I risultati di un nuovo studio sulla malattia di Alzheimer (AD ), condotto da ricercatori dell’Università del Saskatchewan (USask), potrebbero alla fine aiutare i medici a identificare le persone a più alto rischio di sviluppare il disturbo cerebrale progressivo e irreversibile e aprire la strada a trattamenti che rallentano o prevenirne l’insorgenza.
La ricerca, pubblicata sulla rivista Scientific Reports all’inizio di gennaio, ha dimostrato che una forma più breve del peptide proteico ritenuto responsabile di causare l’AD (beta-amiloide 42 o Aβ42) arresta il meccanismo che causa danni della sua controparte più lunga.
“Mentre Aβ42 interrompe il meccanismo utilizzato dalle cellule cerebrali per apprendere e formare ricordi, Aβ38 inibisce completamente questo effetto, essenzialmente salvando le cellule cerebrali”, ha detto il neurochimico molecolare Darrell Mousseau, professore del Dipartimento di Psichiatria di USask e capo del Cell Signaling Laboratory .
Studi precedenti hanno suggerito che l’Aβ38 potrebbe non essere così dannoso come la forma più lunga, ha detto Mousseau, ma la loro ricerca è la prima a dimostrare che è effettivamente protettivo.
“Se possiamo eliminare specificamente l’Aβ42 e mantenere solo l’Aβ38, forse questo aiuterà le persone a vivere più a lungo o farà sì che la malattia inizi più tardi, che è ciò che tutti vogliamo”.
Aβ42 è tossico per le cellule, interrompe la comunicazione tra le cellule e nel tempo si accumula per formare depositi chiamati placche. Si ritiene che questa combinazione di fattori sia responsabile della causa dell’AD. Gli esperti hanno a lungo pensato che tutte le forme di peptidi Aβ causino l’AD, nonostante il fatto che gli studi clinici abbiano dimostrato che la rimozione di questi peptidi dal cervello dei pazienti non previene o cura la malattia.
Mousseau ha detto che l’idea alla base dello studio era abbastanza semplice: se due amminoacidi in più sono dannosi, che ne dici di due in meno?
“Abbiamo solo pensato: confrontiamo questi tre peptidi, il 40 amminoacido che la maggior parte delle persone ha, il 42 amminoacido che pensiamo sia coinvolto nell’Alzheimer e questo 38, la versione leggermente più breve”, ha detto Mousseau, che è Saskatchewan Cattedra di ricerca in malattia di Alzheimer e demenze correlate, una posizione co-finanziata dalla Saskatchewan Health Research Foundation e dall’Alzheimer Society of Saskatchewan.
Il progetto ha confermato gli effetti protettivi della proteina più corta in una varietà di analisi differenti:
- nelle versioni sintetiche della proteina in provette;
- nelle cellule umane;
- in un modello di worm ampiamente utilizzato per lo studio dell’invecchiamento e della neurodegenerazione;
- nelle preparazioni tissutali utilizzate per studiare le proprietà della membrana e la memoria;
- e in campioni di cervello da autopsie.
Nei campioni di cervello, hanno anche scoperto che gli uomini con AD che avevano più Aβ42 e meno Aβ38 morivano in precocemente.
Il fatto che non abbiano visto lo stesso schema nei campioni di donne suggerisce che il peptide proteico si comporta in modo diverso negli uomini e nelle donne.
Il team di USask comprendeva anche Maa Quartey e Jennifer Nyarko del Cell Signaling Lab (Dipartimento di Psichiatria), Jason Maley del Saskatchewan Structural Sciences Center, Carlos Carvalho del Dipartimento di Biologia e Scot Leary del Dipartimento di Biochimica, Microbiologia e Immunologia .
Anche Joseph Buttigieg dell’Università di Regina e Matt Parsons della Memorial University di Terranova facevano parte del gruppo di ricerca.
Anche se Mousseau non è stato sorpreso di vedere che la forma più corta previene i danni causati dalla versione più lunga, ha detto di essere rimasto un po ‘sorpreso dall’effetto significativo che ha avuto.
La malattia di Alzheimer (AD), la forma più comune di demenza, è una devastante malattia neurodegenerativa che colpisce forse 30 milioni di persone in tutto il mondo, con proiezioni demografiche che suggeriscono che questo aumenterà notevolmente nei prossimi decenni [1].
La neurodegenerazione cerebrale avviene tipicamente prima nell’ippocampo, una regione sotto la neocorteccia che è fondamentale per consolidare i ricordi a lungo termine. La perdita neuronale si diffonde ad altre aree corticali, portando a un progressivo declino cognitivo.
Negli stadi finali della malattia, i pazienti perdono la funzione cognitiva al punto da richiedere cure costanti, spesso istituzionalizzate. Sebbene una serie di fattori di rischio siano stati associati all’AD, l’insorgenza della malattia si correla meglio con l’età e la grande maggioranza dei casi si verifica negli anziani. Tra le persone di età superiore a 85 anni, più di un terzo è affetto.
Due tipi di depositi di proteine si trovano nel cervello dell’AD: placche amiloidi e grovigli neurofibrillari [2]. I primi sono extraneuronali e composti principalmente dal β-peptide amiloide da 4 kDa (Aβ), mentre i secondi sono filamenti intraneuronali della proteina tau normalmente associata ai microtubuli. La neuroinfiammazione è una terza caratteristica patologica dell’AD, in cui la microglia – cellule immunitarie del cervello fagocitico che rilasciano citochine – diventa iperattivata [3].
Il ruolo di ciascuna di queste caratteristiche nell’eziologia e nella patogenesi dell’AD non è ben compreso. Tuttavia, l’aggregazione di Aβ, sotto forma di oligomeri, protofibrille, fibrille e placche, è generalmente osservata come la prima patologia, seguita dalla formazione di grovigli tau e dalla neurodegenerazione [4].
Per questo motivo e per quelli menzionati nella sezione successiva, l’Aβ patologico è ampiamente considerato l’iniziatore dell’AD, innescando la patologia tau a valle e la neuroinfiammazione, e l’Aβ è stato l’obiettivo primario per lo sviluppo di terapie per l’AD da oltre 25 anni [5].
AD familiare e genetica
Come accennato in precedenza, l ‘”ipotesi amiloide” della patogenesi dell’AD ha regnato per decenni e lo sviluppo di farmaci per l’AD si è concentrato principalmente sull’inibizione della produzione di Aβ, sul blocco dell’aggregazione di Aβ o sulla facilitazione della clearance dell’Aβ dal cervello [6]. La base principale di questo dogma è la scoperta negli anni ’90 di mutazioni genetiche dominanti associate ad AD ad esordio precoce [7,8,9,10].
Questa AD familiare (FAD) ha un esordio della malattia prima dei 60 anni e può manifestarsi anche prima dei 30 anni. A parte la causa monogenetica e l’inizio della mezza età, la FAD è strettamente simile alla AD sporadica della vecchiaia per quanto riguarda la patologia, la presentazione, e progressione. La spiegazione più parsimoniosa è che eventi molecolari e cellulari simili sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione di entrambe le forme della malattia.
Le prime mutazioni genetiche associate alla FAD erano nella proteina precursore dell’amiloide (APP) [7]. Questo gene codifica per una proteina di membrana a passaggio singolo che viene inizialmente scissa dalla β-secretasi, una proteasi aspartilica legata alla membrana appartenente alla famiglia delle pepsine, per rilasciare il grande ectodominio APP [11] (Figura 1).
Il frammento C-terminale residuo (APP CTF-β ) viene quindi proteolizzato all’interno del suo dominio transmembrana (TMD) dalla γ-secretasi per produrre Aβ, che viene poi secreto dalla cellula [12]. La maggior parte di Aβ ha una lunghezza di 40 residui (Aβ40), ma una piccola porzione è la forma di 42 residui molto più incline all’aggregazione (Aβ42). Sebbene Aβ42 sia una variante minore di Aβ prodotta attraverso l’elaborazione APP CTF-β da parte della γ-secretasi, è la forma principale depositata nelle placche cerebrali caratteristiche dell’AD [13].
Elaborazione della proteina precursore dell’amiloide (APP) mediante β- e γ-secretasi. La proteina di membrana a passaggio singolo APP è proteolizzata appena fuori dal dominio transmembrana (TMD) dalla β-secretasi. Il rimanente frammento C-terminale legato alla membrana (APP CTF-β) viene quindi scisso all’interno del TMD per produrre il β-peptide amiloide (Aβ) e il dominio intracellulare APP (AICD).
Le 27 mutazioni note di APP associate alla FAD [14], ciascuna delle quali devastante famiglie diverse, sono tutte mutazioni missenso all’interno e intorno alla piccola regione Aβ della grande APP. Queste mutazioni alterano la produzione di Aβ o aumentano la tendenza all’aggregazione del peptide [15].
Una doppia mutazione appena al di fuori dell’N-terminale della regione Aβ in APP aumenta la proteolisi da β-secretasi, portando a APP CTF-β elevati e quindi Aβ complessivamente elevati. Le mutazioni nella TMD vicino ai siti di scissione della γ-secretasi elevano Aβ42 / Aβ40 e le mutazioni all’interno della regione Aβ stessa rendono il peptide più incline all’aggregazione.
Sono state poi scoperte mutazioni FAD in presenilina-1 (PSEN1) [8] e presenilina-2 (PSEN2) [9], geni che codificano proteine di membrana multi-passaggio che all’epoca non avevano alcuna funzione nota. Queste mutazioni missenso – ora se ne conoscono più di 200 [14], tutte tranne una dozzina circa in PSEN1 – si trovano in tutta la sequenza della proteina, ma principalmente all’interno delle sue nove TMD [16,17].
Si è presto scoperto che le mutazioni FAD della presenilina aumentano l’Aβ42 / Aβ40 [18,19,20], rafforzando ulteriormente l’idea che questo rapporto sia critico per la patogenesi. Inoltre, questi risultati hanno indicato che le preseniline possono modulare la scissione della γ-secretasi del substrato APP, poiché le mutazioni FAD hanno alterato la preferenza per i siti di scissione da parte della proteasi. Subito dopo è arrivata l’osservazione che il knockout di PSEN1 ha ridotto drasticamente la produzione di Aβ a livello di γ-secretasi [21], con la restante produzione di Aβ attribuita a PSEN2 (successivamente verificata [22,23]). Pertanto, le preseniline sono necessarie per l’elaborazione della γ-secretasi dei peptidi da APP CTF-β ad Aβ.
Presenilina e Complesso γ-secretasi
Nel frattempo, la progettazione di inibitori peptidomimetici basati su substrato ha suggerito che la γ-secretasi è un’aspartil proteasi [24,25,26]. Gli analoghi del peptide, basati sul sito di scissione della γ-secretasi nell’APP TMD che porta alla produzione di Aβ e contenenti parti di difluorochetone o difluoroalcol, mimetici dello stato di transizione della catalisi dell’aspartil proteasi, erano inibitori efficaci dell’attività della γ-secretasi nei saggi cellulari.
Dato il requisito della presenilina per l’attività della γ-secretasi, il sito di proteolisi dell’APP all’interno del suo TMD, la natura multi-TMD della presenilina e l’evidenza che la γ-secretasi è un’aspartil proteasi, è stata sollevata la possibilità che la presenilina possa essere una nuova proteasi incorporata nella membrana.
In effetti, due aspartati TMD conservati sono stati trovati nelle preseniline, ed entrambi gli aspartati erano necessari per l’attività della γ-secretasi [27]. Rapporti successivi che i reagenti di marcatura per affinità basati sugli inibitori analoghi dello stato di transizione della γ-secretasi legati direttamente alla presenilina hanno cementato l’idea che la presenilina è un’aspartil proteasi senza precedenti con il suo sito attivo situato all’interno del doppio strato lipidico [28,29].
Sebbene le preseniline sembrassero essere aspartil proteasi insolite, era chiaro che non avevano questa attività da sole. Le preseniline stesse subiscono proteolisi all’interno del grande anello tra TMD6 e TMD7 per formare un frammento N-terminale (NTF) e un frammento C-terminale (CTF) [30] (Figura 2). La formazione di PSEN NTF e CTF è controllata limitando i fattori cellulari [31] e queste due subunità della presenilina si assemblano in un complesso più grande [32,33].
L’analisi biochimica e lo screening genetico alla fine hanno identificato altri tre componenti di quello che divenne noto come complesso γ-secretasi [34,35,36]. Questi tre componenti, proteine di membrana nicastrina, Aph-1 e Pen-2, si assemblano con presenilina, attivando una funzione autoproteolitica della presenilina per formare PSEN NTF e CTF. [I due aspartati TMD essenziali delle preseniline sono necessari anche per la formazione di PSEN NTF / CTF [27].]
Questo assemblaggio con presenilina scissa è la forma attiva della γ-secretasi. Infatti, i reagenti di marcatura dell’affinità analogica allo stato di transizione che marcano le preseniline specificamente legate a PSEN NTF e CTF [28,29], suggeriscono che il sito attivo della proteasi risiede all’interfaccia tra queste due subunità della presenilina. Questa idea è coerente con l’osservazione che uno degli aspartati essenziali è in TMD6 nel PSEN NTF e l’altro è in TMD7 nel PSEN CTF.
Presenilina e altri componenti del complesso γ-secretasi. La presenilina è una proteina 9-TMD che contiene due TMD aspartati (D) essenziali per la catalisi. L’assemblaggio della presenilina con gli altri tre componenti — nicastrina, Aph-1 e Pen-2 — innesca l’autoproteolisi della presenilina in un frammento N-terminale (NTF) e in un frammento C-terminale (CTF) per formare il complesso γ-secretasi attivo.
Subito dopo la scoperta della presenilina come componente catalitico della γ-secretasi, l’analisi dell’altro prodotto proteolitico della scissione della γ-secretasi dell’APP (AICD), ha rivelato che l’APP TMD era proteolizzato in due diversi siti [37,38,39, 40,41]. La scissione nel secondo sito (ε) rilascia prodotti AICD composti da residui 49–99 o 50–99 del substrato APP CTF-β con 99 residui per la γ-secretasi (Figura 3). Con i peptidi Aβ secreti compresi tra 38 e 43 residui (Aβ38-Aβ43), ciò ha lasciato da 5 a 11 residui di APP TMD non considerati. La successiva scoperta di Aβ45, Aβ46, Aβ48 e Aβ49, ma nessun peptide AICD esteso N-terminale, ha portato all’ipotesi che la proteolisi ε si verifichi per prima [42,43,44].
Proteolisi processiva del substrato APP da parte della γ-secretasi. L’endoproteolisi iniziale nel sito di scissione ε del substrato APP C99 si traduce in Aβ48 o Aβ49 e nei corrispondenti frammenti di dominio intracellulare APP AICD49-99 e AICD50-99. L’attività carbossipeptidasi della γ-secretasi taglia quindi i peptidi Aβ iniziali lungo due percorsi: Aβ49 → Aβ46 → Aβ43 → Aβ40 e Aβ48 → Aβ45 → Aβ42 → Aβ38.
Gli Aβ48 e Aβ49 generati (controparti di AICD49-99 e AICD50-99, rispettivamente) sono stati postulati per subire il trimming del tripeptide lungo due percorsi: Aβ49 → Aβ46 → Aβ43 → Aβ40 e Aβ48 → Aβ45 → Aβ42 → Aβ38 (quest’ultimo passaggio di clivaggio che genera un coprodotto tetrapeptidico). L’analisi spettrometrica di massa dei piccoli prodotti peptidici ha supportato questa nozione [45], così come la scoperta che l’Aβ49 sintetico viene principalmente trasformato in Aβ40 e l’Aβ48 viene principalmente ridotto in Aβ42 dalla γ-secretasi purificata [46]. L’analisi cinetica del trimming di Aβ48 e Aβ49 sintetici da parte di cinque diversi complessi γ-secretasi mutanti FAD ha rivelato che tutti e cinque erano drammaticamente carenti in questa attività di trimming della carbossipeptidasi [46].
La presenilina e il complesso γ-secretasi hanno molti più substrati oltre all’APP [47]. In effetti, sono stati identificati così tanti substrati che il complesso della γ-secretasi è stato chiamato il proteasoma della membrana [48], il che implica che una delle sue funzioni principali è quella di eliminare gli stub proteici di membrana che rimangono dopo il rilascio dell’ectodominio da parte delle sheddasi. Mentre la clearance della proteina di membrana può essere una funzione importante della γ-secretasi, la proteasi svolge anche un ruolo essenziale in alcune vie di segnalazione cellulare. Il più importante di questi è il segnale proveniente dalla famiglia di recettori Notch [49].
I recettori Notch sono proteine di membrana a passaggio singolo come APP e l’elaborazione proteolitica di Notch, innescata dall’interazione con ligandi affini sulle cellule vicine, porta al rilascio del suo dominio intracellulare Notch (NICD) (Figura 4). Il NICD si trasloca nel nucleo e interagisce con specifici fattori di trascrizione che controllano l’espressione dei geni coinvolti nel differenziamento cellulare.
Queste vie di segnalazione, in particolare dai recettori Notch1, sono essenziali per il corretto sviluppo in tutti gli animali multicellulari. Il knockout dei geni della presenilina nei topi è letale e porta a fenotipi che sono praticamente identici a quelli osservati al knockout del gene Notch1 [50,51], risultati che, come spiegato più avanti, hanno importanti implicazioni per il potenziale degli inibitori della γ-secretasi come Terapie AD.
Elaborazione e segnalazione del recettore Notch. L’interazione con un ligando affine su una cellula vicina innesca lo spargimento dell’ectodominio di Notch da parte della metalloproteasi ADAM-10 e quindi la scissione del frammento di troncamento extracellulare di Notch (NEXT) con il suo unico TMD da parte della γ-secretasi. Il rilascio del dominio intracellulare Notch (NICD) porta alla traslocazione nel nucleo, all’attivazione dei fattori trascrittori e all’espressione genica che controlla la differenziazione cellulare.
link di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7828430/
Ulteriori informazioni: Maa O. Quartey et al, Il peptide Aβ (1–38) è un regolatore negativo del peptide Aβ (1–42) implicato nella progressione della malattia di Alzheimer, Scientific Reports (2021). DOI: 10.1038 / s41598-020-80164-w
