La mutazione D614G ha reso il COVID-19 più contagioso

Uno studio che ha coinvolto più di 5.000 pazienti COVID-19 a Houston ha scoperto che il virus che causa la malattia sta accumulando mutazioni genetiche, una delle quali potrebbe averlo reso più contagioso.

Secondo il documento pubblicato sulla rivista peer-reviewed mBIO, quella mutazione, chiamata D614G, si trova nella proteina spike che apre le nostre cellule per l’ingresso virale. 

È il più grande studio peer-reviewed sulle sequenze del genoma di SARS-CoV-2 in una regione metropolitana degli Stati Uniti fino ad oggi.

Il documento mostra che “il virus sta mutando a causa di una combinazione di deriva neutra – che significa semplicemente cambiamenti genetici casuali che non aiutano o danneggiano il virus – e la pressione del nostro sistema immunitario”, ha detto Ilya Finkelstein, professore associato di bioscienze molecolari a L’Università del Texas ad Austin e coautore dello studio. Lo studio è stato condotto da scienziati dello Houston Methodist Hospital, UT Austin e altrove.

Durante l’ondata iniziale della pandemia, il 71% dei nuovi coronavirus identificati nei pazienti di Houston presentava questa mutazione. Quando la seconda ondata dell’epidemia ha colpito Houston durante l’estate, questa variante era balzata al 99,9% di prevalenza.

Ciò rispecchia una tendenza osservata in tutto il mondo. Uno studio pubblicato a luglio basato su oltre 28.000 sequenze genomiche ha rilevato che le varianti portatrici della mutazione D614G sono diventate la forma dominante a livello globale di SARS-CoV-2 in circa un mese. SARS-CoV-2 è il coronavirus che causa COVID-19.

Allora perché i ceppi contenenti questa mutazione hanno superato quelli che non l’avevano?

Forse sono più contagiosi. Uno studio su oltre 25.000 sequenze genomiche nel Regno Unito ha scoperto che i virus con la mutazione tendevano a trasmettersi leggermente più velocemente di quelli senza di essa e causavano gruppi più grandi di infezioni.

La selezione naturale favorirebbe i ceppi del virus che si trasmettono più facilmente. Ma non tutti gli scienziati sono convinti. Alcuni hanno suggerito un’altra spiegazione, chiamata “effetti del fondatore”.

In quello scenario, la mutazione D614G avrebbe potuto essere più comune nei primi virus ad arrivare in Europa e Nord America, essenzialmente dando loro un vantaggio su altri ceppi.

La proteina spike continua anche ad accumulare ulteriori mutazioni di significato sconosciuto.

Il team Houston Methodist-UT Austin ha anche dimostrato in esperimenti di laboratorio che almeno una di queste mutazione consente a spike di eludere un anticorpo neutralizzante che gli esseri umani producono naturalmente per combattere le infezioni da SARS-CoV-2.

Ciò potrebbe consentire a quella variante del virus di sfuggire più facilmente al nostro sistema immunitario. Sebbene non sia ancora chiaro se ciò si traduca in una più facile trasmissione tra individui.

La buona notizia è che questa mutazione è rara e non sembra rendere la malattia più grave per i pazienti infetti. Secondo Finkelstein, il gruppo non ha visto virus che hanno imparato a eludere i vaccini di prima generazione e le formulazioni di anticorpi terapeutici.

“Il virus continua a mutare mentre squarcia il mondo”, ha detto Finkelstein. “Gli sforzi di sorveglianza in tempo reale come il nostro studio garantiranno che i vaccini e le terapie globali siano sempre un passo avanti”.

Gli scienziati hanno notato un totale di 285 mutazioni in migliaia di infezioni, anche se la maggior parte non sembra avere un effetto significativo sulla gravità della malattia. 

Gli studi in corso stanno continuando per sorvegliare la terza ondata di pazienti con COVID-19 e per caratterizzare come il virus si sta adattando agli anticorpi neutralizzanti prodotti dal nostro sistema immunitario. 

Ogni nuova infezione è un tiro di dado, un’ulteriore possibilità di sviluppare mutazioni più pericolose.

“Abbiamo dato a questo virus molte possibilità”, ha detto al Washington Post l’autore principale James Musser di Houston Methodist. “C’è una popolazione enorme là fuori in questo momento.”

Diversi altri autori di UT Austin hanno contribuito al lavoro: il visiting scholar Jimmy Gollihar, il professore associato di bioscienze molecolari Jason S. McLellan e gli studenti laureati Chia-Wei Chou, Kamyab Javanmardi e Hung-Che Kuo.

Il team di UT Austin ha testato diverse varianti genetiche della proteina spike del virus, la parte che gli consente di infettare le cellule ospiti, di misurare la stabilità della proteina e di vedere quanto bene si lega a un recettore sulle cellule ospiti e agli anticorpi neutralizzanti. 

All’inizio dell’anno, McLellan e il suo team dell’UT Austin, in collaborazione con i ricercatori del National Institutes of Health, hanno sviluppato la prima mappa 3-D della proteina spike del coronavirus per un’innovazione che ora tiene conto dei progetti di diversi candidati vaccini leader.

I ricercatori hanno scoperto che SARS-CoV-2 è stato introdotto nell’area di Houston molte volte, indipendentemente, da diverse regioni geografiche, con ceppi virali provenienti da Europa, Asia, Sud America e altrove negli Stati Uniti. C’è stata una diffusione diffusa nella comunità subito dopo la segnalazione dei casi di COVID-19 a Houston.

Una versione precedente del documento è stata pubblicata il mese scorso sul server di prestampa medRxiv.

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I candidati al vaccino COVID-19 prendono di mira principalmente la glicoproteina trimerica “spike” (S), poiché questo fattore consente il legame ai recettori di superficie dell’ospite dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) e facilita l’ingresso del virus nelle cellule1.

Negli ultimi mesi, si è verificato un cambiamento dell’amminoacido da aspartato a glicina nella posizione 614 della proteina S (risultante da un singolo cambiamento del nucleotide da A a G nella posizione 23.403 nel genoma di riferimento di Wuhan-Hu-1), con varianti G614 che rappresentano il 75% delle sequenze genomiche pubblicate in tutto il mondo a partire dal 1 ° luglio 2020.

Questa mutazione ha portato a una serie di articoli e preprint che postulano che gli isolati contenenti questa mutazione ‘D614G’ hanno un vantaggio strutturale2, incluso come substrato migliore per il dominio di scissione della furina S13, e sono associati ad un aumento di:

• a) trasmissibilità e carica virale4;
• (b) trasduzione di cellule umane2,5;
• c) patogenicità e caso fatale6.

Ciò ha portato a ipotizzare che l’efficacia dei vaccini e delle contromisure che prendono di mira la proteina S potrebbe essere influenzata negativamente, richiedendo frequenti abbinamenti con i vaccini.

Risultati e discussione

Abbiamo testato questa ipotesi con sieri di furetti immunizzati con un candidato vaccino COVID-19 che prende di mira la proteina S (variante D614) e abbiamo utilizzato modelli biomolecolari per interpretare i nostri risultati. Abbiamo utilizzato isolati australiani che possiedono o mancano della mutazione D614G ma sono altrimenti comparabili nella sequenza della proteina S e anche privi di mutazioni significative di conseguenza all’interno delle proteine ​​virali responsabili del legame e dell’ingresso delle cellule (come rilevato con il software Geneious Prime 2020.1; cfr Tabella supplementare 1 ).

Isolati presso il Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory7, gli isolati australiani ‘VIC01’ e ‘SA01’ (che sono D614) e ‘VIC31’ (che sono G614), sono stati utilizzati in saggi standard di neutralizzazione dei virus preformati presso l’Australian Center for Disease Preparedness, come descritto in Metodi.

Precedenti studi su roditori con INO-4800 hanno dimostrato l’induzione di risposte immunitarie umorali e cellulari mirate alla proteina spike SARS-CoV-28. In questo studio, è stato dimostrato che i furetti hanno sviluppato risposte anticorpali neutralizzanti SARS-CoV-2 in seguito alla vaccinazione con INO-4800, dimostrando che i furetti sono un animale appropriato per modellare l’immunogenicità del vaccino COVID-19 e che questo vaccino a DNA stimola un’efficace cellula B risposta.

Il titolo di neutralizzazione log2 mediano complessivo contro i tre isolati di virus combinati era 6,32 (intervallo da 4,32 a 8,32). Il confronto dei titoli per isolato di virus (SA01, VIC01 e VIC31) ha rivelato che la mutazione D614G ha avuto scarso effetto sull’efficienza di neutralizzazione dopo la vaccinazione (Fig. 1). Infatti, i titoli di neutralizzazione medi trasformati log complessivi per la variante VIC31 (la variante G614) non erano significativamente differenti da quelli per gli isolati SA01 e VIC01 che possiedono il D614 (p> 0,05).

Abbiamo utilizzato modelli molecolari della proteina spike (sia le nostre simulazioni di dinamica molecolare che un altro modello spike9) per esaminare il contesto strutturale della mutazione D614G per affrontare possibili preoccupazioni sull’efficacia avversa del vaccino e la plausibilità dei vantaggi di selezione recentemente proposti2-5.

La proteina S del coronavirus comprende due sezioni, S1 e S2, e forma un trimero transmembrana fortemente glicosilato che facilita sia l’attacco dell’ospite (tramite il dominio di legame del recettore ‘RBD’ in S1), sia la fusione / entrata cellulare (tramite una fusione della membrana trimerica S2 peduncolo) dopo la scissione proteolitica della giunzione S1 / S210 (Fig. (Fig. 2a) .2a).

La proteina SARS-CoV-2 S è diversa dai coronavirus correlati in quanto contiene un motivo della proproteina convertasi (PPC) al confine S1 / S2, che ha dimostrato di essere pre-scisso nei test di ingresso cellulare dello pseudovirus dalla proproteina convertasi furin10, 11.

La posizione 614 in S è a monte del sito di scissione della furina S1 / S2 (R685 / S686) 9 ed è incassata in una posizione dell’interfaccia sepolta del monomero adiacente mentre è inoltre schermata da un glicano N-collegato nella posizione N61612 (Fig. 2b ). Data la sua posizione interna, è improbabile che la variante G614 sia un componente di epitopi neutralizzanti sulla proteina S e quindi una mancanza di effetti negativi sull’efficienza di neutralizzazione degli anticorpi generati a seguito della vaccinazione con vaccini derivati ​​dal D614 non è inaspettata.

In effetti, la posizione del residuo 614 in S è distinta da entrambi gli epitopi neutralizzanti lineari13.

Sebbene siamo d’accordo con gli studi che suggeriscono che la mutazione D614G introduce un sito di scissione dell’elastasi14, le nostre simulazioni di dinamica molecolare non supportano la loro inferenza di una maggiore efficienza di replicazione promuovendo la scissione S1 / S2 mediata dall’elastasi.

La modellazione di S in presenza di proteasi sia della furina che dell’elastasi suggerisce che, mentre la furina può accedere al sito di scissione S1 / S2 (Fig. S1), l’elastasi non è in grado di accedere al sito di scissione dell’elastasi introdotto da G614 a causa del suo posizionamento dell’interfaccia e blocco del glicano (Fig. S2a) a meno che il cappuccio del trimero S1 e S2 non si separino (Fig. S2b).

Recenti scoperte2 hanno suggerito che l’infettività superiore di G614 è dovuta alla mutazione D614G che stabilizza l’interazione tra i domini S1 e S2. Tuttavia, il nostro esame di D614 (situato in S1) rivela interazioni con S2, non solo attraverso interazioni di legami idrogeno con un Thr859 adiacente come precedentemente notato4, ma anche un ponte salino con residuo Lys854 (Fig. (Fig. 2c).

Il cambiamento da aspartato a glicina a 614 rimuove l’inter-catena D614-K854 e potrebbe effettivamente destabilizzare l’interazione tra i domini S1 e S2.

Il nostro approccio in silico ha fornito ulteriori informazioni su un paio di meccanismi che meritano ulteriori indagini, compresi gli esperimenti. In primo luogo, sebbene la nostra simulazione abbia considerato le interazioni tra l’ACE2 umano e l’RBD nel tradizionale orientamento “ verso l’alto ”, nel corso di una breve simulazione di 100 ns abbiamo osservato l’inclinazione dell’ACE2 e il contatto con l’RBD adiacente tramite V445 facendo stretto contatto con P321 e F555 su ACE2.

Ciò suggerisce che l’adiacente RBD nella conformazione ‘down’ potrebbe contribuire al legame e alla specificità di ACE2 (Fig. S3), un’ipotesi supportata da precedenti lavori15 che evidenzia la flessibilità strutturale con tre distinte conformazioni della proteina SARS-CoV S nel complesso con ACE2.

In secondo luogo, una sostituzione parallela da C a U nella posizione 14.408 nel genoma, risultante in una mutazione P323L (P314L in orf1b) nella polimerasi RNA-dipendente (RdRp / nsp12), è stata associata a D614G16 (incluso in VIC31) e dovrebbe pertanto essere considerato per un potenziale contributo all’infettività. La posizione P323 è in una fessura idrofobica a circa 30 Å dal sito catalitico di RdRp, ma vicino all’interfaccia nsp8 (Fig. S4).

Non è immediatamente chiaro quale effetto abbia la mutazione P323L sulla virulenza. La mutazione da Pro323 a Leu può alleviare alcuni vincoli della spina dorsale e contribuire alla stabilità conformazionale locale. Abbiamo notato nel nostro modello basato sulla struttura pdb 6YYT17 che la fessura in nsp12 è prevalentemente rivestita con residui di arginina (R173, R249, R349 e R457) che possono contribuire al legame nucleotidico a causa della forte associazione con i gruppi arginina e fosfato18 (Fig. S4 ). La mutazione P323L sembra ostruire parzialmente R349 nella fessura. Dobbiamo ancora stabilire il significato di questa mutazione.

Data la rapidità con cui questo virus è emerso, devono ancora essere stabiliti i correlati di protezione per le risposte immunitarie. Idealmente, i test di protezione passiva dovrebbero essere eseguiti anche in studi futuri per determinare gli effetti in vivo. Gli approcci di modellazione sperimentale e biomolecolare descritti sopra sono disponibili presso molte organizzazioni in tutto il mondo come la nostra.

Pertanto, sarebbe auspicabile analizzare l’impatto delle mutazioni identificate, in collaborazione con tali organizzazioni, prima di speculare sui potenziali effetti negativi sui vaccini. Man mano che vengono stabiliti cloni infettivi19-21, sarà più facile studiare le mutazioni accumulate, che sono inevitabili per questo virus a RNA, anche con una capacità di “correzione di bozze” di exoribonucleasi.

Pertanto, sollecitiamo cautela quando queste mutazioni sono descritte negli articoli preprint2–5 perché inferenze premature sui loro effetti senza supportare prove sperimentali potrebbero provocare una frenesia dei media e potenzialmente minare la fiducia del pubblico nei vaccini.

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