SARS-CoV-2: una molecola naturale può aiutare il coronavirus a sfuggire agli anticorpi

I ricercatori hanno scoperto che una molecola naturale può bloccare efficacemente il legame di un sottoinsieme di anticorpi umani al SARS-CoV-2.

La scoperta può aiutare a spiegare perché alcuni pazienti COVID-19 possono ammalarsi gravemente nonostante abbiano alti livelli di anticorpi contro il virus.

Nella loro ricerca, pubblicata su Science Advances oggi (22 aprile 2021), i team del Francis Crick Institute, in collaborazione con i ricercatori dell’Imperial College London, Kings College London e UCL (University College London), hanno scoperto che la biliverdina e la bilirubina, naturali molecole presenti nel corpo, possono sopprimere il legame degli anticorpi al picco del coronavirus.

Poiché i vaccini vengono lanciati a livello globale, la comprensione dell’immunità a SARS-CoV-2 e anche di come il virus elude gli anticorpi è di fondamentale importanza. Tuttavia, ci sono ancora molte incognite.

La capacità del sistema immunitario di controllare l’infezione e la qualità della risposta anticorpale sono molto variabili e non ben correlate tra gli individui.

I ricercatori di Crick sono stati coinvolti nello sviluppo di test che verificano se una persona è stata esposta al virus. Gli scienziati hanno scoperto che la proteina spike SARS-CoV-2 si lega fortemente alla biliverdina, una molecola che conferiva a queste proteine ​​un’insolita colorazione verde.

Lavorando con i team dell’Imperial College di Londra, dell’UCL e del Kings College di Londra, hanno scoperto che questa molecola naturale riduceva il legame degli anticorpi al picco. Hanno usato sieri di sangue e anticorpi di persone che erano state precedentemente infettate da SARS-CoV-2 e hanno scoperto che la biliverdina poteva sopprimere il legame degli anticorpi umani al picco fino al 30-50%, con alcuni anticorpi che diventavano inefficaci nel neutralizzare il virus .

Un impatto così significativo è stato del tutto inaspettato, poiché la biliverdina si lega solo a una piccola macchia sulla superficie del virus. Per scoprire il meccanismo al lavoro, il team del Crick ha utilizzato la microscopia crioelettronica e la cristallografia a raggi X per esaminare in dettaglio le interazioni tra il picco, gli anticorpi e la biliverdina.

Hanno scoperto che la biliverdina si attacca al dominio N-terminale del picco e lo stabilizza in modo che il picco non sia in grado di aprirsi ed esporre parti della sua struttura.

Ciò significa che alcuni anticorpi non sono in grado di accedere ai loro siti target e quindi non possono legarsi e neutralizzare il virus.

Annachiara Rosa, prima autrice e borsista di formazione post-dottorato presso la struttura della cromatina e il laboratorio mobile del DNA presso il Crick, afferma: “Quando SARS-CoV-2 infetta i polmoni di un paziente danneggia i vasi sanguigni e provoca un aumento del numero di cellule immunitarie. Entrambi questi effetti possono contribuire ad aumentare i livelli di biliverdina e bilirubina nei tessuti circostanti.

E con più di queste molecole disponibili, il virus ha più possibilità di nascondersi da alcuni anticorpi. Questo è un processo davvero sorprendente, poiché il virus potrebbe beneficiare di un effetto collaterale del danno che ha già causato “.

Peter Cherepanov, autore e leader del gruppo della struttura della cromatina e del laboratorio mobile del DNA presso il Crick, afferma: “Nei primi mesi della pandemia, eravamo estremamente impegnati a sfornare antigeni virali per i test SARS-CoV-2. Era una gara, perché questi test erano urgentemente necessari.

Quando finalmente abbiamo trovato il tempo per studiare le nostre proteine ​​verdi, ci aspettavamo una risposta banale. Invece, siamo rimasti sbalorditi nello scoprire un nuovo trucco che il virus utilizza per evitare il riconoscimento degli anticorpi. Questo è il risultato di uno sforzo collaborativo di diversi fantastici team che lavorano presso il Crick e tre università partner, guidati esclusivamente dalla curiosità scientifica “.

I ricercatori continueranno questo lavoro da varie angolazioni, inclusa la misurazione dei livelli di biliverdina e altri metaboliti dell’eme nei pazienti con COVID-19 ed esploreranno anche se è possibile dirottare il sito di legame utilizzato dalla biliverdina per trovare potenzialmente nuovi modi per colpire il virus. .

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Le glicoproteine ​​spike coronavirali trimeriche formano caratteristiche prominenti sulle particelle virali che sono responsabili dell’attaccamento a un recettore sulla cellula ospite e, in ultima analisi, della fusione delle membrane virali e cellulari (1, 2). 

Codificata da un singolo gene virale, la glicoproteina spike matura comprende due subunità, S1 e S2, che mediano rispettivamente il legame al recettore e facilitano la fusione. Il riconoscimento del recettore ospite del betacoronavirus SARS-CoV-2, l’enzima 2 di conversione dell’angiotensina della proteina di membrana cellulare, mappa al dominio S1 C-terminale (indicato come dominio di legame del recettore, RBD) (3–5), mentre il la funzione del dominio N-terminale (NTD) rimane enigmatica.

Entrambi i domini possono essere presi di mira da potenti anticorpi neutralizzanti che si presentano negli individui infetti. La maggior parte degli anticorpi neutralizzanti caratterizzati si lega al RBD, mentre esistono informazioni strutturali minime sulla neutralizzazione degli epitopi sulla NTD (6-10). Le proprietà immunitarie della glicoproteina spike sono alla base degli sforzi di sviluppo del vaccino SARS-CoV-2 in corso (11).

Nel corso delle nostre attività a sostegno dello sviluppo della sierologia per SARS-CoV-2, abbiamo prodotto una gamma di antigeni spike coronavirali ricombinanti mediante espressione in linee cellulari umane (Fig. S1A). Sorprendentemente, le preparazioni di picco trimerico SARS-CoV-2 e S1 presentavano una tonalità verde distintiva, con picchi prominenti a ~ 390 e 670 nm nei loro spettri di assorbanza della luce (Fig. S1A-B). Queste caratteristiche insolite erano evidenti anche nello spettro di S1 ​​dell’isolato di SARS-CoV-1 del 2003, ma non in quelli dei coronavirus umani stagionali NL63 e OC43 (Fig. S1B – C).

La proprietà era confinata all’interno del picco NTD ed era assente nella RBD isolata (Fig. S1B). Gli spettri dei costrutti spike SARS-CoV erano coerenti con la biliverdina (Fig. S1B), un prodotto del metabolismo dell’eme responsabile della colorazione delle contusioni e dell’ittero verde. Abbiamo isolato il pigmento da SARS-CoV-2 S1 denaturato e confermato la presenza di biliverdina IXα mediante spettrometria di massa (Fig. S2). La biliverdina viene prodotta nella prima fase della disintossicazione dell’eme dalle ossigenasi e viene quindi ridotta a bilirubina, il prodotto finale del catabolismo del tetrapirrolo nell’uomo (12).

Abbiamo misurato il legame del tetrapirrolo al SARS-CoV-2 S1 immobilizzato utilizzando la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e stimato la costante di dissociazione (Kd) per l’interazione con biliverdina e bilirubina a 9,8 ± 1,3 nM e 720 ± 250 nM, rispettivamente (Fig. S3A –B, tabella S1). Anche SARS-CoV-1 S1 mostra un’affinità nanomolare per la biliverdina (Fig. S3I, Tabella S1). Lo spike si lega in modo considerevolmente più debole, con Kd di 7,0 ± 1,2 μM, mentre non è stata osservata alcuna interazione con la protoporfirina IX (Fig. S3C – D, Tabella S1).

Successivamente, abbiamo ripreso singole particelle dell’ectodominio spike trimerico SARS-CoV-2 (3, 13) in presenza di biliverdina in eccesso utilizzando la microscopia crioelettronica. L’elaborazione delle immagini ha portato alla ricostruzione 3D degli stati chiusi (3RBD verso il basso) e parzialmente aperti (conformazione 1RBD verso l’alto) del picco rispettivamente con una risoluzione di 3,35 e 3,50 Å (Fig. 1A, Fig. S4, Tabella S2). Un’attenta ispezione delle mappe crio-EM ha rivelato caratteristiche interpretabili come una molecola di biliverdina sepolta all’interno di una fessura profonda su un lato di ciascuno dei domini NTD (Fig. 1A, Fig. S5A).

Per definire la base strutturale per l’interazione in modo più preciso, abbiamo co-cristallizzato l’NTD isolato con biliverdina e determinato la struttura con una risoluzione di 1,8 Å (Fig. 1B, Fig. S5B, Tabella S3). Il metabolita si inserisce perfettamente nella fessura con gli anelli pirrolici B e C sepolti all’interno e gruppi propionato aggiunti agli anelli A e D che sporgono verso l’esterno. La tasca è rivestita da residui idrofobici (Ile101, Trp104, Ile119, Val126, Met177, Phe192, Phe194, Ile203 e Leu226), che formano interazioni di van der Waals con il ligando. Biliverdin si impacchetta contro His207, che proietta il suo atomo di Nε2 verso le ammine pirroliche, avvicinandosi a tre di esse a ~ 3,6 Å. I pirroli A e B sono coinvolti in un impilamento π-π con catena laterale di Arg190, che è stabilizzato dal legame idrogeno con Asn99.

Il legame della biliverdina seppellisce in gran parte la catena laterale di Asn121, che crea un legame idrogeno con il gruppo lattamico del pirrolo D.In accordo con le ampie interazioni osservate nella struttura cristallina, il punto di fusione dell’NTD isolato è aumentato di oltre 8 ° C la presenza di biliverdina (Fig. S3K). Entità non identificate nel sito di legame del tetrapirrolo sono state osservate nelle ricostruzioni di spike SARS-CoV-2 pubblicate (1, 4, 13-17), presumibilmente ottenute con occupazione parziale da parte del metabolita; in alcune mappe crio-EM, la molecola di biliverdina legata è risolta notevolmente bene (Fig. S6) (14-17).

La presenza di un residuo di istidina nella tasca di legame della biliverdina (Fig. 1B) ha suggerito che l’interazione potrebbe essere dipendente dal pH. In accordo con questa ipotesi, il Kd dell’interazione S1-biliverdina è aumentato a 250 ± 100 μM a pH 5,0 (Fig. S3E, H e Tabella S1) e la purificazione in condizioni acide ha ridotto notevolmente il contenuto di biliverdina di SARS-CoV- ricombinante 2 S1 (Fig. S1D).

Le sostituzioni di residui di spike strettamente coinvolti nel legame del ligando (H207A, R190K e N121Q) hanno diminuito la pigmentazione della proteina ricombinante purificata (Fig. S1E). L’affinità di legame della biliverdina di SARS-CoV-2 S1 è stata ridotta di due e tre ordini di grandezza dalle sostituzioni amminoacidiche R190K e N121Q, rispettivamente (Fig. S3F-H, Tabella S1). Quest’ultimo ha ablato l’interazione con la bilirubina, confermando che i tetrapirroli condividono il sito di legame sul picco (Fig. S3H). I picchi di SARS-CoV-2 che trasportano queste mutazioni supportano l’infezione delle cellule Vero e Huh7 da un vettore retrovirale pseudotipato, indicando che il legame della biliverdina non è richiesto per l’ingresso virale in condizioni di coltura tissutale (Fig. S7).

Poiché il legame della biliverdina nasconde una profonda fenditura idrofobica sul NTD (Fig. 1B), abbiamo sospettato che potesse mascherare o modificare le proprietà antigeniche del picco virale. Per testare questa ipotesi, abbiamo misurato la reattività dei sieri di 17 individui infetti da SARS-CoV-2 e convalescenti con WT a tutta lunghezza e picco N121Q SARS-CoV-2 utilizzando un test basato sulla citometria a flusso (18). Sorprendentemente, l’aggiunta di 10 μM di biliverdina ha ridotto il legame delle IgG del paziente al picco di WT, sopprimendo la reattività di alcuni sieri immuni fino al 50% (Fig. 2).

Al contrario, l’anticorpo che si lega al picco di N121Q SARS-CoV-2 non è stato influenzato dall’aggiunta di biliverdina (Fig. 2). Il legame degli anticorpi IgM e IgA, che sono presenti a titoli inferiori in questi pazienti (18), è stato influenzato in modo più variabile (Fig. S8B-D). In un esperimento separato, abbiamo testato 91 campioni di siero clinico in un test di immunoassorbimento legato all’enzima di cattura IgG (ELISA). Gli anticorpi specifici per SARS-CoV-2 sono stati rilevati utilizzando WT o N121Q S1 coniugati con perossidasi di rafano. Il WT S1 impoverito di biliverdina era significativamente più reattivo della stessa proteina integrata con il metabolita in eccesso (Fig. S9). Al contrario, l’aggiunta di biliverdina non ha smorzato il rilevamento degli anticorpi SARS-CoV-2 con N121Q S1 (Fig. S9).

È notevole che una piccola molecola con un’impronta di 370 Å2, corrispondente a solo ~ 0,9% della superficie esposta al solvente (per monomero spike, Fig. 1A), compete con una frazione considerevole della popolazione di anticorpi sierici spike specifici (Fig . 2). Questi risultati ci hanno spinto a valutare un pannello di anticorpi umani clonati da cellule B di individui convalescenti SARS-CoV-2.

Abbiamo utilizzato 38 IgG riportate in uno studio recente (10), nonché un pannello di 15 nuove IgG specifiche per SARS-CoV-2 S1 ottenute da individui con infezione asintomatica o malattia lieve / grave in fase di caratterizzazione in uno dei nostri laboratori ( Graham et al., In preparazione). Abbiamo testato questi anticorpi monoclonali per il legame con WT ricombinante e N121Q S1 mediante ELISA. Notevolmente, 9 IgG su 53 (17%) hanno perso il legame con WT, ma non con N121Q S1, in presenza di biliverdina 10 μM (Fig. 3A,, C, C, Fig. S10A). Inoltre, l’aggiunta di biliverdina ha fortemente soppresso il legame di questi anticorpi al WT a tutta lunghezza ma non il picco N121Q SARS-CoV-2 espresso sulla superficie delle cellule HEK293T trasfettate (Fig. 3B,, D) .D). Al contrario, la reattività di entrambi i controlli specifici per RBD (COVA1–18 e COVA1–12) non è stata influenzata dal metabolita (Fig. 3A – D).

Due delle IgG monoclonali sensibili alla biliverdina, COVA1–22, COVA2–17, sono state precedentemente segnalate per neutralizzare efficacemente il retrovirus pseudotipato SARS-CoV-2 (10). L’aggiunta di biliverdina ha soppresso la neutralizzazione dello pseudotipo che trasporta WT ma non il picco di N121Q (Fig. 3E). La mutazione ha avuto un effetto differenziale sulla neutralizzazione mostrando una diminuzione della potenza per COVA1–22 e nessun effetto per P008_056 o COVA2–17.

Come previsto, l’aggiunta di biliverdina non ha avuto alcun effetto sulla neutralizzazione da parte di COVA1-18. La neutralizzazione di SARS-CoV-2 competente per la replicazione da parte di P008_056, COVA1–22 o COVA2–17 è stata sostanzialmente ridotta dall’aggiunta di biliverdina (Fig. 3F). Curiosamente, mentre P008_056 sembrava un po ‘meno potente nel test dello pseudotipo (Fig. 3E), ha neutralizzato in modo efficiente il virus SARS-CoV-2 vivo, ottenendo il 50% e> 90% di inibizione a concentrazioni di 0,03 e 1,56 μg / ml, rispettivamente, in un modo sensibile alla biliverdina (Fig. 3F, Fig. S10B).

Per stabilire la base strutturale per la neutralizzazione di SARS-CoV-2 da parte di un anticorpo sensibile alla biliverdina, abbiamo ripreso singole particelle del picco virale nel complesso con il frammento di legame dell’antigene P008_056 (Fab). L’elaborazione delle immagini Cryo-EM ha portato alla ricostruzione di strutture con una, due e tre frazioni Fab legate per glicoproteina virale trimerica (Fig. S10A-B) e la mappa migliore è stata ottenuta per il complesso contenente un singolo Fab (Fig. 4A, Fig. . S11C – D).

La ricostruzione con una risoluzione locale di ~ 4 Å all’interfaccia NTD-Fab ha consentito il tracciamento inequivocabile della spina dorsale proteica e ha rivelato le posizioni delle catene laterali chiave degli amminoacidi (Fig. 4A, Fig. S5C). P008_056 lega il picco a lato della piega β-sandwich NTD, che subisce profondi riarrangiamenti conformazionali (Film S1). L’accesso all’epitopo è chiuso da un anello esposto al solvente composto da residui prevalentemente idrofili (“gate”, residui di spike SARS-CoV-2 174-188; Fig. 1).

Per consentire l’associazione P008_056, il loop si allontana, con uno spostamento della spina dorsale nel mezzo del loop di ~ 15 Å (Fig. 4B). Il meccanismo di gating è accompagnato dall’inserimento di Phe175 e Met177, che si trovano all’inizio del loop, nella tasca idrofobica liberata dalla biliverdina (Fig. 4B, Fig. S5C).

Pertanto, quando legato, il metabolita sembra agire come un cuneo che limita l’apertura del cancello. Il legame dell’anticorpo è inoltre completato da un movimento verso l’alto di una forcina β (“labbro”, residui di SARS-CoV-2 143–155), che si sovrappone a un gruppo di residui aromatici (Fig. 1, Fig. 4B). Il marcato aumento della stabilità termica dopo il legame della biliverdina (Fig. S3K) è coerente con la resistenza a un anticorpo che richiede un importante rimodellamento conformazionale del NTD per il legame (Film S1).

È ben noto che i virus impiegano un’ampia glicosilazione del loro involucro per proteggere gli epitopi anticorpali dal riconoscimento da parte dell’immunità umorale (19-21). Qui, abbiamo identificato e caratterizzato strutturalmente una nuova classe di un epitopo neutralizzante, presente sul picco di SARS-CoV-2, che è esposto in modo differenziale attraverso il reclutamento di un metabolita. Contrariamente alla glicosilazione, la cooptazione di un metabolita può consentire lo smascheramento condizionale, ad esempio in condizioni acide all’interno del compartimento endosomiale. I livelli di biliverdina nel plasma di individui sani (0,9-6,9 μM) e più in condizioni patologiche (> 50 μM) (22) superano notevolmente il Kd della sua interazione con il picco (~ 10 nM) e sono quindi sufficienti per influenzare la SARS- Proprietà antigeniche e neutralizzazione del CoV-2.

Sebbene bilirubina legata a spike SARS-CoV-2 con minore affinità (Fig. S3), questo prodotto finale del catabolismo ematico si accumula a livelli più elevati in vivo (22). Inoltre, livelli elevati di bilirubina sono correlati ai sintomi e alla mortalità tra i pazienti COVID-19 (23-26). Pertanto, i tetrapirroli probabilmente condividono un ruolo nell’evasione immunitaria SARS-CoV-2. Gravi sintomi di COVID-19 e morte sono associati a infiltrazione di neutrofili nei capillari polmonari e nello spazio alveolare (27).

Infatti, i tamponi nasofaringei di pazienti COVID-19 sono arricchiti in mieloperossidasi neutrofila (28), una proteina contenente eme altamente abbondante responsabile della colorazione del muco (29). Oltre a un esteso danno vascolare, questi sintomi forniscono una ricca fonte di cataboliti dell’eme, che possono contribuire all’incapacità di controllare l’infezione nei casi più gravi. Le mutazioni all’interno del picco di SARS-CoV-2 NTD sono associate alla fuga virale dall’immunità anticorpale (30, 31) e sono state osservate nei ceppi virali circolanti (32, 33). I nostri risultati dimostrano una notevole plasticità strutturale della NTD ed evidenziano l’importanza di questo dominio per l’immunità anticorpale contro SARS-CoV-2.

link di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7852234/

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Ulteriori informazioni:  SARS-CoV-2 può reclutare un metabolita eme per eludere l’immunità anticorpale,  Science Advances  (2021). DOI: 10.1126 / sciadv.abg7607  ,  advances.sciencemag.org/conten… 04/22 / sciadv.abg7607