Covid-19: il primo test per tutte le mutazioni umane conosciute utilizza un array di peptidi HCoV

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Gli scienziati del Center for Infection and Immunity (CII) della Columbia University Mailman School of Public Health e della SunYat-Sen University in Cina hanno stabilito le condizioni per lo sviluppo di test anticorpali altamente sensibili per l’infezione da tutti i coronavirus umani noti, comprese le nuove varianti di SARS-CoV-2.

Questi test dovrebbero anche consentire la differenziazione delle risposte immunitarie a causa dell’infezione e della vaccinazione. La ricerca è pubblicata su Communications Biology, una rivista Nature.

L’array HCoV-Peptide sviluppato dagli scienziati cii è costituito da 3 milioni di marcatori immunitari su un chip di vetro, che coprono proteine di tutti i coronavirus umani noti, incluso il SARS-CoV-2. In collaborazione con un team della Sun Yat-Sen University, i ricercatori cii hanno identificato 29 firme immunitarie specifiche per SARS-CoV-2.

Queste impronte genetiche (peptidi) forniscono il modello per i test che verranno utilizzati per la diagnostica e la sorveglianza.

Gli attuali test anticorpali per l’infezione da SARS-CoV-2 possono generare risultati falsi positivi a causa della reattività incrociata con coronavirus stagionali responsabili del raffreddore comune, nonché MERS-CoV e SARS-CoV-1.

Per sviluppare l’array HCoV-Peptide, i ricercatori hanno analizzato per la prima volta campioni di sangue prelevati da individui con infezioni asintomatiche, lievi o gravi della SARS-CoV-2 e controlli tra cui individui sani e quelli esposti a SARS-CoV-1 e coronavirus stagionali.

Un’analisi di tutti i peptidi ~170.000 correlati ai coronavirus umani noti ha prodotto 29 peptidi con la reattività più forte e specifica con SARS-CoV-2.

Successivamente, hanno convalidato il loro test utilizzando una seconda serie di campioni di sangue, compresi quelli provenienti da casi confermati di SARS-CoV-2, quelli con anticorpi contro altri coronavirus umani e individui sani.

Il nuovo test ha una specificità e una sensibilità del 98%.

Le firme immunitarie erano presenti da otto giorni dopo l’insorgenza dei sintomi del COVID-19 fino a sei-sette mesi dopo l’infezione.

“Questo lavoro consentirà a noi e ad altri di costruire esami del sangue economici e facili da usare in grado di fornire dati per l’esposizione e l’immunità”, afferma l’autore Nischay Mishra, Ph.D., assistente professore di epidemiologia alla Columbia Mailman School.

“Questo lavoro con i nostri colleghi di SunYat-Sen, guidati dal professor Jiahai Lu e con Nimble Therapeutics, sottolinea l’importanza per la salute pubblica della collaborazione globale e delle partnership con l’industria nell’affrontare le sfide della pandemia di COVID-19”, afferma l’autore senior e corrispondente W. Ian Lipkin, MD, direttore del CII.

In precedenza, i ricercatori hanno usato metodi simili per sviluppare test per Zika, mielite flaccidi acuta e infezioni trasmesse da zecche.


La sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) è un virus dell’RNA a singolo filamento nella famiglia Coronaviridae emerso alla fine del 2019 e che ha causato morbilità, mortalità e interruzione economica su scala globale con pochi precedenti.1

La famiglia Coronaviridae comprende quattro specie/ceppi endemici nella popolazione umana – HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1 e HCoV-OC43 (specie Betacoronavirus 1) – e di solito sono associati a infezioni lievi e autolimitanti delle vie respiratorie superiori, sebbene possano causare gravi malattie nei pazienti immunocompro compromessi.2

Altre due specie, la sindrome respiratoria mediorientale-CoV (MERS-CoV) e la SARS-CoV, sono emerse di recente e causano gravi malattie nell’uomo. Come le altre COV (HCOV) che infettano l’uomo, 3,4 l’infezione da SARS-CoV-2 può suscitare una solida risposta anticorpale nell’uomo,5,6 e questa risposta rappresenta uno dei principali obiettivi degli sforzi diffusi per sviluppare diagnosi accurate e strategie per l’immunizzazione passiva e attiva contro l’infezione.7, 8, 9

I saggi sierologici esistenti per la reattività degli anticorpi SARS-CoV-2 generalmente usano proteine o domini virali a figura intera – Spike (S), Nucleocapsid (N) o il dominio di legame recettore (RBD) di S – come esche antigeniche, seguite da un rilevamento enzimatico o fluorescente.9

Questi test forniscono una singola misura della reattività degli anticorpi, che rappresenta un segnale composito in molti epitopi, e sono in grado di rilevare l’esposizione virale con una serie di accuratezze.10,11 Sono stati sviluppati anche test di neutralizzazione utilizzando virus nativi o pseudotipi.12 Resta da vedere come questi diversi test funzioneranno come diagnostica o correlati della protezione conferita dall’infezione o dalla vaccinazione.

Rispetto alle analisi a base proteica della risposta umoristica, i saggi a livello di epitopo hanno il potenziale per aggiungere diversi strati di informazioni. In primo luogo, sebbene le proteine SARS-CoV-2 siano generalmente distinte dagli altri veicoli pesanti, esistono alcune regioni di forte conservazione,1,13 il che significa che esiste il potenziale di reattività incrociata immunitaria che può essere risolto solo a livello epitopico.

È stato recentemente dimostrato che gran parte degli individui non esposti ha reattività delle cellule T ai peptidi SARS-CoV-2, indicando la reattività incrociata con le risposte esistenti, probabilmente quelle generate contro peptidi omologhi da veicoli pesanti endemici.14

Nel caso di risposte anticorpali, è stata descritta la reattività incrociata tra le analisi più strettamente correlate SARS-CoV e SARS-CoV-2.15,16 Le analisi risolte con epitopi hanno quindi il potenziale per identificare antigeni che possono discriminare i COV correlati, portando a test diagnostici più specifici.

Alti livelli di conservazione della sequenza possono anche indicare essenzialità funzionale; pertanto, evidenziando epitopi potenzialmente reattivi nelle regioni conservate del proteoma, i test a livello di epitopo possono identificare anticorpi e bersagli con potenziale terapeutico, contro i quali la fuga virale può essere più difficile.17

Una seconda logica per generare viste risolte con epitopi è che il riconoscimento degli anticorpi di diverse regioni proteiche può avere conseguenze funzionali divergenti, incluso il potenziale di neutralizzazione. Per i COV, gli anticorpi che legano la proteina S esposta alla superficie e legante il recettore presentano il più grande potenziale neutralizzante,18,19 ma questi anticorpi possono riconoscere un’ampia varietà di epitopi all’interno della proteina, ognuno con il potenziale per diverse conseguenze funzionali.

Ciò spiega probabilmente la correlazione imperfetta tra i formicolio degli anticorpi leganti S e l’attività di neutralizzazione virale tra gli individui.20 A causa della sua interazione con il recettore dell’ingresso dell’ospite (l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 [ACE2]),l’RBD di S rappresenta il bersaglio predominante delle strategie di vaccinazione e sviluppo di anticorpi monoclonali e un numero crescente di anticorpi contro questo dominio sono stati descritti.20, 21, 22, 23

Tuttavia, l’RBD è una delle regioni meno conservate del proteoma CoV, e anche gli anticorpi contro gli epitopi al di fuori dell’RBD hanno dimostrato di avere attività neutralizzante21,24; questi possono agire in vari modi, anche prevenendo importanti eventi di scissione della proteasi e/o cambiamenti conformazionali necessari per un efficace ingresso nelle cellule.

Tuttavia, gli anticorpi che riconoscono gli epitopi all’interno della proteina N, che ricopri il genoma virale ed è contenuto all’interno di particelle virali mature, forniscono probabilmente un potenziale di neutralizzazione minimo o nullo, ma possono essere firme utili per differenziare le risposte dei vaccini da quelle derivanti dall’infezione da virus naturale, una strategia già utilizzata per altri virus.25,26

Oltre al diverso potenziale di neutralizzazione, è possibile che distribuzioni sfavorevoli della reattività degli epitopi possano contribuire all’immunopatologia, ad esempio attraverso il miglioramento dipendente dagli anticorpi,27, 28, 29 sebbene questo fenomeno resti da dimostrare per SARS-CoV-2.30

Le sottosezioni peptidiche sono state utilizzate per decenni come sonde per rilevare anticorpi che riconoscono epitopi lineari all’interno delle proteine a lunghezza intera da cui derivano.31,32 Sebbene incapace di rilevare anticorpi il cui legame dipende da elementi discontinui nella sequenza primaria, questa strategia ha il vantaggio che consente la progettazione parallela, la sintesi e il dosaggio di migliaia di esche antigene a livello di epitopo.

Nel suo formato più semplice, i peptidi possono essere usati individualmente, ad esempio in pozzi separati in un ELISA. Uno studio recente ha utilizzato questo approccio per identificare due epitopi lineari nella proteina S che sono stati presi di mira neutralizzando gli anticorpi nei donatori convalescenti SARS-CoV-2.24 Test più potenti coinvolgono insiemi di peptidi che vengono saggiati in multiplex usando l’indirizzamento spaziale, nel caso di array peptidici,33 o l’indicizzazione del DNA, nel caso di librerie di visualizzazione del fago.34 Utilizzando quest’ultimo approccio , il rilevamento altamente multiplexato ed epitopico degli anticorpi contro i virus è stato dimostrato con elevata sensibilità e specificità.35

Qui, presentiamo un approccio di biologia sintetica a saggi sierologici altamente multiplexati a base peptidica (PepSeq) in cui le librerie di esche peptidiche, ognuna accoppiata covalentemente a un codice a barre del DNA, vengono sintetizzati da pool di DNA ad alta complessità utilizzando un approccio semplice e completamente in vitro.

La sintesi della libreria sfrutta la trascrizione e la traduzione in vitro, incluso un accoppiamento intramolecolare mediato dalla puromicina,36,37 e i peptidi codificati a barre del DNA possono quindi essere utilizzati per sondare gli anticorpi utilizzando una lettura del sequenziamento ad alta produttività.

Utilizziamo questa piattaforma per sintetizzare librerie di peptidi da 30 mer sovrapposti che coprono tutti i proteomi HCoV e testarli contro i sieri di donatori convalescenti prepandemici e SARS-CoV-2. I nostri risultati dimostrano il rilevamento accurato dell’esposizione alla SARS-CoV-2 e rivelano più epitopi anticorpali ricorrenti, tra cui due epitopi Spike in cui le risposte anticorpali reagiscono tra sars-CoV-2 e uno o più veicoli pesanti endemici. Dimostriamo inoltre che questi anticorpi cross-reattivi si legano preferenzialmente ai peptidi endemici dell’HCoV, suggerendo che la risposta alla SARS-CoV-2 in queste regioni è modellata dalla precedente esposizione al CoV.

collegamento di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7816965/


Maggiori informazioni: Nischay Mishra et al, Mappe peptidiche immunoreattive della

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