Dopo il recupero dall’infezione da SARS-CoV-2, la memoria immunologica potrebbe mediare una rapida risposta immunitaria in caso di reinfezione

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Fino ad ora, non era chiaro se un’infezione da SARS-CoV-2 sopravvissuta o COVID-19 portasse a una memoria immunologica persistente e quindi potesse proteggere da una nuova infezione.

Diversi studi hanno dimostrato che gli anticorpi specifici per SARS-CoV-2 sono rilevabili solo per pochi mesi in molte persone sopravvissute al COVID-19 e possono quindi fornire solo una protezione temporanea contro la reinfezione.

Un gruppo di ricerca presso il Medical Center – Università di Friburgo guidato dal Dr. Maike Hofmann, dal Dr. Christoph Neumann-Haefelin e dal Prof.Dr.Robert Thimme è stato ora in grado di mostrare: dopo il recupero dall’infezione SARS-CoV-2 , si formano che rimangono nell’organismo e potrebbero mediare una rapida risposta immunitaria in caso di reinfezione.

Lo studio di Friburgo è stato pubblicato nell’edizione online della rinomata rivista scientifica  Nature Medicine  il 12 novembre 2020.

“Questi cosiddetti linfociti T della memoria dopo l’infezione da SARS-CoV-2 sembrano simili a quelli dopo una vera influenza.

Siamo quindi fiduciosi che la maggior parte delle persone che hanno sofferto di infezione da SARS-CoV-2 abbia una certa protezione contro la reinfezione da SARS-CoV-2 “, spiega il dottor Hofmann, uno scienziato presso il Dipartimento di Medicina II presso il Medical Center – Università di Friburgo.

Il professor Thimme, direttore medico del Dipartimento di Medicina II, sottolinea quanto sia importante un buon ambiente di ricerca traslazionale come quello del Medical Center – Università di Friburgo nella situazione attuale:

“Per ottenere risultati di ricerca solidi entro pochi mesi, uno stretto collegamento in rete tra clinica e scienza al più alto livello è un requisito fondamentale: da un lato, i pazienti con COVID-19 vengono trattati nei nostri reparti e continuano a essere assistiti in un ambulatorio speciale anche dopo che l’infezione è guarita. D’altra parte, la nostra clinica ha una grande esperienza nell’analisi delle cellule immunitarie nelle infezioni virali come l’epatite B e C. “

Il Medical Center – University of Freiburg non è coinvolto nello sviluppo di vaccini contro la SARS-CoV-2. Tuttavia, il dottor Neumann-Haefelin, capo del Gerok Liver Center presso l’ospedale universitario di Friburgo, è ottimista:

“I nostri risultati suggeriscono che l’immunità contro SARS-CoV-2 può essere raggiunta dopo un’infezione. Allo stesso modo, i vaccini attualmente in fase di sperimentazione potrebbero fornire una protezione significativa contro SARS-CoV-2 ″.

“La decifrazione di risposte immunitarie complesse è da tempo parte del centro di ricerca dell’Università e del Medical Center — Università di Friburgo.

Grazie all’elevata qualità scientifica in loco, ora possiamo dare un contributo importante alla pandemia della corona “, afferma il Prof. Dr. Norbert Südkamp, ​​Preside della Facoltà di Medicina dell’Università Albert-Ludwigs di Friburgo.


La rapida diffusione del coronavirus beta SARS-CoV-2 ha infettato 19 milioni e ucciso oltre 700.000 persone in tutto il mondo all’inizio di agosto 2020. L’infezione causa la malattia COVID-19, che varia nella presentazione da asintomatica a fatale. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli individui infetti presenta sintomi lievi che non richiedono il ricovero in ospedale1.

È di fondamentale importanza capire se gli individui infetti da SARS-CoV-2 che guariscono da una malattia lieve sviluppano una memoria immunitaria che li protegge dalle successive infezioni da SARS-CoV-2, riducendo così la trasmissione e promuovendo l’immunità della mandria.

La memoria immunologica è mediata prevalentemente dalle cellule del sistema immunitario adattativo. In risposta alla maggior parte delle infezioni virali acute, le cellule B e T che possono legarsi agli antigeni virali attraverso i loro recettori antigenici si attivano, si espandono, si differenziano e iniziano a secernere molecole effettrici per aiutare a controllare l’infezione.

Dopo la risoluzione dell’infezione, circa il 90% di queste “cellule effettrici” specifiche del virus muore, mentre il 10% persiste come cellule di “memoria” a vita lunga2. Le cellule della memoria immunitaria possono produrre un rifornimento continuo di molecole effettrici, come si vede con le plasmacellule a secrezione di anticorpi (LLPC) a lunga vita.

Nella maggior parte dei casi, tuttavia, i linfociti della memoria quiescente sono strategicamente posizionati per riattivarsi rapidamente in risposta alla reinfezione ed eseguire programmi effettori impressi su di essi durante la risposta primaria. 

Dopo la reinfezione, le cellule B di memoria specifiche del patogeno (MBC) che esprimono i recettori associati all’esperienza dell’antigene e il fattore di trascrizione T-bet proliferano rapidamente e si differenziano in plasmablasti (PB) secernenti anticorpi IgG + 3–5. Le cellule T CD4 + di memoria che esprimono T-bet riattivate proliferano, “aiutano” ad attivare gli MBC e secernono citochine (incluso IFNγ) per attivare le cellule innate2.

Nel frattempo, le cellule T CD8 + della memoria possono uccidere le cellule infettate da virus direttamente attraverso il rilascio di molecole citolitiche6. Queste popolazioni di memoria specifica del virus potenziate quantitativamente e qualitativamente si coordinano per eliminare rapidamente il virus, prevenendo così la malattia e riducendo la possibilità di trasmissione.

Per infettare le cellule e propagarsi, SARS-CoV-2 si basa sull’interazione tra il dominio di legame del recettore (RBD) della sua proteina spike (S) e l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) sulle cellule ospiti7. Diversi studi hanno dimostrato che la maggior parte degli individui infetti da SARS-CoV-2 produce anticorpi specifici per S e RBD durante la risposta primaria e gli anticorpi monoclonali specifici per RBD possono neutralizzare il virus in vitro e in vivo8-10. Pertanto, gli anticorpi specifici per RBD contribuirebbero probabilmente alla protezione contro la reinfezione se espressi da LLPC o MBC.

Per determinare se i suddetti segni distintivi della protezione immunitaria dall’infezione virale si formano e persistono in individui che hanno sperimentato COVID-19 lieve, abbiamo valutato le loro risposte immunitarie specifiche per SARS-CoV-2 a uno e tre mesi dall’insorgenza dei sintomi. Qui dimostriamo che una risposta multipotente della memoria immunitaria specifica per SARS-CoV-2 si forma e viene mantenuta in individui guariti almeno per la durata del nostro studio. Inoltre, i linfociti della memoria mostrano le caratteristiche dell’immunità antivirale protettiva.

Ritorno all’omeostasi immunitaria dopo COVID-19 lievemente sintomatico

Per determinare se le cellule della memoria immunitaria si formano dopo COVID-19 lievemente sintomatico, abbiamo raccolto cellule mononucleate (PBMC) del plasma e del sangue periferico da 15 individui recuperati da COVID-19 (CoV2 +) (UW IRB 00009810). Il gruppo CoV2 + aveva un’età media di 47 anni e ha riportato sintomi lievi della durata mediana di 13 giorni (Tabella 1 ED).

Il primo campione di sangue (Visita 1) è stato prelevato almeno 20 giorni dopo un test PCR positivo per SARS-CoV-2 e una mediana di 35,5 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi. Ci aspettiamo che la risposta primaria si contragga e le popolazioni di memoria precoce vengano generate in questo momento, poiché la carica virale viene eliminata circa 8 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi11.

I partecipanti sono tornati per un secondo prelievo di sangue (Visita 2) una mediana di 86 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi in modo da poter valutare la quantità e la qualità delle popolazioni con memoria a lunga vita (Fig. 1a). Abbiamo confrontato questi campioni con campioni raccolti in due momenti che rappresentano un intervallo di campionamento simile in un gruppo di 17 controlli sani (HC).

Si è ritenuto che tutti gli HC non presentassero una precedente infezione da SARS-CoV-2 sulla base della mancanza di anticorpi plasmatici SARS-CoV-2 RBD o S specifici rilevabili al di sopra delle tre deviazioni standard (DS) della media dei campioni di plasma negativi storici (HN) (ED Fig.1).

Sono stati inclusi anche campioni di PBMC HN raccolti prima della prima infezione umana da SARS-CoV-2 (2016-2019). Li abbiamo inclusi per controllare la possibilità che gli individui nel gruppo HC fossero stati infettati da SARS-CoV-2 (9/17 hanno descritto alcuni sintomi associati all’infezione da SARS-CoV-2) nonostante la loro mancanza di anticorpi specifici RBD rilevabili.

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Figura 1:
anticorpi plasmatici specifici per SARS-CoV-2 in due momenti della memoria a) Cronologia dello  studio. Intervallo indicato dalla casella e dalla mediana indicata dalla linea per ogni evento. b)  Curve di diluizione ELISA e AUC per IgG anti-RBD (sinistra), IgM (centro) e IgA (destra) da controlli sani (HC) e campioni di plasma precedentemente infettati da SARS-CoV-2 (CoV2 + ) alla Visita 1 (V1) e Visita 2 (V2). La linea tratteggiata indica la media + 3 DS dei valori di HC AUC. Ogni simbolo è un individuo diverso ed è coerente in tutta la figura. c)  I  valori di V2 CoV2 + AUC sono stati normalizzati in campioni V1 eseguiti con campioni V2 e AUC per ogni  individuo CoV2 + da V1 e V2 sono accoppiati. d) Percentuale di inibizione del legame tra RBD e ACE2 da parte del plasma alla diluizione 1:10. e)  Correlazione di Spearman tra la percentuale di inibizione del RBD a una diluizione plasmatica di 1:10 e l’AUC delle IgG anti-RBD. f)  Percentuale di CoV2 +  inibizione RBD alla diluizione plasmatica 1:10 normalizzata e accoppiata come in c). g)  Correlazione di Spearman tra la percentuale di inibizione RBD a una diluizione plasmatica di 1:10 e la percentuale di neutralizzazione del virus mediante PRNT a una diluizione plasmatica di 1:80. h)  CoV2 + neutralizzazione percentuale del virus mediante PRNT a una diluizione plasmatica 1:80 normalizzata e accoppiata come in c). Significatività statistica per dati non appaiati determinata da test di Mann-Whitney a due code e, per dati appaiati, da test a ranghi con segno di Wilcoxon a due code. Le barre di errore rappresentano la media e la DS (V1 HC n = 15, V2 HC n = 14, V1 CoV2 +  n = 15, V2 CoV2 +  n = 14).

Le popolazioni di cellule immunitarie innate e adattive attivate si espandono nel sangue durante la risposta primaria all’infezione da SARS-CoV-212.

Quando un’infezione virale acuta viene eliminata, la maggior parte di queste cellule altamente infiammatorie muore o diventa cellule di memoria quiescenti in modo tale che le proporzioni e i fenotipi delle cellule immunitarie totali siano indistinguibili da quelli osservati nei campioni di sangue pre-infezione.

Coerentemente con la risoluzione della risposta primaria, non abbiamo trovato differenze nella frequenza dei monociti totali, sottoinsiemi di monociti o cellule dendritiche plasmacitoidi tra PBMC tra individui CoV2 + e HC (ED Fig. 2).

Non abbiamo inoltre riscontrato differenze nelle frequenze delle cellule T γδ o αβ CD3 + (CD4 + o CD8 +), né nello stato del ciclo cellulare, nell’espressione di molecole associate all’attivazione, migrazione, funzione o proporzioni di vari sottoinsiemi di cellule T di memoria CD45RA (ED Fig. 3). Insieme, questi dati dimostrano che la risposta infiammatoria associata all’infezione acuta si era risolta entro il punto temporale della Visita 1 ed era iniziata la fase precoce della memoria immunitaria.

Il COVID-19 lieve induce un anticorpo IgG anti-SARS-CoV-2 persistente e neutralizzante

Le risposte immunitarie umorali sono caratterizzate da una prima ondata di PB secernenti anticorpi di breve durata e bassa affinità seguita da una successiva risposta del centro germinale (GC) che genera MBC ad alta affinità e LLPC secernenti anticorpi. Gli LLPC possono mantenere titoli anticorpali sierici rilevabili per mesi o molti anni, a seconda della specifica infezione virale13.

Pertanto, è fondamentale distinguere la prima ondata di anticorpi derivati ​​dal PB in declino dall’ondata successiva di anticorpi derivati ​​da LLPC persistenti che possono neutralizzare le infezioni successive, potenzialmente per la vita.

Pertanto abbiamo prima determinato che i PB CD19 + CD20loCD38hi non erano più presenti a frequenze elevate negli individui CoV2 + rispetto agli HC alla Visita 1 (ED Fig. 4a).

Altre misure della recente attivazione delle cellule B in cellule B non PB includono una maggiore espressione di Ki67 (che indica che le cellule sono entrate nel ciclo cellulare) e l’espressione di T-bet14. Ci sono piccoli aumenti in entrambe le frequenze dei linfociti Ki67 + e T-bet + B al punto temporale della Visita 1 rispetto a HC, ma non al punto temporale della Visita 2 (ED Fig. 4b,, c) .c).

Questi dati suggeriscono che mentre i PB associati al controllo dell’infezione acuta non sono più rilevabili negli individui CoV2 + alla Visita 1, il destino di altri linfociti B è ancora in contrazione. Tuttavia, alla visita 2, questi fenotipi delle cellule B sono tornati all’omeostasi (ED Fig. 4a – c).

Gli anticorpi misurati alla Visita 1 potrebbero includere contributi da plasmablasti di breve durata, mentre quelli misurati alla Visita 2, molto tempo dopo che i PB si sono contratti, rappresentano i contributi degli LLPC nel midollo osseo.

Abbiamo quindi esaminato gli anticorpi IgG, IgM e IgA specifici per SARS-CoV-2 alla Visita 1 e alla Visita 215.

Alla Visita 1, il 100% degli individui CoV2 + aveva livelli plasmatici di IgG anti-RBD 3 DS al di sopra della media degli HC, come misurato dall’area ELISA sotto la curva (AUC), in conformità con gli studi che mostrano una sieroprevalenza del 100% entro il giorno 1410 (Fig. 1b).

Inoltre, il 93% degli individui CoV2 + aveva IgM anti-RBD e il 73% aveva IgA anti-RBD al di sopra di questa soglia negativa. Quasi tutti gli individui CoV2 + possedevano anticorpi anti-spike IgG (100%), IgM (100%) e IgA (93%) al di sopra della soglia anche alla Visita 1 (ED Fig. 4d).

I livelli di legame anti-RBD e anti-spike erano altamente correlati per tutti gli isotipi (ED Fig. 4e). Alla Visita 2, tutti gli individui CoV2 + hanno mantenuto livelli di IgG anti-RBD al di sopra della soglia negativa e il 71% e il 36% avevano mantenuto IgM e IgA anti-RBD, rispettivamente (Fig. 1b).

I livelli di IgG anti-RBD sono diminuiti solo leggermente tra gli individui CoV2 + tra i punti temporali e il 36% degli individui CoV2 + ha avuto livelli uguali o aumentati alla visita 2. Tuttavia, gli anti-RBD IgM e IgA sono diminuiti sostanzialmente dalla visita 1 alla visita 2 (Fig. 1c, ED Fig. 4f).

Poiché la proteina spike, e in particolare il RBD, è la chiave per l’ingresso virale nella cellula, gli anticorpi che prendono di mira il RBD possono essere potenti inibitori dell’infezione8,9. Per determinare se gli individui CoV2 + formano e mantengono gli anticorpi neutralizzanti, abbiamo testato la neutralizzazione di SARS-CoV-2 indirettamente utilizzando un test di competizione senza cellule (test di neutralizzazione del virus surrogato, sVNT) e direttamente in un test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT) 16. 

Il plasma CoV2 + ha inibito il legame del RBD all’ACE2 in modo significativamente maggiore rispetto al plasma HC da parte di sVNT e l’inibizione del RBD era fortemente correlata con i livelli di IgG anti-RBD in entrambi i punti temporali (Fig. 1d,, e) .e).

Inoltre, la capacità di inibizione del RBD è stata mantenuta o aumentata nella maggior parte degli individui CoV2 + dalla Visita 1 alla Visita 2 (Fig. 1f, ED Fig. 4g). La neutralizzazione mediante PRNT era fortemente correlata con l’inibizione del RBD in entrambi i punti temporali (Fig. 1g, ED 4h) ed era similmente mantenuta tra le visite (Fig. 1h).

All’ultimo punto temporale del nostro studio, l’86% degli individui CoV2 + aveva ancora un plasma inibitore del RBD migliore rispetto agli HC e il 71% aveva un plasma neutralizzante migliore (misurato come sopra la media HC + 3 DS). Questi dati sono coerenti con l’emergere di LLPC prevalentemente IgG + RBD e spike-specifici che mantengono rilevabile l’anticorpo neutralizzante anti-SARS-CoV-2 per almeno 3 mesi dopo l’insorgenza dei sintomi.

Il COVID-19 lieve induce un arricchimento prolungato delle cellule B della memoria specifiche per RBD.

La presenza di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 tre mesi dopo l’insorgenza dei sintomi in individui con CoV2 + suggerisce che si siano formati LLPC di memoria derivati ​​da GC. Gli MBC derivati ​​da GC svolgono un ruolo critico nella formazione di cellule che secernono anticorpi dopo la riesposizione dell’antigene.

Pertanto, abbiamo testato se gli MBC specifici per SARS-CoV-2 si fossero formati e mantenuti anche in individui CoV2 + durante il corso del tempo di studio.

Abbiamo generato reagenti tetramero RBD e utilizzato strategie di arricchimento per identificare cellule rare RBD-specifiche che sarebbero altrimenti non rilevabili nelle valutazioni di massa17.

Abbiamo confermato la specificità nei topi immunizzati con RBD e quindi abbiamo utilizzato il tetramero RBD per identificare, enumerare e fenotipizzare le cellule B RBD-specifiche rare nei nostri individui HN, HC e CoV2 + (ED Fig. 5a,, b; b; Fig. 2a ). I gate utilizzati per fenotipizzare le cellule B RBD-specifiche sono stati definiti sulle popolazioni di cellule B totali (ED Fig. 5c). Alla Visita 1, le cellule B RBD-specifiche erano significativamente espanse negli individui CoV2 + rispetto agli HC e il loro numero era aumentato ulteriormente alla Visita 2 (Fig. 2a,, b) .b).

La proporzione e il numero di MBC specifici per RBD (definiti dall’espressione di CD21 e CD27) nei campioni di CoV2 + erano significativamente maggiori rispetto agli HC e aumentavano dalla Visita 1 alla Visita 2 (Fig. 2c,, d, d, ED Fig. 5d) . Mentre le cellule B specifiche per RBD nei campioni HN avevano una proporzione di MBC simile a quella dei campioni CoV2 +, contenevano sostanzialmente meno cellule.

Inoltre, gli MBC specifici per RBD erano in gran parte quiescenti con pochissimi Ki67 che esprimevano (Fig. 2e, ED Fig. 5e). L’espressione di MBC dei recettori delle cellule B a commutazione di classe (BCR) è un altro marcatore di derivazione GC. Abbiamo quindi analizzato l’espressione dell’isotipo BCR su MBC specifici per RBD e abbiamo trovato popolazioni arricchite di MBC che esprimono IgA e IgG in individui CoV2 + in entrambi i punti temporali (Fig. 2f-h, ED Fig. 5f).

Da notare che mentre nei controlli è stato rilevato un piccolo numero di MBC specifici per RBD, queste cellule erano prevalentemente non commutate (IgM + e IgD +), suggerendo che potrebbero rappresentare MBC cross-reattivi eventualmente generati in risposta a uno dei coronavirus umani che causano il 15% dei raffreddori comuni18-20.

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Figura 2:
MBC specifici per RBD si formano e persistono nelle PBMC dopo COVID-19 lieve.
a) Gating rappresentativo di cellule Live CD3 − CD14 − CD16− per cellule SARS-CoV-2 RBD-specifiche (RBD tetramer + Decoy−) eb) numero di cellule B RBD-specifiche (RBD tetramer + Decoy-CD20 +) da SARS -PBMC recuperate da CoV-2 (CoV2 +) e di controllo sano (HC) alla Visita 1 (V1) e alla Visita 2 (V2). Strategia di gate mostrata nella Figura 5c dei dati estesi. c) Gating rappresentativo ed) Numero di cellule B di memoria specifiche per RBD (MBC: popolazioni CD21 + CD27 + / CD21 − CD27 + / CD21 − CD27− delineate in rosso in c) (HN n = 14, V1 HC n = 12, V2 HC n = 13, V1 CoV2 + n = 15, V2 CoV2 + n = 14). e) Frequenza dei cicli (Ki67 +) MBC specifici per RBD. f) Gating rappresentativo, g) frequenza (HN n = 14, V1 HC n = 12, V2 HC n = 13, V1 CoV2 + n = 15, V2 CoV2 + n = 14) eh) numero di MBC specifici per RBD che esprimono il BCR isotipi IgD, IgM, IgA e IgG. i) Gating rappresentativo, j) frequenza ek) numero di MBC specifici per RBD che esprimono T-bet. Significatività statistica determinata dal test di Mann-Whitney a due code (HC vs CoV2 +) e dal test dei ranghi con segno di Wilcoxon a due code (V1 vs V2). Le barre di errore rappresentano la media e la DS (HN n = 14, V1 HC n = 15, V2 HC n = 15, V1 CoV2 + n = 15, V2 CoV2 + n = 14 se non diversamente specificato, 2 esperimenti).

Un’ulteriore misura della funzione antivirale MBC è l’espressione graduata di T-bet14. Gli MBC che esprimono bassi livelli di T-bet sono associati a una rapida differenziazione in PB secondari che producono anticorpi virali specifici ad alta affinità durante un’infezione secondaria21.

Abbiamo trovato una percentuale e un numero più elevati di T-bet +, e in particolare T-betlo, MBC specifici per RBD in individui con CoV2 + rispetto agli HC alla Visita 1 e i numeri più alti sono stati mantenuti alla Visita 2 (Fig. 2i – k, ED Fig. 5g,, h) .h). Gli MBC T-bethi sono considerati attivati ​​di recente e spesso si trovano arricchiti durante l’infezione cronica21. Coerentemente con il fatto che SARS-CoV-2 sia un’infezione acuta11, abbiamo trovato pochissimi MBC T-bethi specifici per RBD in individui CoV2 + in entrambi i momenti della memoria (ED Fig. 5i).

I nostri dati dimostrano che l’infezione da SARS-CoV-2 induce la generazione di MBC TbetloIgG + CD21 + CD27 + specifici per RBD probabilmente derivati ​​da un GC22. Inoltre, il numero di questi MBC non solo è stato mantenuto, ma è aumentato da uno a tre mesi dopo l’insorgenza dei sintomi.

L’infezione da SARS-CoV-2 induce cellule T CD4 + reattive ai picchi durevoli e funzionali

La presenza di MBC specifici per T-bet + RBD ha suggerito che anche le risposte delle cellule T della memoria antigene-specifiche potevano essere suscitate negli individui CoV2 +.

Per enumerare le cellule T di memoria specifiche per SARS-CoV-2, le PBMC totali da individui di controllo o CoV2 + sono state incubate con proteina spike ed è stata valutata l’espressione dei marker di attivazione (Fig. 3a) 23,24.

Le PBMC di individui CoV2 + alle visite 1 e 2 hanno mostrato una robusta riattivazione delle risposte T della memoria CD4 + specifiche per i picchi, misurate dall’aumentata espressione di ICOS e CD40L (due molecole associate ai linfociti B aiutano alla riattivazione), mentre le PBMC da HC e gli individui HN no (Fig. 3a,, b) .b).

Non ci sono state differenze significative nel numero di cellule rispondenti negli individui CoV2 + tra le due visite, suggerendo che le cellule T CD4 + di memoria specifiche per i picchi sono state mantenute durante lo studio (Fig. 3b).

Inoltre, un numero maggiore di cellule T helper follicolari circolanti (cTfh) che esprimono CXCR525, che forniscono aiuto ai linfociti B, sono stati trovati nella popolazione di cellule S-specifiche ICOS + CD40L + CD4 + in individui CoV2 + rispetto ai controlli sani in entrambe le visite (Fig. . 3c). Insieme, questi dati suggeriscono che le cellule T CD4 + di memoria specifiche per SARS-CoV-2 mantengono la capacità di fornire aiuto alle cellule B anche a tre mesi dall’insorgenza dei sintomi.

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Figura 3: La
riattivazione ex vivo di cellule T CD4 + specifiche per i picchi rivela una memoria immunitaria durevole e funzionale in individui recuperati da SARS-CoV-2.
a) Grafici rappresentativi della citometria a flusso 20 ore dopo il controllo del veicolo o la stimolazione Spike di PBMC da individui HC e CoV2 + che dimostrano la sovraregolazione delle cellule T di CD40L e ICOS su cellule T CD45RA − CD4 +. b) Conteggio del totale CD40L + ICOS + ec) CXCR5 + CD40L + ICOS + (cTfh) per 1e6 CD4 + T Cells e dati CoV2 + accoppiati dalla Visita 1 e Visita 2 rappresentati come frequenza del picco meno veicolo. d) Diagrammi di citometria a flusso rappresentativi ed e) numero di cellule T CD69 + ICOS + CD4 + che producono citochine intracellulari e citochine che producono numero dopo l’incubazione con numero di picco meno dopo l’incubazione con il veicolo. f) Distribuzione relativa della produzione di citochine effettrici nei compartimenti delle cellule T della memoria (CCR6 +/− cTfh e non-cTfh) dopo stimolazione ex vivo per 20 ore; (IFN-y; blu) (IL-2; rosso) (IL-17A; giallo) da (d). g) Proliferazione di cellule T antigene-specifiche di cellule T CD4 + naive o di memoria ordinate in PBMC di controllo e CoV2 +. Proliferazione dopo 5-6 giorni di co-coltura con monociti autologhi pulsati con proteine ​​SARS-CoV-2. h) Espansione antigene-specifica rappresentata come frequenza del picco meno veicolo, cellule che rispondono a CXCR3 + CPDlow. i) Grafici rappresentativi della citometria a flusso ej) quantificazione di cellule T CD8 + specifiche per spike nel controllo e PBMC Cov2 + stimolate con proteina spike SARS-CoV-2. ah) La significatività è stata determinata dal test di Kruskal-Wallis correggendo per confronti multipli utilizzando il metodo a due fasi FDR. Vengono riportati i valori p aggiustati. ij) La significatività è stata determinata mediante test di Mann-Whitney non parametrici a due code. aj) Dati rappresentati come media e SD; Ogni simbolo rappresenta un donatore. af, ij) n = 7 HN, n = 14 HC, n = 14 CoV2 + (2 esperimenti). gh) n = 3 V1 HC,

Le cellule T CD4 + della memoria producono citochine entro poche ore dall’attivazione, mentre le cellule T naive impiegano giorni26.

Abbiamo prima esaminato la produzione di citochine da cellule CXCR5-non-Tfh di memoria CD4 + attivate e cellule CXCR5 + cTfh identificate nel test sopra (Fig. 3b).

Cellule CCR6 + CXCR5 + cTfh S-specifiche, associate alla produzione di IL-17, e una popolazione più piccola di cellule CXCR3 + CXCR5 + cTfh, associate alla produzione di IFNγ, sono state recentemente descritte in una coorte prevalentemente da lieve a moderata 30 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi 27.

Abbiamo quindi analizzato cellule specifiche ICOS + CD69 + S attivate per l’espressione di CCR6 e CXCR5 e quindi l’espressione delle citochine è stata esaminata in ciascuna popolazione sulla base del gating su un controllo positivo PMA (Fig 3d, EF 6a).

Sebbene siano state valutate più citochine associate alla funzione Tfh, solo le cellule produttrici di citochine IFNγ, IL-17 e IL-2 sono state espresse in modo significativo nelle cellule CD4 + di memoria S-specifiche attivate in individui CoV2 + rispetto agli HC (Fig. 3d-f).

Un piccolo numero di cellule S-specifiche è stato misurato negli HC dopo la stimolazione rispetto al solo veicolo che riflette la reattività crociata S-specifica precedentemente descritta20,28, ma risposte molto maggiori sono state osservate negli individui CoV2 + (Fig. 3e).

Tre mesi dopo l’insorgenza dei sintomi abbiamo riscontrato una maggiore frequenza di cellule CCR6− cTfh che producevano citochine Th1, IFNγ e IL-2, suggerendo una risposta Th1 dominante negli individui CoV2 + (Fig. 3f).

Per definire ulteriormente i tipi di cellule T di memoria CD4 + antigene-specifiche in individui CoV2 + senza fare affidamento sulla secrezione di citochine specifiche, abbiamo valutato la proliferazione delle cellule T CD4 + di memoria in risposta alla restimolazione dei picchi.

Per questo, abbiamo ordinato le cellule T CD45RA + naive, CD45RA − CCR7 + memoria centrale (Tcm) e CD45RA − CCR7− memoria effettrice (Tem) da individui HC o CoV2 + (ED Fig. 6b), quindi misurato la capacità proliferativa di ciascuna popolazione ordinata seguente coltura con monociti CD14 + autologhi e proteina spike ricombinante (Fig. 3g,, h; h; ED Fig 6c).

Solo le cellule Tcm da individui CoV2 + prelevati sia alla Visita 1 che alla Visita 2 hanno mostrato frequenze di proliferazione significative rispetto ai campioni di HC, sebbene in alcuni individui CoV2 + siano state osservate risposte proliferative sostanziali da parte delle cellule Tem (Fig. 3h).

Abbiamo anche esaminato l’espressione di CXCR3 e CCR6 su cellule di memoria proliferate S-specifiche e abbiamo scoperto che la maggior parte delle cellule che avevano proliferato, misurata dalla diluizione del colorante di proliferazione cellulare (CPDlo), esprimeva CXCR3, in linea con la produzione di citochine di tipo 1 nell’analisi precedente. La Tcm specifica per i picchi e, potenzialmente, la Tem, sono quindi mantenute per tutto il nostro studio e hanno la capacità di proliferare e ripopolare il pool di memoria al reincontro con l’antigene.

Mentre molti lavori recenti si sono concentrati sugli anticorpi e sulle cellule B, le cellule T CD8 + della memoria sono posizionate in modo univoco per uccidere le cellule infettate da virus attraverso la loro espressione diretta di citochine e molecole citolitiche. 

Le cellule T CD8 + di memoria S-specifiche che persistevano per tre mesi dopo una lieve malattia COVID-19 potevano essere identificate mediante l’espressione del marker di attivazione CD69 e della citochina IFNγ dopo stimolazione notturna con picco (Fig 3i). 

A differenza delle cellule T di memoria CD4 +, le cellule T CD8 + che esprimono citochine attivate erano significativamente aumentate rispetto ai controlli del veicolo in entrambi i gruppi di controllo e CoV2 + (Fig. 3j).

Insieme, questi dati dimostrano che sia i linfociti T della memoria specifici per CD4 + che CD8 + SARS-CoV-2 vengono mantenuti e sono in grado di produrre citochine effettrici dopo la restimolazione tre mesi dopo l’insorgenza dei sintomi in individui COVID-19 lievemente sintomatici.

Gli MBC specifici per SARS-CoV-2 indotti da COVID-19 moderati possono esprimere anticorpi neutralizzanti

Poiché gli MBC specifici per SARS-CoV-2 RBD e CD4 + cTfh specifici per S sono stati arricchiti in individui con CoV2 + dopo 3 mesi, abbiamo valutato se questi MBC potevano produrre anticorpi neutralizzanti se fossero riattivati ​​da un’infezione secondaria. A tal fine, abbiamo indicizzato singole cellule B specifiche per RBD e sequenziato le BCR da 3 individui CoV2 + alla Visita 1 (ED Fig. 7a).

Degli MBC classici specifici per RBD a commutazione di classe (IgG +) (CD21 + CD27 +) che abbiamo selezionato, ne abbiamo selezionati 7 casualmente da clonare ed espressi come anticorpi monoclonali IgG1 (Fig. Questo set di anticorpi utilizzava un’ampia varietà di catene pesanti e leggere, aveva tutti subito ipermutazione somatica ed erano tutti cloni unici (Fig. 4b, ED Tabella 2).

Questi anticorpi sono stati espressi per la prima volta in colture su piccola scala. I supernatanti di trasfezione sono stati valutati per l’espressione dell’anticorpo mediante IgG ELISA (ED Fig 7b) e la specificità mediante RBD ELISA dove tutti e 7 hanno mostrato un forte legame con RBD (Fig. 4c). I primi 4 anticorpi clonati sono stati espressi su scala più ampia e purificati.

La specificità di questi anticorpi purificati per RBD è stata nuovamente confermata da ELISA (ED Fig. 7c) e la loro capacità di prevenire l’infezione da SARS-CoV-2 è stata testata tramite test PRNT. Due dei quattro testati (# 202 e 203) hanno mostrato una forte neutralizzazione del virus (Fig. 4d), con valori IC50 di 31 ng / ml per entrambi (Fig. 4e). Questo era paragonabile a un anticorpo di topo fortemente neutralizzante (B04) pubblicato in precedenza che era incluso come controllo positivo (IC50 = 7ng / ml) 29.

Due degli anticorpi specifici per RBD non erano in grado di inibire l’infezione virale, simile a un anticorpo murino non neutralizzante (C02) e un anticorpo umano irrilevante specifico per Plasmodium. Altri tre anticorpi monoclonali oltre ai 4 sopra sono stati valutati per la loro capacità di inibire il legame del RBD al recettore ACE2 mediante sVNT assay (Fig. 4f).

Tre dei sette sono stati in grado di inibire il legame del RBD con ACE2, in modo simile a un nanobody di alpaca fortemente neutralizzante30. È interessante notare che il # 203, che ha neutralizzato il virus vivo, non ha inibito il legame in questo saggio, mentre il # 202 ha inibito il legame e neutralizzato il virus.

Complessivamente il 50% degli anticorpi testati ha mostrato attività inibitoria con uno o entrambi questi metodi. Pertanto, gli MBC specifici per RBD indotti dall’infezione da SARS-CoV-2 sono in grado di produrre anticorpi neutralizzanti contro il virus e potrebbero quindi contribuire alla protezione da una seconda esposizione a SARS-CoV-2.

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Figura 4.
Generazione di anticorpi neutralizzanti da MBC specifici per RBD.
a) Diagrammi di flusso di cellule B specifiche del tetramero RBD ordinate per indice (schema di gating nella Figura 7a dei dati estesi). Recettori delle cellule B (BCR) clonati dalle cellule mostrate in rosso. b) Uso di geni per catene pesanti e leggere, tasso di ipermutazione somatica e sequenza di giunzione VDJ di BCR clonati. c) ELISA anti-RBD di surnatanti di colture da cellule trasfettate per esprimere uno degli anticorpi monoclonali rispetto a un anticorpo noto che lega e neutralizza l’RBD (Ty1) e supernatante da cellule non trasfettate (nessuna trasfezione). d) Capacità di neutralizzazione degli anticorpi monoclonali purificati misurata mediante PRNT. BO4 e CO2 sono anticorpi murini neutralizzanti forti e deboli identificati in precedenza. e) Valori IC50 di anticorpi calcolati da PRNT. La linea tratteggiata rappresenta il limite di rilevamento.

Discussione
In assenza di un vaccino, l’immunità di gregge indotta da infezioni naturali potrebbe svolgere un ruolo chiave nella riduzione delle infezioni e dei decessi. Affinché ciò sia possibile, le persone che soffrono di COVID-19 lieve dovrebbero sviluppare e sostenere la memoria immunitaria protettiva.

Qui, abbiamo scoperto che gli individui che si sono ripresi da COVID-19 lievemente sintomatico avevano un arsenale espanso di mediatori immunitari specifici per SARS-CoV-2: anticorpi neutralizzanti, IgG + T-betlo classici MBC, cellule CXCR5 + Tfh1 che producono citochine circolanti, CXCR3 + proliferanti Cellule di memoria CD4 + e cellule T CD8 + che producono IFNγ che sono state mantenute per almeno tre mesi dopo l’insorgenza dei sintomi.

Questo studio prevede che questi individui guariti saranno protetti da una seconda infezione da SARS-CoV-2 e, in tal caso, suggerisce che la memoria Th1 dovrebbe essere l’obiettivo della memoria suscitata dal vaccino.

Sebbene la memoria immunitaria di lunga durata possa formare la maggior parte dei virus, alcuni studi che esaminano la longevità della risposta ai coronavirus hanno suggerito che questo non è il caso31-33. Tuttavia, studi più recenti, compreso il nostro, hanno esaminato i punti temporali della memoria in cui solo gli LLPC, e non i PB di breve durata, producono anticorpi circolanti.

Il nostro studio, insieme ad altri tre, dimostra chiaramente che elevati anticorpi plasmatici IgG + RBD specifici e plasma neutralizzante vengono generati e mantenuti per almeno 3 mesi dopo l’infezione da SARS-CoV-234-36.

Sebbene gli anticorpi rivelino i contributi degli LLPC, anche i linfociti B e T di memoria funzionali specifici del virus possono essere fondamentali per la memoria immunitaria protettiva37. Sebbene studi precedenti abbiano misurato l’emergenza di MBC specifici per SARS-CoV-2 entro un mese dall’infezione 27,38, abbiamo caratterizzato MBC specifici per SARS-CoV-2 a uno e tre mesi dall’esordio dei sintomi.

Il nostro studio ha rivelato una popolazione prominente di MBC IgG + CD27 + CD21 + T-betlo specifici per RBD, che è stata associata in altre infezioni con una rapida differenziazione in PB secernenti anticorpi alla riesposizione5, risposte antivirali efficaci39 e protezione di lunga durata3.

Inoltre, abbiamo trovato che alcuni degli MBC specifici per RBD alla Visita 1 esprimevano BCR in grado di neutralizzare il virus quando espresso come anticorpi. Poiché il numero di questi MBC specifici per IgG + RBD non solo è stato sostenuto, ma ha continuato ad aumentare tra uno e tre mesi, prevediamo che siano derivati ​​da GC.

Pertanto, gli MBC a tre mesi avrebbero subito una maggiore maturazione dell’affinità e ci aspetteremmo che una percentuale ancora più alta sarà in grado di produrre anticorpi specifici per RBD neutralizzanti dopo la reinfezione.

La riattivazione dell’MBC richiede interazioni con le cellule T CD4 + della memoria, che riattivano gli MBC attraverso la loro espressione di molecole chiave associate alle interazioni TB tra cui CXCR5, ICOS, CD40 e una varietà di citochine. Le cellule T di memoria CD4 + specifiche per SARS-CoV-2 negli individui recuperati hanno mostrato la capacità di esprimere tutte queste molecole e di subire una proliferazione robusta dopo la riesposizione alla proteina spike. 

In particolare, le cellule T di memoria CD4 + S-specifiche di individui CoV2 + hanno mostrato rapidamente un aumento dei livelli di ICOS e CD40L sulle cellule CXCR5 + e CXCR5- dopo la stimolazione e l’espressione delle citochine associate a Th1 e Th17.

Questi risultati sono coerenti con un altro rapporto recente di cellule cTfh specifiche per SARS-CoV-2-27, sebbene abbiano rilevato un’alta frequenza di cellule cTfh simili a Th17, che potrebbe essere dovuta al punto temporale precedente che stavano esaminando poiché le cellule Th17 possono svilupparsi in Cellule Th1 in ritardo in una risposta immunitaria40.

L’espressione di IFNγ e IL-17 da parte di queste cellule è notevole poiché queste citochine sono associate al passaggio di classe agli isotipi IgG e IgA, rispettivamente 41,42. Abbiamo anche trovato cellule B e T della memoria cross-reattiva in controlli sani, come è stato precedentemente notato43.

È difficile misurare il loro contributo alle popolazioni espanse di cellule specifiche per SARS-CoV-2 che abbiamo trovato nelle nostre coorti CoV2 +, e quindi impossibile valutare la loro capacità protettiva. Tuttavia, possiamo concludere che il COVID-19 lieve induce una popolazione espansa di linfociti della memoria funzionalmente diversi rispetto al pool cross-reattivo presente nei nostri controlli.

Gli studi sulla reinfezione devono ancora essere condotti negli esseri umani, ma i macachi infettati da SARS-CoV-2 sono stati protetti dal rechallenge44. Ciò suggerisce inoltre che la memoria immunitaria indotta da COVID-19 lieve che abbiamo osservato sarà protettiva. 

Sebbene siano necessari ulteriori studi per comprendere la variabilità delle risposte in una coorte più ampia e per determinare per quanto tempo viene effettivamente mantenuta la memoria all’infezione da SARS-CoV-2, il nostro lavoro suggerisce che il COVID-19 lieve induce una memoria immunitaria persistente pronta per una risposta coordinata e protettiva alla riesposizione che potrebbe contribuire all’immunità della mandria e limitare questa pandemia.

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LINK DI RIFERIMENTO: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7430600/


Ulteriori informazioni:  Isabel Schulien et al, Caratterizzazione di cellule T CD8 + specifiche per SARS-CoV-2 preesistenti e indotte,  Nature Medicine  (2020). DOI: 10.1038 / s41591-020-01143-2

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