I risultati dello studio sono stati pubblicati sulla rivista peer review: Scientific Reports (Nature) https://www.nature.com/articles/s41598-022-06749-9
Nel presente studio, abbiamo dimostrato che (1) C. pneumoniae ha infettato rapidamente sia il nervo olfattivo che quello trigemino nei topi, (2) C. pneumoniae è entrato nel SNC attraverso i nervi entro 24-72 h dopo l’inoculazione intranasale e senza concomitante infezione del sangue, (3) la lesione all’epitelio nasale ha esacerbato l’infezione del nervo periferico, ma ha ridotto l’infezione cerebrale, (4) le inclusioni di C. pneumoniae nel nervo olfattivo e nel bulbo erano associate ad accumuli di Aβ, (5) le cellule gliali che popolano i nervi olfattivo/trigemino e la replicazione di C. pneumoniae supportata dal cervello e (6) l’infezione da C. pneumoniae porta a una regolazione differenziale dei geni correlati al morbo di Alzheimer.
Pertanto, C. pneumoniae può diffondersi molto rapidamente dalla periferia al SNC attraverso i nervi che si estendono tra la cavità nasale e il cervello, senza infezione del sangue. A nostra conoscenza, questo studio è il primo rapporto sulla deposizione di Aβ in risposta all’infezione da C. pneumoniae del sistema nervoso olfattivo primario e la prima volta una deposizione così rapida (72 h) di Aβ in risposta a qualsiasi batterio in animali selvatici in vivo è stato dimostrato.
Il lasso di tempo per l’infezione del SNC da C. pneumoniae è stato considerevolmente più rapido di quanto mostrato in precedenza (1 settimana–3 mesi16,17,18), il che potrebbe essere dovuto a differenze nella dose di inoculo poiché abbiamo utilizzato un’inoculazione più elevata dose rispetto a due studi precedenti16,50 ma inferiore ad altri 18.
Tuttavia, il lasso di tempo è paragonabile all’invasione del SNC attraverso i nervi cranici da parte di Burkholderia pseudomallei 32,43,44,52, Streptococcus pneumoniae 53, Neisseria meningitidis 54, Listeria monocytogenes 55 e ora recentemente un’altra specie di Chlamydia, C. muridarum24.
L’ameba Naegleria fowleri 56, così come il virus di tipo herpes simplex di tipo 1 (HSV-1)57, il coronavirus 2 (SARS-CoV-2)58,59,60 e altri coronaviridae61 della sindrome respiratoria acuta grave possono anche invadere il SNC attraverso questi due percorsi (mostrati nell’uomo e/o negli animali).
All’interno del bulbo olfattivo, sono state rilevate inclusioni di C. pneumoniae negli OEC all’interno dello strato di fibre nervose/strato glomerulare.
Un altro batterio, Burkholderia pseudomallei, si è accumulato anche all’interno dello strato di fibre nervose/strato glomerulare dopo l’inoculazione intranasale, suggerendo che la glia limitans agisca per limitare l’ulteriore progressione dei batteri nelle regioni più profonde.
Tuttavia, con C. pneumoniae mentre potremmo facilmente rilevare i corpi di inclusione, i corpi elementari infettivi molto più piccoli sarebbero probabilmente mancati nelle nostre analisi delle sezioni di tessuto; quindi è possibile che i corpi elementari fossero presenti più in profondità nel bulbo olfattivo.
Poiché i corpi di inclusione sono stati rilevati nella corteccia piriforme olfattiva, suggerisce che C. pneumoniae sia progredito più in profondità nel bulbo olfattivo come precedentemente riportato 15,16,18,50.
È stato dimostrato che la lesione all’epitelio nasale aumenta l’infezione del nervo olfattivo e del bulbo da parte di B. pseudomallei27 e consente all’ingresso di S. aureus, che normalmente non invade i nervi cranici, di entrare nel bulbo olfattivo28. Abbiamo quindi ipotizzato che la lesione epiteliale possa portare a un aumento dell’invasione di C. pneumoniae dei nervi olfattivi/trigeminali, del bulbo olfattivo e delle restanti parti del cervello.
Abbiamo scoperto che la lesione epiteliale ha provocato un aumento del carico di C. pneumoniae nella mucosa olfattiva (che contiene i fascicoli del nervo olfattivo), nel bulbo olfattivo e nel nervo trigemino. Al contrario, la lesione non ha alterato l’invasione del cervello da parte di C. pneumoniae dopo 7 giorni.
In precedenza abbiamo osservato un risultato simile per B. pseudomallei in alcuni topi, in cui l’infezione nasale di per sé ha causato una massiccia infezione periferica e distruzione dell’epitelio nasale (più pronunciata rispetto al nostro modello di lesione epiteliale utilizzato nel presente studio).
In questi topi, l’invasione del SNC da parte di B. pseudomallei era trascurabile20. Abbiamo quindi ipotizzato che ciò potesse essere dovuto al fatto che la glia nel nervo olfattivo e negli strati esterni del bulbo rispondeva sia alla lesione che ai batteri, secernendo grandi quantità di fattori pro-infiammatori che limitavano l’infezione del SNC; questo potrebbe anche essere il caso dell’infezione da C. pneumoniae nel presente studio.
La capacità di infettare la glia è considerata fondamentale per l’invasione del SNC attraverso i percorsi dei nervi cranici20,27,28,34,35. Abbiamo qui mostrato che C. pneumoniae potrebbe infettare, sopravvivere e replicarsi (inclusioni di forma) all’interno della glia dal PNS (OEC e TgSC) e dal SNC (astrociti e microglia).
Questa è la prima infezione di OEC e TgSC (o altre cellule di Schwann) da parte di C. pneumoniae, tuttavia, abbiamo recentemente dimostrato che C. muridarum può infettare OEC e TgSC 24. Mentre l’infezione da C. pneumoniae di colture primarie astrociti e microglia non sono stati descritti, è stata dimostrata l’infezione di linee cellulari di astrociti e microglia 62,63,64,65,66. Più rilevantemente, tuttavia, gli antigeni di C. pneumoniae sono stati rilevati sia all’interno degli astrociti che nella microglia nei cervelli umani post mortem9,11,67,68.
OEC, cellule di Schwann e astrociti sono tutte cellule immunitarie innate che possono rispondere e fagocitare batteri, e le microglia (i macrofagi del SNC) sono fagociti professionali ben caratterizzati31,69,70. Il fatto che C. pneumoniae possa formare inclusioni in queste cellule suggerisce che i batteri, almeno in una certa misura, possono superare la distruzione dei fagociti; questo può essere un meccanismo importante attraverso il quale questo batterio può invadere e stabilire un’infezione a lungo termine del SNC.
Abbiamo anche rilevato una deposizione localizzata di Aβ adiacente a C. pneumoniae IBs e nel bulbo olfattivo dopo 7 giorni e 28 giorni dopo l’inoculazione. L’immunoreattività Aβ diffusa / diffusa era presente anche in questi tessuti di topi di controllo, tuttavia, la co-localizzazione dei depositi di Aβ e delle inclusioni di C. pneumoniae nei topi inoculati era chiara e distinta.
Uno studio ha riportato che mentre non c’erano necessariamente più depositi di Aβ nella corteccia di animali infettati da C. pneumoniae, i depositi di Aβ negli animali infetti erano morfologicamente diversi da quelli negli animali di controllo18. Un precedente studio a lungo termine ha mostrato che l’infezione da C. pneumoniae della corteccia cerebrale ha preceduto il picco di deposizione di Aβ17. In combinazione con i risultati dell’attuale studio, sembra che la secrezione di Aβ avvenga in risposta all’infezione.
Uno dei motivi potrebbe essere che l’Aβ viene secreto come agente antimicrobico12 ma in alternativa può essere secreto in risposta all’infezione a causa dell’attivazione del percorso per la trasformazione della proteina APP in Aβ che viene poi secreta; il lavoro futuro può chiarire la secrezione e il ruolo di Aβ in questo contesto.
La secrezione di Aβ può quindi essere una normale risposta immunitaria a qualsiasi microbo che possa invadere il sistema nervoso e, se l’infezione scompare, l’Aβ depositato può essere eliminato dalla glia fagocitica71. Tuttavia, è possibile che se i batteri non vengono eliminati e invece diventano persistenti o latenti nelle cellule neurali, si possa verificare una continua deposizione di Aβ, contribuendo alla demenza a esordio tardivo e/o accelerando la deposizione di Aβ nell’Alzheimer familiare 7.
Nel caso di C. pneumoniae, uno studio su topi wild-type ha dimostrato che i depositi di Aβ risultanti dall’infezione sono stati successivamente eliminati17, mentre un altro studio ha mostrato che i depositi non sono scomparsi nell’arco di diversi mesi16.
È interessante notare che abbiamo osservato depositi di Aβ nel nervo olfattivo prima che nel bulbo, poiché uno studio su un modello murino di malattia di Alzheimer (topi APP/PS1) ha mostrato che l’estremità terminale del nervo olfattivo all’interno dell’epitelio olfattivo nasale è la prima area del sistema nervoso per mostrare una deposizione di Aβ, che poi progredisce verso il bulbo olfattivo e altre aree del SNC 72.
Poiché i topi in quello studio sono stati tenuti in una struttura di detenzione standard per animali (non esente da patogeni specifici), forse l’esposizione ad agenti infettivi potrebbe aver contribuito a questa deposizione periferica precoce di Aβ (che probabilmente sarebbe molto più pronunciata in un modello di malattia di Alzheimer rispetto ai topi selvatici).
L’infezione da Chlamydia pneumoniae ha anche determinato una sovraregolazione dei percorsi chiave coinvolti nella patogenesi della malattia di Alzheimer. Le caratteristiche patologiche della malattia di Alzheimer come la microglia attivata, la produzione di mediatori infiammatori e le specie reattive dell’ossigeno (ROS) erano altamente regolate nel tessuto cerebrale infetto a 28 giorni dopo l’inoculazione rispetto a 7 giorni dopo l’inoculazione.
Queste risposte neuroinfiammatorie sono considerate un importante fattore trainante nei pazienti con neurodegenerazione e patologia del morbo di Alzheimer, che inizia precocemente nel corso della malattia, prima della formazione di placche Aβ nel cervello 73.
Studi precedenti hanno dimostrato che la microglia e gli astrociti agiscono come cellule ospiti di C. pneumoniae nel cervello del morbo di Alzheimer9. È stato dimostrato che in seguito all’infezione, la microglia attivata e gli astrociti secernono citochine pro-infiammatorie, tra cui IL-1β, TNFα e IL-6 che sono neurotossiche e possono aumentare direttamente la produzione di Aβ tramite l’attivazione della β-secretasi (BACE)66,74. BACE scinde la proteina precursore dell’amiloide e avvia la cascata amiloide.
L’attivazione della microglia riduce l’accumulo di Aβ nel cervello aumentandone la fagocitosi, la clearance e la degradazione75. Tuttavia, la neuroinfiammazione associata al morbo di Alzheimer potrebbe essere un’arma a doppio taglio perché l’attivazione persistente della microglia stimolata dal legame della microglia all’Aβ può aumentare la produzione di mediatori infiammatori e specie reattive dell’ossigeno (ROS), che amplifica ulteriormente la risposta neuroinfiammatoria causando malattie croniche infiammazione e neurodegenerazione76.
Il disturbo della funzione del reticolo endoplasmatico (ER) sta emergendo come un fattore rilevante che guida la neurodegenerazione nella malattia di Alzheimer 77. Diversi rapporti hanno descritto manifestazioni di stress da ER in campioni di cervello post mortem di pazienti con malattia di Alzheimer 78.
Il ripiegamento proteico nel reticolo endoplasmatico (ER) è una funzione cellulare essenziale e per salvaguardare la produzione proteica e garantire il controllo di qualità, lo stress ER innesca l’attivazione di diverse vie biochimiche denominate collettivamente risposta proteica spiegata (UPR).
L’infezione da Chlamydia può indurre stress cellulare che influisce sul ripiegamento delle proteine, inducendo così l’attivazione dell’UPR, tuttavia si propone anche di modulare l’UPR per promuoverne la sopravvivenza e la replicazione 79. È interessante notare che abbiamo riscontrato che il percorso dell’UPR è sovraregolato nei tessuti corticali infetti a 28 giorni dopo inoculazione rispetto a 7 giorni dopo l’inoculazione. I patogeni intracellulari come la Chlamydia trarrebbero beneficio dall’UPR poiché l’aumento della capacità di ripiegamento e l’attivazione della biosintesi dei lipidi possono sostenere la replicazione batterica.
Tuttavia, se lo stress ER dovuto all’infezione è sostenuto e la proteina mal ripiegata non può essere ripiegata o degradata, le cellule possono anche aumentare direttamente la produzione di Aβ e la neuroinfiammazione associata80. Al contrario, è stato anche proposto che gli oligomeri Aβ causino disfunzioni ER che portano a neurotossicità mediata da UPR e morte delle cellule neuronali77.
Abbiamo anche osservato tendenze simili nel nostro studio in cui i percorsi molecolari correlati alla morte cellulare come l’autofagia e l’apoptosi erano sovraregolati nei tessuti corticali a 28 giorni dall’inoculazione.
Oltre a considerare i percorsi chiave, è anche utile considerare i cambiamenti nell’espressione genica individuale. L’infezione a lungo termine da C. pneumoniae (giorno 28) ha innescato una down-regulation della maggior parte degli altri geni chiave coinvolti nella patogenesi dell’AD. Soprattutto c’era una downregulation della proteina chiave protettiva da shock termico (Hspa1b o Hsp70-2), associata a un aumento dello stress ossidativo e all’inizio della patologia AD81.
Inoltre, Bag2, un gene co-chaperone associato a Bcl-2 che controlla la funzionalità di Hsp70 è stato anche sottoregolato portando a un ulteriore fallimento del sistema per proteggere le cellule dal danno ossidativo 82. L’infezione a lungo termine ha anche depresso il sistema di ubiquitinazione del proteasoma 26S mediante la downregulation di Psmd8 83 e Psmc6 84 che portano alla persistenza degli aggregati proteici indotti dallo stress. A livello subcellulare, l’infezione ha portato a una disfunzione mitocondriale evidente dalla downregulation di Ndufa5 (una subunità strutturale del complesso I)85 e Atp5j2 86.
Tuttavia, tutte queste modulazioni geniche hanno portato a una maggiore risposta proteica dispiegata, stress ossidativo e hanno avuto una maggiore associazione di malattie, come evidente dalla mappa del calore dei processi biologici. In effetti, l’infezione a lungo termine era anche associata a una bassa espressione di Cd2ap che era stata precedentemente associata a patologia AD aggravata da un aumento della deposizione di neurotossicità indotta da Aβ e Tau 87.
Contrariamente ai geni sottoregolati, l’infezione a lungo termine è stata anche associata ad alcuni meccanismi di riparazione, limitando la diffusione di un’ulteriore neuroinfiammazione. Ha portato a una maggiore espressione di Cdk18 che è una chinasi ciclina-dipendente e di solito funziona per eliminare i danni al DNA 88.
Pertanto, i meccanismi che inducono la modifica, la trascrizione e lo splicing della cromatina erano altamente ridotti in essi. Tra le proteine da shock termico, abbiamo riscontrato che Hspa4 è sovraregolato, il che ha assicurato che mantenesse la proprietà disaggregante di tutte le proteine mal ripiegate, prevenendo così ulteriori danni e inducendo l’integrità dei tessuti 89. Inoltre, ha anche aiutato nel mantenimento del gene della sulfatasi (Sumf2), che è associati alla modulazione dell’omeostasi tissutale90.
È interessante notare che l’infezione a lungo termine ha anche indotto espressioni di Ezr91 e Cldn592 che sono associate rispettivamente al mantenimento della struttura del citoscheletro di actina, della sinapsi e delle giunzioni strette. Ciò ha assicurato che l’infezione a lungo termine inducesse una maggiore organizzazione del citoscheletro neuronale e/o della struttura dendritica, pur mantenendo la trasmissione sinaptica e la ricaptazione.
Inoltre, un’ulteriore protezione è stata fornita dall’aumento dell’attività Axl, un gene fagocitotico (autofagia) importante nel mantenimento dei livelli omeostatici della principale lipoproteina correlata all’AD, ApoE93. L’infezione a lungo termine ha anche indotto il gene Mbp, che ha mantenuto la mielinizzazione e prevenuto un’ulteriore neuroinfiammazione 94.
Al contrario, la sovraregolazione di Flt1, un gene chiave nella regolazione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), era una caratteristica chiave nell’infezione a lungo termine che poteva riflettere un deterioramento cognitivo dovuto a una maggiore deposizione di Aβ e Tau nell’eziopatogenesi dell’AD, come osservato in uno studio precedente 95 Come risultato dell’aumento della segnalazione del fattore di crescita, l’angiogenesi è stata indotta con una maggiore attività trofica che dimostra un’attività infiammatoria in corso.
