Più di 600.000 persone in tutto il mondo sono state finora vittime della malattia polmonare COVID-19, che è causata dalla SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2).
Al fine di ottenere una terapia efficace per COVID-19 il più rapidamente possibile, i farmaci che vengono utilizzati per il trattamento di altre malattie vengono attualmente riproposti per il trattamento COVID-19.
L’Unità di biologia dell’infezione del German Primate Center (DPZ) – Leibniz Institute for Primate Research di Göttingen, insieme ai colleghi dello Charité di Berlino, è stata in grado di dimostrare che la clorochina di droga della malaria, che ha dimostrato di inibire la SARS-CoV -2 infezione delle cellule renali di scimmia verde africana, non è in grado di prevenire l’infezione delle cellule polmonari umane con il nuovo coronavirus.
È pertanto improbabile che la clorochina prevenga la diffusione del virus nei polmoni e non dovrebbe essere utilizzata per il trattamento di COVID-19.
È noto che SARS-CoV-2 è in grado di utilizzare due percorsi diversi per accedere alle celle. Innanzitutto, dopo essersi attaccato alle cellule, il virus può fondersi direttamente con la membrana plasmatica e introdurre il suo materiale genetico nella cellula ospite.
In secondo luogo, può entrare all’interno delle cellule dopo l’assorbimento tramite strutture di trasporto, chiamate endosomi. In entrambi i casi, l’attaccamento del virus alle cellule e l’ingresso successivo è mediato dalla proteina virale.
A tal fine, la proteina spike deve essere attivata dall’enzima cathepsin L (negli endosomi) o dall’enzima TMPRSS2 (sulla superficie cellulare).
A seconda del tipo di cellula, entrambi gli enzimi o solo uno di essi possono essere disponibili per l’attivazione.
La clorochina è un farmaco utilizzato per il trattamento della malaria. Poiché la clorochina inibisce l’infezione delle cellule renali di scimmia con SARS-CoV-2, la clorochina è stata testata in studi clinici come possibile candidato per il trattamento di COVID-19.
Tuttavia, non era chiaro come la clorochina inibisca l’infezione delle cellule renali delle scimmie. L’attuale studio mostra che la clorochina inibisce l’ingresso virale in queste cellule, molto probabilmente bloccando l’attività della catepsina L.
Ciò ha sollevato la questione se la clorochina inibisca anche l’infezione delle cellule polmonari che sono note per produrre TMPRSS2 ma solo una piccola quantità di cathepsin L.
Lo studio mostra che la clorochina non impedisce l’ingresso di SARS-CoV-2 nelle cellule polmonari umane e la successiva diffusione del virus in queste cellule.
“In questo studio, mostriamo che l’attività antivirale della clorochina è specifica del tipo di cellula e che la clorochina non blocca l’infezione delle cellule polmonari.
Ciò significa che nei futuri test di potenziali farmaci COVID-19, si dovrebbe fare attenzione a utilizzare le linee cellulari pertinenti per le indagini al fine di non perdere tempo e risorse inutili nella nostra ricerca di efficaci terapie COVID-19 “, afferma Stefan Pöhlmann, capo dell’unità di biologia delle infezioni presso DPZ, aggiungendo: “COVID-19 è principalmente causato dall’infezione delle cellule polmonari, per questo motivo queste cellule dovrebbero avere la priorità nei test di efficacia”.
La pandemia COVID-19, causata dal nuovo coronavirus SARS-CoV-2, è stata associata a oltre 600.000 casi fatali in tutto il mondo.
Al fine di sviluppare rapidamente interventi antivirali, i farmaci usati per il trattamento di malattie non correlate vengono attualmente riproposti per combattere il COVID-19.
La clorochina è un farmaco anti-malaria che viene frequentemente impiegato per il trattamento con COVID-19 poiché inibisce la diffusione della SARS-CoV-2 nella linea cellulare derivata dai reni Vero1–3.
Qui, mostriamo che l’espressione ingegnerizzata di TMPRSS2, una proteasi cellulare che attiva SARS-CoV-2 per l’ingresso nelle cellule polmonari4, rende l’infezione SARS-CoV-2 delle cellule Vero insensibile alla clorochina.
Inoltre, segnaliamo che la clorochina non blocca l’infezione da SARS-CoV-2 della linea di cellule polmonari positive a TMPRSS2 Calu-3.
Questi risultati indicano che la clorochina ha come bersaglio una via per l’attivazione virale che non è operativa nelle cellule polmonari ed è improbabile che protegga dalla diffusione della SARS-CoV-2 tra e tra i pazienti.
La clorochina e l’idrossiclorochina sono utilizzate per il trattamento della malaria e sono state ampiamente utilizzate per il trattamento di pazienti COVID-19, con
più di 80 studi clinici registrati in tutto il mondo2,3.
La clorochina e l’idrossiclorochina inibiscono l’infezione da SARS-CoV-2 delle cellule Vero 1,5,6, fornendo un razionale utilizzo di questi farmaci per il trattamento COVID-19. Tuttavia, non è noto se questi farmaci inibiscano l’infezione delle cellule polmonari ed è poco compreso il modo in cui inibiscono l’infezione da SARS-CoV-2.
La clorochina e l’idrossiclorochina elevano il pH endosomiale e inibiscono i virus che dipendono dal basso pH per l’ingresso delle cellule7.
Abbiamo chiesto se bloccano anche l’ingresso delle cellule SARS-CoV-2 e se l’inibizione dell’ingresso rappresenta il blocco dell’infezione da SARS-CoV-2. Inoltre, abbiamo studiato se l’inibizione dell’entrata dipende dal tipo di cellula, poiché il virus può impiegare percorsi dipendenti dal pH e indipendenti dal pH per l’ingresso nelle cellule.
Pertanto, la proteina di picco SARS-CoV-2 (SARS-2-S), che media l’ingresso virale, viene attivata dalla cateina proteasi cisteina L pH (catL) endosomica in determinate linee cellulari4.
Al contrario, l’ingresso nelle cellule epiteliali delle vie aeree, che esprimono bassi livelli di CatL8, dipende dalla proteasi serina TMPRSS24 residente a membrana plasmatica, indipendente dal pH. È importante sottolineare che l’uso di CatL da parte dei coronavirus è limitato alle linee cellulari 8-10 mentre l’attività di TMPRSS2 è essenziale per la diffusione virale e la patogenesi nell’ospite infetto11,12.
Abbiamo confrontato l’inibizione della clorochina e dell’idrossiclorochina mediata dell’entrata mediata da SARS-2-S nelle cellule Vero (rene), Vero-TMPRSS2 e Calu-3 (polmone). Le cellule Calu-3, come l’epitelio delle vie aeree, esprimono basse quantità di CatL8 e l’ingresso SARS-CoV-2 in queste cellule dipende da TMPRSS24.
Al contrario, l’ingresso delle celle Vero di SARS-CoV-2 dipende da CatL mentre sia CatL che TMPRSS2 supportano l’ingresso nelle celle Vero-TMPRSS24.
Come controllo, abbiamo usato camostat mesilato, che inibisce l’ingresso4 dipendente da TMPRSS2.
Il trattamento con mesostatato di Camostat non ha interferito con la vitalità cellulare mentre la clorochina e l’idrossiclorochina hanno ridotto leggermente la vitalità quando applicato alla massima concentrazione (Fig. 1a).
L’inibizione dell’ingresso guidato da SARS-2-S da parte del camostat mesilato è stata osservata solo con le linee cellulari TMPRSS2 +, come previsto (Fig. 1a, Tabella 1).
Inoltre, la clorochina e l’idrossiclorochina inibivano l’ingresso guidato dalle SARS-2-S nelle cellule Vero (TMPRSS2-) con alta efficienza mentre l’inibizione dell’entrata nelle cellule Calu-3 e Vero-TMPRSS2 (entrambe le TMPRSS2 +) era inefficiente o assente, rispettivamente (Fig. 1a, tabella 1).
Pertanto, la clorochina e l’idrossiclorochina possono bloccare l’ingresso guidato dalla SARS-2-S, ma l’inibizione dipende dalla linea cellulare e non si osserva un’inibizione efficiente con le cellule polmonari TMPRSS2 +.
Successivamente abbiamo studiato se le differenze dipendenti dal tipo di cellula nell’inibizione dell’entrata si traducessero in inibizione differenziale di autentico
SARS-CoV-2. In effetti, la clorochina ha bloccato efficacemente l’infezione SARS-CoV-2 delle cellule renali Vero, come previsto1, ma non è riuscita a inibire efficacemente l’infezione SARS-CoV-2 delle cellule polmonari Calu-3 (Fig. 1b, c).
Una leggera riduzione dell’infezione da SARS-CoV-2 è stata osservata in presenza di clorochina di 100 μM, in linea con la modesta inibizione dell’ingresso dello pseudotipo in tali condizioni (Fig. 1a), ma questo effetto non era statisticamente significativo.
Riassumendo, la clorochina non è riuscita a bloccare efficacemente l’infezione cellulare Calu-3 con pseudotipi recanti SARS-2-S e autentico SARS-CoV-2, indicando che in queste cellule la clorochina non interferisce in modo sensibile con l’ingresso virale o i successivi passaggi del virus ciclo di replica.
È in corso la conferma dei nostri risultati con l’epitelio respiratorio primario. Inoltre, notiamo che la produzione di virus in Calu-3 rispetto alle cellule Vero E6 è stata più robusta nel presente studio rispetto a quella pubblicata13, potenzialmente a causa dell’uso del subclone Calu-3 2B4 nel precedente ma non nel presente studio.
Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che la clorochina e l’idrossiclorochina non eserciteranno alcuna attività antivirale nel tessuto polmonare umano e non saranno efficaci contro COVID-19, in linea con i risultati dei recenti studi clinici14,15.
Inoltre, evidenziano che le linee cellulari che imitano aspetti importanti delle cellule epiteliali respiratorie dovrebbero essere utilizzate durante l’analisi dell’attività antivirale dei farmaci che agiscono sulle funzioni delle cellule ospiti.
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More information: Markus Hoffmann et al. Chloroquine does not inhibit infection of human lung cells with SARS-CoV-2, Nature (2020). DOI: 10.1038/s41586-020-2575-3
