I ricercatori hanno scoperto che il tropismo testicolare SARS-CoV-2 è più alto di quanto si pensasse

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Uno studio brasiliano e americano scopre che i testicoli dei maschi potrebbero essere santuari virali per il virus SARS-CoV-2.

Risultati allarmanti di un nuovo studio condotto da ricercatori dell’Universidade Federal de Minas Gerais-Brazil, University of Texas Medical Branch-USA, University of Pittsburgh School of Medicine-USA, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto-Brazil, Universidade Estadual Paulista- Brasile e Clínica MF Fertilidade Masculina-Brazil mostrano che il SARS-CoV-2 infetta, replica, eleva l’angiotensina II e attiva le cellule immunitarie nei test umani. 

Questi risultati implicano anche che i testicoli dei maschi umani sono un serbatoio perfetto per il virus SARS-CoV-2.

I risultati dello studio sono stati pubblicati su un server di prestampa e sono attualmente in fase di revisione paritaria.

https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.02.05.22270327v1

Poiché il testicolo mostra una delle più alte espressioni dei recettori dell’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2), che mediano l’ingresso cellulare di SARS-CoV-2, e i dati attuali suggeriscono che gli uomini sono più colpiti delle donne(1), valutazioni testicolari approfondite di pazienti affetti da COVID-19 è un imperativo.

Studi precedenti presentano risultati discordanti riguardo al rilevamento di SARS-CoV-2 nel parenchima testicolare mediante RT-PCR (2–5) e all’entità del danno testicolare causato dal virus(5). Inoltre, molte domande sull’infezione virale rimangono inesplorate, come la replicazione virale, la via dell’infezione e l’identità delle cellule infette.

Sebbene alcune alterazioni testicolari promosse dall’infezione da SARS-CoV-2 siano state precedentemente dimostrate (2–5), gli attori della patogenesi testicolare in COVID-19 rimangono sconosciuti. Pertanto, lo studio delle alterazioni geniche cellulari, enzimatiche, ormonali e critiche nei testicoli dei pazienti COVID-19 dovrebbe contribuire a una migliore comprensione della biologia SARS-CoV-2 e del suo possibile impatto sui testicoli e sulla fertilità maschile.

Di recente, Edenfield e Easley(6) hanno pubblicato un articolo prospettico su Nature Reviews Urology sollecitando la necessità di svelare i potenziali meccanismi che coinvolgono l’ingresso di SARS-CoV-2 e gli effetti fisiopatologici sui soggetti affetti.

Abbiamo utilizzato diversi metodi per rilevare la SARS-CoV-2 nel parenchima del testicolo di pazienti deceduti con COVID-19 e abbiamo studiato le capacità infettive e replicative del virus. Abbiamo anche rivelato le alterazioni cellulari e molecolari nella fisiopatologia testicolare umana e correlato i risultati con i dati clinici dei pazienti, svelando i potenziali meccanismi alla base delle alterazioni osservate


Rilevamento affidabile SARS-CoV-2 nei testicoli

Per prima cosa abbiamo testato il tessuto testicolare utilizzando un protocollo RT-qPCR convenzionale per SARS-CoV-2 e solo il paziente n. 8 è stato rilevato positivamente (soglia del ciclo – CT = 38).

Per migliorare il rilevamento e ridurre l’interferenza dei fattori tissutali intrinseci, abbiamo eseguito una sintesi di cDNA utilizzando primer virali specifici per SARS-CoV-2. La RT-qPCR ha rivelato la presenza del virus in 10 su 11 pazienti (Tabella 2). Studi precedenti hanno presentato risultati contrastanti per quanto riguarda il rilevamento dell’RNA SARS-CoV-2 nei testicoli (2–5).

Per confermare i dati genetici, abbiamo utilizzato un sensore nano-progettato (che impiega la risonanza plasmonica di superficie localizzata – LSPR)(11) per rilevare la proteina SARS-CoV-2 Spike (S) e la proteina nucleocapside (N) (supplementare Fig.1a-q). La proteina S è stata trovata in tutti, mentre la proteina N è stata osservata in nove pazienti (Tabella 2 e Figura 1m-q supplementare).

L’importante immunomarcatura della proteina S è stata evidenziata nei testicoli di tutti i pazienti COVID-19 (Figura 2 supplementare), specialmente nel paziente n. 8 (rilevato positivamente da tutte le metodologie). Questi risultati suggeriscono che il tropismo SARS-CoV-2 per i testicoli è superiore a quanto si pensasse in precedenza e che il protocollo RT-qPCR convenzionale può rilevare solo i testicoli infetti con una carica virale più elevata. I nostri dati suggeriscono che sono necessarie tecniche più sensibili per il rilevamento affidabile di SARS-CoV-2 (anche in un titolo virale basso) nei testicoli.

Principali cellule infette nel parenchima del testicolo

Sono stati rilevati diversi monociti/macrofagi infetti (CD68+) che circondano i vasi sanguigni e migrano verso il parenchima (dati IF e TEM), suggerendo che queste cellule potrebbero fornire SARS-CoV-2 al testicolo (Fig.1a-c, frecce), contribuendo all’infezione delle cellule testicolari. I macrofagi infetti sono stati confermati mediante doppia immunofluorescenza e TEM (Fig.1d-g).

Monociti/macrofagi sono stati trovati anche all’interno del compartimento tubulare, indicando una possibile via di diffusione virale all’interno dei tubuli seminiferi (Fig.1h). Al contrario, i mastociti positivi alla chimasi non sono stati etichettati per la proteina S (Figura 3a-b supplementare).

La maggior parte dell’etichettatura della proteina S è stata identificata all’interno dei tubuli seminiferi, principalmente nelle cellule germinali (Fig.1 im). Mentre mostriamo cellule germinali positive per la proteina S, altri autori hanno mostrato positività per la proteina N(4). In alcune aree, le cellule spermatogoniali hanno mostrato un’intensa etichettatura della proteina S rispetto a spermatociti e spermatidi (Fig.1n, punta di freccia rossa).

Tuttavia, la proteina S SARS-CoV-2 è stata rilevata negli spermatogoni, negli spermatociti e negli spermatidi (Fig.1o-t). I pazienti deceduti fino a 20 giorni dopo il ricovero in terapia intensiva (ICU) presentavano l’indice di fluorescenza medio più alto nel testicolo (Figura 2a supplementare). Le cellule germinali infettate da SARS-CoV-2 aumentano i timori di una potenziale trasmissione sessuale, rafforzata dal rilevamento dell’RNA di SARS-CoV-2 nello sperma di pazienti che hanno subito la forma grave di COVID-19(17).

Alcune cellule mioidi Sertoli, Leydig (ACE2(18) altamente espresse) e peritubulari presentavano anche particelle virali nel loro citoplasma (dati TEM), sebbene con un’intensità di immunomarcatura della proteina S inferiore (Fig. 2a-c’, punte di freccia e inserti). Tuttavia, molte di queste cellule non hanno mostrato evidenti particelle virali nel citoplasma (dati TEM) (Fig. 2e-j).

Replicazione virale e vitalità

Le analisi TEM hanno identificato una fabbrica di replicazione virale nei macrofagi, che sono noti per esprimere ACE2 e TMPRSS2(19), e nelle cellule spermatogoniali, che esprimono altamente TMPRSS2(18) (Fig.3a-f). In entrambi i tipi cellulari, abbiamo osservato complessi di replicazione SARS-CoV-2 con la formazione di membrane contorte (rete membranose di replicazione, RMW) contenenti vescicole a doppia membrana (DMV) e Complesso Intermedio del Golgi del reticolo endoplasmatico (ERGIC) che mostrano nuovi virioni (Fig. 3c-f). Queste caratteristiche morfologiche sono conformi alla replicazione di SARS-CoV-2 nel citoplasma cellulare(20).

Il privilegio immunitario testicolare previene l’attacco autoimmune delle cellule germinali aploidi, ma consente anche ai virus di sfuggire all’immunosorveglianza(21). Il “paradosso dei macrofagi”, descritto nei danni ai polmoni indotti da SARS-CoV-2(19) può applicarsi anche ai testicoli. Pertanto, sebbene i macrofagi combattano le infezioni virali, possono agire come cavalli di Troia(19), facilitando l’ingresso virale e la replicazione nel testicolo.

Sebbene sia possibile che il testicolo possa essere infettato dall’invasione diretta causata dalla viremia, i nostri risultati indicano che i monociti/macrofagi infetti che migrano (ad esempio dai polmoni) possono anche trasportare attivamente il virus nei testicoli(22). L’identificazione dell’accesso virale al testicolo e del locale di replicazione è importante perché la tolleranza immunitaria testicolare può ostacolare la clearance virale dal corpo umano, come si osserva per altri virus(21).

In un laboratorio BSL-3, abbiamo esposto colture cellulari VERO CCL-81 a omogenati testicolari di un paziente infetto e abbiamo scoperto che SARS-CoV-2 era infettivo e in grado di replicarsi in queste cellule. Questi dati sono stati confermati dall’immunoistochimica, dall’effetto citopatico nella coltura cellulare VERO infetta e dalla RT-qPCR convenzionale (Fig.3g-j), indicando che non stavamo osservando solo frammenti di particelle virali.

Precedenti ricerche hanno indicato che la negatività SARS-CoV-2 nei test RT-qPCR (almeno in due test consecutivi) si verifica solitamente tra 6-12 giorni dal momento dell’insorgenza dei sintomi(23). Tuttavia, secondo i nostri dati, il virus rimane vitale per un periodo più lungo all’interno del testicolo. 

Infatti, SARS-CoV-2 è stato rilevato nel testicolo del paziente n. 1, morto 26 giorni dopo l’esordio dei sintomi (Fig.3k). Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che i testicoli possono fungere da santuari per SARS-CoV-2, mantenendo i virus infettivi per lunghi periodi. L’ambiente del testicolo può anche essere correlato alla clearance virale ritardata negli uomini rispetto alle donne(24). 

Inoltre, i testicoli non possono essere trascurati nella valutazione delle condizioni cliniche dei pazienti perché sono un sito di replicazione virale e di conseguenza una fonte di carica virale.

Fibrosi testicolare e alterazioni vascolari

La fibrosi testicolare è stata comunemente osservata nel parenchima del testicolo dei pazienti con COVID-19. Le fibre di collagene sono aumentate progressivamente (Fig.6o-u), mostrando elevate quantità di collagene di tipo I e III nel parenchima del testicolo (Fig.6t-u, Fig.5e-h supplementare). Inoltre, i livelli di espressione di Col3a erano fortemente aumentati nei testicoli dei pazienti di fase I (Fig.6e). È noto che l’angiotensina II, i mastociti attivati ​​ei macrofagi attivati ​​stimolano la sintesi del collagene da parte dei fibroblasti (50-52).

Le espressioni dei fattori angiogenici VEGF e PDGFA e la proporzione volumetrica dei piccoli vasi (CD31+) sono aumentate nel testicolo dei pazienti con COVID-19 (Fig.6e). Vasi sanguigni immaturi (dati TEM e immunoistochimica; cellule CD31+) sono stati osservati all’interno della tunica propria, suggerendo un processo angiogenico (Fig.6v e Fig.5i-m supplementare). 

I globuli rossi al di fuori del sistema vascolare testicolare sono stati frequentemente osservati nei testicoli dei pazienti COVID-19 (Fig, 6w-α, frecce). I pazienti della prima fase presentavano molti globuli rossi all’interno del lume del tubulo seminifero e della rete testicolare intratesticolare, probabilmente a causa di una riduzione delle giunzioni epiteliali strette (Figura 5n supplementare). Alcuni trombi sono stati rilevati all’interno del sistema vascolare (Figura 5o supplementare).

Inoltre, l’endotelina 1/2/3, una proteina coinvolta nella vasocostrizione dei vasi sanguigni, era altamente espressa nei pazienti della prima fase ma ridotta in altri

(Figura 5q-t supplementare). La triade, l’angiotensina II, i mastociti attivati ​​ei macrofagi attivati ​​possono aumentare la permeabilità vascolare(31,53,54).

Per quanto riguarda la limitazione dello studio, dovremmo evidenziare punti importanti dello studio in corso. In particolare, la cronologia della patogenicità testicolare si basava sulla presenza di cellule germinali avanzate nel parenchima del testicolo e sul momento del ricovero in terapia intensiva. Sebbene le nostre alterazioni istologiche e molecolari abbiano rafforzato questa classificazione concettuale, anche i dati di tutti gli individui sono stati presentati in un unico gruppo. Inoltre, sono stati inclusi nello studio solo i pazienti gravemente malati, deceduti per COVID-19.

Dobbiamo ricordare che i dati recenti sullo sperma dimostrano che i pazienti guariti dal COVID-19 ristabiliscono la qualità dello sperma dopo tre mesi dall’infezione(54). Non tutti i pazienti COVID-19 studiati presentavano le stesse comorbilità e i controlli non sono stati sottoposti ai farmaci utilizzati per i pazienti COVID-19.

D’altra parte, siamo riusciti a raccogliere ed elaborare i testicoli lo stesso giorno in cui si è verificata la morte, in contrasto con molti studi sui cadaveri con lunghi ritardi nella raccolta degli organi, che potrebbero aver compromesso l’esatta istologia, il rilevamento delle particelle di virione e la percezione di peptidi, mRNA e fluttuazioni ormonali.

CONCLUSIONI

Qui, abbiamo utilizzato metodi diversi e sensibili per rilevare le proteine ​​SARS-CoV-2, l’RNA e le particelle di virus nel testicolo. Nella figura 7, abbiamo ipotizzato i potenziali meccanismi virali, cellulari e molecolari di infezione e danno da SARS-CoV-2 nei testicoli di pazienti non vaccinati e gravemente malati.

Un’influenza diretta di SARS-CoV-2 nelle cellule testicolari potrebbe deregolare ACE2, elevando i livelli di angiotensina II, un potente peptide pro-infiammatorio e angiogenico. Fattori angiogenici e infiammatori potrebbero indurre l’infiltrazione e l’attivazione di mastociti e macrofagi. quindi, gli effetti deleteri evidenziati nei testicoli dei pazienti affetti da COVID-19, cioè fibrosi, alterazione vascolare, infiammazione, ispessimento della tunica propria, perdita della barriera cellulare di Sertoli, apoptosi delle cellule germinali e inibizione delle cellule di Leydig, possono essere associati a un’elevata angiotensina II e a risposte di attivazione di mastociti e macrofagi (Fig. 7a).

Una rete proteina-proteina (o gene-gene) costruita dal database STRING (Fig. 7b) mostra l’interazione dei geni associati alla regolazione dell’angiotensina II, all’attivazione di mastociti e macrofagi e alle alterazioni del compartimento tubulare e intertubulare del testicolo.

I nostri risultati multidisciplinari potrebbero contribuire a una migliore comprensione del tropismo, della biologia e dell’impatto di SARS-CoV-2 sui testicoli e sulla fertilità maschile. Questo è il primo studio che mostra:

1) l’alto tropismo SARS-CoV-2 al testicolo;

2) one mode of SARS- CoV-2 entrance in testes;

3) SARS-CoV-2 preferisce l’infezione e replicazione in spermatogoni e macrofagi;

4) che il virus rimanga infettivo dopo un lungo periodo di infezione nei testicoli (serbatoio virale);

5) alti livelli di angiotensina II e mastociti e macrofagi attivati ​​sono attori critici nel promuovere tutte le alterazioni testicolari;

6) la condizione grave più estesa, minore è il numero di cellule germinali sopravvissute;

7) fluttuazione in diversi geni testicolari essenziali;

8) che i livelli di testosterone intratesticolare sono 30 volte ridotti nei testicoli dei pazienti con COVID-19;

9) i tipi prevalenti di collagene presenti nella fibrosi testicolare mediata da SARS-CoV-2;

10) la fluttuazione dei peptidi vasocostrittori nei testicoli di pazienti critici con COVID-19.

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