COVID-19: i ricercatori hanno scoperto che l’anticorpo CV30 è 530 volte più potente di qualsiasi altro concorrente

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Gli scienziati del Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle hanno dimostrato che un potente anticorpo di un sopravvissuto al COVID-19 interferisce con una caratteristica chiave sulla superficie dei picchi distintivi del coronavirus e induce pezzi critici di quei picchi a rompersi nel processo.

L’anticorpo – una minuscola proteina a forma di Y che è una delle principali armi del corpo contro gli agenti patogeni, inclusi i virus – è stato isolato dal team di Fred Hutch da un campione di sangue ricevuto da un paziente dello stato di Washington nei primi giorni della pandemia.

Il team guidato da Drs. Leo Stamatatos, Andrew McGuire e Marie Pancera avevano precedentemente riferito che, tra dozzine di diversi anticorpi generati naturalmente dal paziente, questo – soprannominato CV30 – era 530 volte più potente di tutti i suoi concorrenti.

Utilizzando strumenti derivati ​​dalla fisica delle alte energie, il biologo strutturale di Hutch Pancera e il suo collega post-dottorato Dr. Nicholas Hurlburt hanno ora mappato la struttura molecolare di CV30. Loro ei loro colleghi hanno pubblicato i loro risultati online oggi sulla rivista Nature Communications.

Il prodotto della loro ricerca è un insieme di immagini 3-D generate al computer che a un occhio inesperto sembrano una massa indisciplinata di spaghetti.

Ma agli scienziati mostrano le forme precise delle proteine ​​che comprendono le strutture superficiali critiche degli anticorpi, il picco del coronavirus e il sito di legame del picco sulle cellule umane. I modelli descrivono come queste strutture possono combaciare come pezzi di un puzzle 3-D.

“Il nostro studio mostra che questo anticorpo neutralizza il virus con due meccanismi. Uno è che si sovrappone al sito bersaglio del virus sulle cellule umane, l’altro è che induce la dispersione o la dissociazione di una parte del picco dal resto “, ha detto Pancera.

Sulla superficie della complessa struttura dell’anticorpo c’è un punto sulla punta di ciascuno dei suoi bracci flosci a forma di Y.

Questo pezzetto di molecole infinitamente piccolo può allungarsi ordinatamente su un punto del picco del coronavirus, un sito che altrimenti funziona come un rampino per aggrapparsi a un sito di aggancio su cellule umane.

L’obiettivo di questi ganci è il recettore ACE2, una proteina presente sulla superficie delle cellule che rivestono i tessuti polmonari ei vasi sanguigni umani.

Ma se gli anticorpi CV30 coprono quei ganci , il coronavirus non può agganciarsi facilmente al recettore ACE2. La sua capacità di infettare le cellule è attenuata.

Questo anticorpo molto efficace non solo blocca la parte commerciale del picco del coronavirus, ma apparentemente causa il taglio di una sezione di quel picco, noto come S1,. Il ricercatore di Hutch McGuire e il suo team di laboratorio hanno eseguito un esperimento che mostra che, in presenza di questo anticorpo, c’è una riduzione del legame dell’anticorpo nel tempo, suggerendo che la sezione S1 è stata eliminata dalla superficie della punta.

La proteina S1 svolge un ruolo cruciale nell’aiutare il coronavirus a entrare nelle cellule. La ricerca indica che dopo che il picco entra in contatto con il recettore ACE2, la proteina S1 oscilla come un cancello per aiutare il virus a fondersi con la superficie cellulare catturata e scivolare all’interno.

Una volta all’interno di una cellula, il virus dirotta i componenti del suo gene e il meccanismo di produzione delle proteine ​​per creare più copie di se stesso che vengono infine rilasciate per infettare altre cellule bersaglio.

I biologi strutturali di Fred Hutch hanno sviluppato immagini 3-D di un anticorpo pescato dal sangue di un precoce sopravvissuto al COVID-19 che ha neutralizzato in modo efficiente il coronavirus. Il dottor Nicholas Hurlburt, che ha contribuito a sviluppare le immagini, racconta questo breve video che mostra come quell’anticorpo interagisce con i famigerati picchi del coronavirus, bloccando la loro capacità di legarsi a un recettore sulle cellule umane che altrimenti rappresenta una porta all’infezione. Credito: video di Robert Hood / Fred Hutch News Service, immagini per gentile concessione di Nicholas Hurlburt.

La dimensione incredibilmente piccola degli anticorpi è difficile da comprendere. Queste proteine ​​sono così piccole che sembrerebbero sciamare come zanzare attorno a un virus la cui struttura può essere vista solo usando il più potente dei microscopi. Le minuscole caratteristiche molecolari Il team di Pancera concentrato sulle punte della proteina dell’anticorpo sono misurate in nanometri, miliardesimi di metro.

Tuttavia, i biologi strutturali dotati degli strumenti giusti possono ora costruire immagini 3D accurate di queste proteine, dedurre come parti di queste strutture si adattano come pezzi di un puzzle e persino animare le loro interazioni.

La chiave per costruire modelli di queste proteine ​​su nanoscala è l’uso della cristallografia a raggi X. I biologi strutturali determinano le forme delle proteine ​​illuminando campioni congelati e cristallizzati di queste molecole con raggi X estremamente potenti.

I raggi X più potenti provengono da un gigantesco strumento noto come sorgente di luce di sincrotrone. Nato da esperimenti di distruzione di atomi risalenti agli anni ’30, un sincrotrone è un anello di magneti estremamente potenti che vengono utilizzati per accelerare un flusso di elettroni attorno a una traccia circolare a una velocità prossima alla velocità della luce. I sincrotroni sono così costosi che solo i governi possono costruirli e gestirli. Ce ne sono solo 40 nel mondo.

Il lavoro di Pancera ha utilizzato l’Advanced Photon Source, un sincrotrone presso l’Argonne National Laboratory vicino a Chicago, gestito dall’Università di Chicago e dal Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti. L’anello di Argonne ha un diametro di 1.200 piedi e si trova su un sito di 80 acri.

Mentre gli elettroni sfrecciano attorno all’anello di sincrotrone, emettono raggi X enormemente potenti, molto più luminosi del sole ma emessi in lampi di raggi più piccoli di un punto.

I biologi strutturali di tutto il mondo si affidano a queste brillanti linee di raggi X per illuminare cristalli congelati di proteine. Rivelano la loro struttura nel modo in cui questi raggi luminosi sono piegati mentre passano attraverso le molecole. Occorrono computer potenti per tradurre la lettura dei dati di questi esperimenti di sincrotrone nelle immagini di proteine ​​che vengono infine completate dai biologi strutturali.

Il lavoro del team di Fred Hutch su CV30 si basa su quello di altri biologi strutturali che stanno studiando una famiglia in crescita di potenti anticorpi neutralizzanti contro il coronavirus.

L’obiettivo della maggior parte dei candidati al vaccino contro il coronavirus è stimolare e addestrare il sistema immunitario a produrre anticorpi neutralizzanti simili, in grado di riconoscere il virus come invasore e fermare le infezioni da COVID-19 prima che possano prendere piede.

Gli anticorpi neutralizzanti dal sangue dei pazienti COVID-19 recuperati possono anche essere infusi in pazienti infetti, un approccio sperimentale noto come terapia al plasma di convalescenza.

Il plasma donato contiene un’ampia varietà di anticorpi diversi di potenza variabile. Anche se una volta si pensava promettente, studi recenti hanno messo in dubbio la sua efficacia.

Tuttavia, le aziende farmaceutiche stanno sperimentando combinazioni di potenti anticorpi neutralizzanti che possono essere coltivati ​​in laboratorio. Questi “cocktail di anticorpi monoclonali” possono essere prodotti su scala industriale per essere somministrati mediante infusione a pazienti infetti o somministrati come farmaci profilattici per prevenire l’infezione.

Dopo essere sceso con COVID-19 , il presidente Trump ha ricevuto un farmaco anticorpo monoclonale sperimentale testato in studi clinici dalla società biotecnologica Regeneron, e attribuisce la sua guarigione apparentemente rapida al trattamento medico avanzato che ha ricevuto.

Il team di ricerca di Fred Hutch spera che la proteina che hanno scoperto, CV30, possa rivelarsi utile nella prevenzione o nel trattamento del COVID-19. Per scoprirlo, questo anticorpo, insieme ad altre proteine ​​candidate che il loro team sta studiando, deve essere testato preclinicamente e poi in prove umane.

“È troppo presto per dire quanto potrebbero essere bravi”, ha detto Pancera.


COVID-19 è stata dichiarata pandemia nel marzo 2020 dall’Organizzazione mondiale della sanità1. All’11 giugno 2020, ci sono stati ~ 7,4 milioni di infezioni e oltre 415.000 decessi in tutto il mondo2. È causato da un coronavirus della famiglia beta, denominato SARS-CoV-23, poiché è strettamente correlato a SARS-CoV4.

I loro genomi condividono l’80% di identità e utilizzano l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) come recettore per l’ingresso5-11. L’ingresso virale dipende dalla glicoproteina spike SARS-CoV-2, una proteina di fusione di classe I composta da due subunità, S1 e S2. S1 media il legame ACE2 attraverso il dominio di legame del recettore (RBD), mentre la subunità S2 media la fusione.

Complessivamente il picco condivide il 76% di omologia della sequenza di amminoacidi con SARS4. Le strutture ad alta risoluzione del picco stabilizzato di SARS-CoV-2 nella prefusione hanno rivelato che l’RBD può essere visto in una conformazione ‘su’ o ‘giù ‘5,6. È stato dimostrato che alcuni degli anticorpi neutralizzanti si legano all’RBD nel’ up ‘conformazione simile a quando il recettore ACE2 si lega12.

Attualmente non è disponibile alcun vaccino per prevenire l’infezione da SARS-CoV-2 e non sono state ancora sviluppate terapie altamente efficaci. Anche la risposta immunitaria dell’ospite a questo nuovo coronavirus non è ben compresa.

Noi e altri abbiamo cercato di caratterizzare la risposta immunitaria umorale di pazienti con COVID-19 infetti12-14. Recentemente, abbiamo isolato un anticorpo neutralizzante, denominato CV30, che si lega al dominio di legame del recettore (RBD), neutralizza con 0,03 μg / ml e compete legandosi con ACE215.

Tuttavia, il meccanismo molecolare con cui CV30 ha bloccato il legame ACE2 era sconosciuto. Qui, presentiamo la struttura cristallina 2,75 A di SARS-CoV-2 RBD in complesso con il Fab di CV30 (Extended Data Table 1).

CV30 si lega quasi esclusivamente all’epitopo di legame ACE2 concavo (noto anche come motivo di legame del recettore (RBM)) del RBD utilizzando tutti e sei i loop CDR con una superficie sepolta totale di ~ 1004 Å2, ~ 750 Å2 dalla catena pesante e ~ 254 Å2 dalla catena kappa (Fig. 1A).

20 residui delle catene pesanti e 10 residui della catena kappa interagiscono con il RBD, formando rispettivamente 13 e 2 legami idrogeno (Fig. 1C e Tabella 2 dei dati estesi). Ci sono 29 residui del RBD che interagiscono con CV30, 19 residui con la catena pesante, 7 residui con la catena leggera e 3 residui con entrambi (Extended Data Table 2).

Dei 29 residui interagenti del SARS-CoV-2 RBD, solo 16 sono conservati nella proteina SARS-CoV S RBD (Fig. 2c), il che potrebbe spiegare la mancanza di reattività crociata di CV30 a SARS-CoV S15.

La catena pesante CV30 è minimamente mutata con solo una variazione di due residui dalla linea germinale ed entrambi questi residui (Val27-Ile28) si trovano nel CDRH1 e formano interazioni non polari con il RBD.

Abbiamo ripristinato questi residui in linea germinale per valutare il loro ruolo. È interessante notare che l’anticorpo germinale CV30 (glCV30) legato a RBD con affinità ~ 100 volte inferiore (affinità 407 nM) (Fig 1d e Tabella dati estesa 3) rispetto a CV30 (3,6 nM15) con una differenza molto grande nell’off-rate . glCV30 ha neutralizzato SARS-CoV-2 con una differenza di ~ 500 volte con un IC50 di 16,5 vs 0,03 μg / mL per CV30 (Fig. 1e).

Val27 forma una debole interazione non polare con l’RBD Asn487 e si trova in una tasca formata da CDRH1 e 3. Sebbene non sia chiaro, Phe27 presente in glCV30 potrebbe modificare l’ambiente elettrostatico. La catena laterale Ile28 forma interazioni non polari con l’RBD Gly476-Ser447, in particolare l’atomo Cγ, che glCV30 Thr sarebbe incapace di creare. Pertanto, la maturazione minima dell’affinità di CV30 ha avuto un impatto significativo sulla capacità di questo mAb di neutralizzare SARS-CoV-2.

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Figura 1.
Struttura complessiva di CV30 Fab in complesso con SARS-CoV-2 RBD e cinetica di glCV30.
un. La struttura è mostrata in cartone con la rappresentazione della superficie mostrata in trasparenza. La catena pesante CV30 è mostrata in blu scuro e la catena leggera in azzurro. RBD è mostrato in rosa. b. Allineamento di sequenza di catene pesanti e leggere CV30 con geni germinali. I cerchi neri sotto la sequenza indicano i residui che interagiscono con il RBD. c. Dettagli delle interazioni delle catene pesanti (sinistra) e leggere (destra) con il RBD. I CDR sono etichettati e colorati come mostrato. I residui che interagiscono sono mostrati come bastoncini e i legami idrogeno sono mostrati in linee tratteggiate. d. Cinetica del legame di glCV30 a RBD misurata da BLI. e. neutralizzazione glCV30 e CV30 dello pseudovirus SARS-CoV-2.
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Figura 2.
Confronto dell’epitopo CV30 con ACE2 e altri anticorpi neutralizzanti.
un. Sovrapposizione strutturale del complesso ACE2 / RBD con il complesso CV30 / RBD. b. Allineamento strutturale dei domini variabili di CV30, B38 e CB6. c. Allineamento della sequenza di SARS-CoV RBD e SARS-CoV-2 RBD. I residui che interagiscono con ACE2 sono indicati dai cerchi neri. I residui che interagiscono con CV30, B38 e CB6 sono indicati dai quadrati colorati (interazioni di catene leggere), cerchi (interazioni di catene pesanti) o triangoli (interazioni con entrambe le catene). d. Rappresentazione superficiale del RBD con l’epitopo legante colorato. Le interazioni delle catene leggere sono il colore più chiaro, le interazioni delle catene pesanti sono le prossime più chiare e le interazioni specifiche CDRH3 sono le più scure e l’interazione con le catene pesanti e leggere è viola.

CV30 compete con ACE2 per il legame con RBD15 e abbiamo quindi esaminato il meccanismo strutturale del blocco del recettore sovrapponendo il complesso SARS-CoV-2 RBD / ACE2 (PDB: 6LZG) 9 con il complesso CV30 Fab / RBD. La struttura del RBD è stata utilizzata per allineare i due complessi e ha mostrato che il legame CV30 non ha indotto alcun cambiamento conformazionale nel RBD dal complesso legato ad ACE2.

L’RBD allineato aveva un RMSD di 0,353 Å su 166 atomi di Cα. La struttura rivela che l’epitopo CV30 si sovrappone quasi completamente all’epitopo ACE2. Un totale di 26 residui di SARS-CoV-2 RBD interagiscono con hACE2, CV30 si lega a 19 di questi residui (Fig. 2A), indicando che CV30 neutralizza il virus impedendo il legame di ACE2 a RBD tramite interazioni steriche dirette.

Recentemente, è stata pubblicata la struttura di due potenti anticorpi neutralizzanti anti-RBD, B38 e CB612,14. CV30 condivide una linea germinale simile dei geni V della catena pesante ma tutti e tre hanno diversi geni kappa della linea germinale V (CV30 è IGKV3–20 01, B38 è IGKV1–9 01, CB6 è IGKV1–39 01, Extended Data Fig. 1). Sia CV30 che B38 usano IGHV3–53 01 mentre CB6 usa IGHV3–66 01, che è solo un amminoacido diverso da 3–53 01 (Val12 che non entra in contatto con l’epitopo).

CV30 e CB6 hanno ciascuna affinità più elevate, rispettivamente 3,6 nM e 2,5 nM, rispetto a B38, 70,1 nM12,14,15. Le differenze di affinità si traducono in differenze nella potenza di neutralizzazione (gli IC50 per CV30 e CB6 sono rispettivamente 0,03 e 0,036 μg / mL e quello di B38 è 0,177 μg / mL).

È interessante notare che Thr28 è stato anche mutato da germinale a Ile in B38 ma Phe27 non lo era. CB6 manca di entrambe le mutazioni trovate in CV30.

Le differenze in altre regioni dell’anticorpo, come il CDRH3 e la catena leggera, sono probabilmente responsabili della potenza complessiva di tutti questi anticorpi (vedi sotto). Per studiare il meccanismo di legame dei tre anticorpi, è stata creata una sovrapposizione delle strutture. Tutti e tre si legano in modo quasi identico con lo stesso angolo di approccio e impronte simili (Fig. 2b).

L’allineamento delle regioni Fv di B38 e CB6 alla regione Fv di CV30 aveva un RMSD di 0,240Å su 100 atomi di Cα e 0,329Å su 98 atomi di Cα, rispettivamente. La mappatura delle interazioni di legame del RBD a ciascuno degli anticorpi rivela una stretta sovrapposizione nel meccanismo di legame (Fig. 2c – d).

L’impronta della catena pesante è quasi identica, come ci si aspetta dal gene V germinale condiviso e dalla somiglianza di sequenza. CV30 e CB6 hanno entrambi un CDRH3 più lungo e si legano con una superficie sepolta maggiore, ~ 263 e ~ 251 Å2, rispettivamente, rispetto a B38 (~ 203 Å2) (Fig. 2d, Dati estesi Fig.1).

La grande differenza è nella catena leggera. CV30 ha l’interazione di legame più piccola a ~ 254 Å2, B38 ha l’interazione più grande a ~ 497 Å2 e quindi CB6 a ~ 354Å2. Uno dei risultati più interessanti è stata l’interazione di Thr56 nel CV30 CDRK2 che si estende attraverso il RBD e interagisce con Phe486, un’interazione che non si trova negli altri due anticorpi (Extended Data Fig. 1).

In conclusione, la nostra struttura indica che potenti anticorpi neutralizzanti contro SARS-CoV-2 si legano al motivo di legame del recettore nel RBD, sovrapponendosi al sito di legame ACE2, ma riconoscono residui che sono specifici solo per SARS-CoV-2, spiegando così la mancanza di neutralizzazione incrociata con SARS-CoV.

È interessante notare che anticorpi neutralizzanti potenti isolati da più individui utilizzano lo stesso gene VH o simile per mirare al loro epitopo. Inoltre, la maturazione di affinità minima osservata 21 giorni dopo l’infezione nel gene VH di CV30 ha mostrato un aumento di circa 100-500 volte nell’affinità e nella potenza di neutralizzazione, indicando che un’ulteriore maturazione dell’affinità può aumentare la potenza e la potenziale reattività crociata.

I nostri studi indicano che il RBD è un obiettivo promettente per la progettazione di vaccini e che questi anticorpi potenti neutralizzanti dovrebbero essere esplorati come trattamento per l’infezione da COVID-19.

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More information: Nicholas K. Hurlburt et al, Structural basis for potent neutralization of SARS-CoV-2 and role of antibody affinity maturation, Nature Communications (2020). DOI: 10.1038/s41467-020-19231-9

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