	0-8 (3.6)	50,473	Notifica
NB3	07-05-20	UN		2	III	5 (5)	0-2 (0.6)	12,400	Notifica
NB4	07-05-20	UN	NB1, NB4	1	io	1	N / A	67,945	Ricerca contatti NB1
NB5	31-05-20	D		1	IV	1	N / A	38,936	EWS-Ser + PM- 1st
NB6	31-05-20	C		3	V	9	0-12 (6.8)	54,515	EWS-Ser + PM- 1st
NB7	31-05-20	C	NB7, NB11, NB15	3	II	6 (2)	0-4 (1.4)	79,355	EWS-PM-1st
NB8	02-06-20	ANNO DOMINI	NB8, NB12 *	3	V	6 (5)	0-6 (2.6)	39,144	EWS-Ser + PM- 1st
NB9	04-06-20	C		2	V	2 (1)	0-3 (1.5)	32,557	EWS-Ser + PM- 2nd
NB10	08-06-20	D		3	II	4	0-3 (1.1)	26,824	EWS-Ser + PM- 2nd
NB11	08-06-20	E	NB7, NB11, NB15	3	II	4	0-4 (2.2)	38,745	EWS-PM-2nd
NB12	09-06-20	UN	NB8, NB12 *	3	II	5	0-3 (1.2)	55,352	Notifica
NB13	14-06-20	UN		3	V	5 (3)	0-5 (3.2)	20,366	EWS-PM-5th
NB14	14-06-20	C		3	II	5 (1)	0-7 (3.7)	28,375	EWS-PM-5th
NB15	21-06-20	D	NB7, NB11, NB15	3	II	5	0-2 (0.6)	35,928	EWS-PM-6th
NB16	21-06-20	UN		3	II	5	0-4 (1.6)	66,920	EWS-PM-6th

* C’è stato uno scambio di personale in queste due località.

** Veterinario II e V erano entrambi dello stesso studio veterinario.

*** Notifica: basata sulla segnalazione dei segni clinici che è stata obbligatoria dal 26 aprile in poi; EWS-Ser- Rilevazione basata su uno screening sierologico obbligatorio su scala nazionale di tutti gli allevamenti di visoni alla fine di maggio / inizio giugno da parte di GD Animal Health; EWS-PM-Detection basato sul sistema di monitoraggio preventivo per il quale le carcasse di animali deceduti per cause naturali sono state sottoposte settimanalmente a test PCR da GD Animal Health dalla fine di maggio in poi in un ciclo settimanale (EWS-PM dal 1 ° al 6 ° posto screening mortem).

In totale sono state generate 18 sequenze da dipendenti di allevamenti di visoni o contatti stretti da sette diversi allevamenti. Nella maggior parte dei casi, queste sequenze umane erano quasi identiche alle sequenze di visoni della stessa fattoria.

Per NB1 la situazione era diversa e la sequenza umana si raggruppa profondamente all’interno delle sequenze derivate dal visone (Figura 1), con 7 nucleotidi di differenza con la sequenza di visone più vicina. Questo è stato anche il caso dell’allevamento NB14, con una differenza di 4 nucleotidi con la sequenza di visone più vicina.

I dipendenti campionati presso l’allevamento di visoni NB8 raggruppati con animali di NB12, il che può essere spiegato dallo scambio di personale tra queste due aziende.

All’interno della diversità agricola

SARS-CoV-2 è stato rilevato nell’allevamento di visoni NB1-NB4 dopo segnalazioni di sintomi respiratori e aumento della mortalità nei visoni. Le sequenze della fattoria NB1 presentavano differenze tra 0 e 9 nucleotidi (media 3,9 nucleotidi) e da NB2 tra 0 e 8 differenze nucleotidi (media 3,6), che è molto di più di quanto è stato osservato nei focolai in ambienti umani.

Le sequenze da NB3 avevano una differenza da 0 a 2 nucleotidi suggerendo che il virus fosse stato introdotto di recente, in linea con la malattia osservata nell’uomo, che si è verificata nelle settimane successive alla diagnosi dell’infezione nel visone. Dopo il rilevamento iniziale di SARS-CoV-2 negli allevamenti di visoni, gli allevamenti sono stati sottoposti a screening settimanalmente.

Il primo, il secondo, il quinto e il sesto screening settimanale hanno prodotto nuovi positivi. Le sequenze di visone a NB6 presentavano differenze tra 0 e 12 nucleotidi, mentre la diversità era inferiore per le sequenze di allevamento successive (Tabella 2).

Diverse mutazioni non sinonime sono state identificate tra le sequenze di visone rispetto alla sequenza di riferimento di Wuhan NC_045512.2. Tuttavia, non sono state trovate particolari sostituzioni di amminoacidi in tutti i campioni di visone ( Figura 5 ).

Da notare, tre dei cluster avevano la variante di posizione 614G (cluster A, C ed E) e 2 avevano la variante originale. Non c’erano differenze evidenti nella presentazione della malattia negli animali o nell’uomo tra i gruppi sulla base dei dati disponibili in questa fase, ma sono in corso ulteriori raccolte e analisi dei dati, anche per i casi successivi a NB16, per indagare ulteriormente su questo.

Le mutazioni osservate possono essere trovate anche nella popolazione generale e le stesse mutazioni sono state trovate anche in casi umani che erano correlati agli allevamenti di visoni.

Discussione

Qui mostriamo la trasmissione in corso di SARS-CoV-2 negli allevamenti di visoni e gli eventi di ricaduta sull’uomo. Per quanto ne sappiamo, questi sono i primi eventi di trasmissione di SARS-CoV-2 da animale a umano documentati. Ulteriori ricerche su visoni e altre specie di mustelidi, per dimostrare se queste specie possono essere un vero serbatoio di SARS-CoV-2, sebbene dalle nostre osservazioni lo consideriamo probabile.

Dopo il rilevamento di SARS-CoV-2 negli allevamenti di visoni, il 68% dei lavoratori agricoli testati e / o parenti o contatti hanno mostrato di essere infetti da SARS-CoV-2, indicando che il contatto con visoni infetti da SARS-CoV-2 è un fattore di rischio per contrarre COVID-19.

È stata osservata un’elevata diversità nelle sequenze di alcuni allevamenti di visoni che molto probabilmente può essere spiegata da molte generazioni di animali infetti prima che si osservasse un aumento della mortalità.

Le stime attuali indicano che il tasso di sostituzione di SARS-CoV-2 è di circa 1,16 * 10 ^ -3 sostituzioni / sito / anno ( 53 ), che corrisponde a circa una mutazione ogni due settimane. Ciò potrebbe significare che il virus circolava già da tempo negli allevamenti di visoni. Tuttavia, è stata osservata anche una diversità di sequenza relativamente elevata negli allevamenti che sono risultati ancora negativi una settimana prima, suggerendo un’evoluzione più rapida del virus nella popolazione di visoni.

Ciò può indicare che il virus potrebbe replicarsi in modo più efficiente nel visone o potrebbe aver acquisito mutazioni che rendono il virus più virulento. Tuttavia, non sono state trovate mutazioni specifiche in tutti i campioni di visone, rendendo meno probabile un aumento della virulenza. Inoltre, gli allevamenti di visoni hanno grandi popolazioni di animali che potrebbero portare a una trasmissione del virus molto efficiente. Gli intervalli di generazione per SARS-CoV-2 negli esseri umani sono stati stimati intorno a 4-5

giorni ( 54 ), ma con dosi elevate l’esposizione in un allevamento ad alta densità potrebbe essere potenzialmente più breve. Recentemente, una specifica mutazione nella proteina spike (D614G) ha dimostrato di provocare un aumento della virulenza in vitro ( 55 ), mentre non è stata associata un aumento del tasso di crescita per i cluster né un aumento della mortalità ( 56 ).

Questa mutazione era presente nei cluster di allevamento A, C ed E, ma non sono state osservate differenze evidenti nella presentazione clinica, gravità della malattia o velocità di trasmissione all’uomo.

Sebbene abbiamo trovato sequenze corrispondenti alle sequenze di animali in diversi allevamenti, non tutte possono essere considerate trasmissioni zoonotiche dirette.

Ad esempio, i due dipendenti dell’allevamento di visoni NB3 sono stati molto probabilmente infettati mentre lavoravano nell’allevamento di visoni, dato il raggruppamento specifico nell’albero filogenetico e la tempistica dell’infezione. Successive infezioni umane possono aver avuto origine da ulteriori infezioni zoonotiche o dalla trasmissione da uomo a uomo all’interno della loro famiglia.

Un’ulteriore prova che gli animali erano la fonte più probabile di infezione è stata fornita dalla chiara separazione filogenetica tra casi umani correlati all’allevamento e casi animali, dalle sequenze di casi all’interno della stessa area del codice postale a 4 cifre. La ricaduta nella comunità che vive nella stessa area del codice postale a 4 cifre non è stata osservata utilizzando i dati di sequenza, ma non può essere completamente esclusa poiché la strategia di test durante aprile e maggio si è concentrata sugli operatori sanitari, le persone con sintomi più gravi e persone a rischio di complicazioni, piuttosto che monitorare la trasmissione nella comunità e i casi più lievi.

Mentre il numero di individui infetti da SARS-CoV-2 stava diminuendo nei Paesi Bassi a maggio e giugno, è stato osservato un aumento nel rilevamento di SARS-CoV-2 negli allevamenti di visoni. Sulla base del WGS, queste sequenze fanno parte di più catene di trasmissione individuali legate agli allevamenti di visoni e non riflettono la situazione nella popolazione umana durante questo periodo.

In alcuni casi, le aziende agricole avevano lo stesso proprietario, ma in altri casi non è stato possibile stabilire alcun legame epidemiologico. Le persone che vengono nelle diverse fattorie potrebbero essere a

fonte, ma anche i gatti semi-selvatici che vagano per le fattorie o la fauna selvatica potrebbero avere un ruolo ( 27 ). Finora, l’indagine non è riuscita a identificare i fattori comuni che potrebbero spiegare la diffusione da fattoria a fattoria. Durante le interviste, è emerso chiaramente che le aziende agricole avevano assunto occasionalmente lavoratori temporanei che non erano stati inclusi nel test e che erano stati persi al follow-up, sottolineando la necessità di una biosicurezza vigorosa e di una guida per la salute sul lavoro.

Dal momento che la nostra osservazione, SARS-CoV-2 infezioni sono anche stati descritti in allevamenti di visoni in Danimarca, Spagna e Stati Uniti ( 57 – 59 ), e l’allevamento di visone è comune in altre regioni del mondo e, anche in Cina, dove circa il 26 ogni anno vengono prodotte milioni di pelli di visone ( 60 ). La dimensione della popolazione e la struttura degli allevamenti di visoni è tale che è concepibile che SARS-CoV-2 – una volta introdotto – possa continuare a circolare. Pertanto, il monitoraggio e la cooperazione continui tra i servizi sanitari umani e animali sono fondamentali per evitare che gli animali fungano da serbatoio per l’infezione continua negli esseri umani.

Riferimenti

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SUPPLEMENTO

LINK DI RIFERIMENTO: https://doi.org/10.1101/2020.09.01.277152 – Questo articolo è una prestampa e non è stato certificato da peer review