Un nuovo trattamento può eliminare i batteri superficiali utilizzando la luce blu e il carvacrolo

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Un nuovo trattamento per eliminare i batteri superficiali utilizzando la luce blu e il carvacrolo, un fenolo derivato da oli commestibili, crea una reazione fotossica specifica dei batteri che non contribuisce alla resistenza agli antibiotici.

La tecnica, sviluppata dai ricercatori della Harvard Medical School e della Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, è descritta in Science Translational Medicine.

Gli antibiotici orali e topici sono stati ampiamente utilizzati dagli anni ’40, quando hanno salvato la vita e gli arti di migliaia di soldati e civili feriti nella seconda guerra mondiale. È difficile sopravvalutare quante vite sono state salvate o migliorate attraverso la farmacologia antibiotica, ma l’efficacia di molti trattamenti di standby sta ora rapidamente diminuendo poiché i batteri mutano per resistere ai nostri trattamenti comuni.

“I batteri multiresistenti (MDR) sono diventati una delle maggiori minacce per la sanità pubblica del nostro tempo e stiamo rapidamente esaurendo le opzioni di trattamento perché sono disponibili sempre meno antibiotici per trattare queste infezioni. Le infezioni sono associate a un’elevata mortalità, che porta a circa 35.000 decessi ogni anno solo negli Stati Uniti “, afferma il dottor Mei X. Wu, professore associato presso la Harvard Medical School e autore corrispondente della ricerca.

Ma la perdita di vite umane non è l’unico fattore che contribuisce ai danni causati dalla resistenza antibatterica . “Un costo stimato della resistenza agli antibiotici è superiore a 55 miliardi di dollari all’anno quando la perdita di produttività è inclusa nella stima”, aggiunge il dottor Wu.

Sebbene siano in fase di sviluppo diversi metodi per il trattamento delle infezioni interne, questo trattamento in due fasi è perfettamente adatto per un trattamento facile ed efficace delle infezioni della ferita superficiale. Il dottor Wu descrive il processo: “Combiniamo il carvacrolo, un ingrediente degli oli commestibili, con la luce blu per uccidere in modo sicuro e rapido più patogeni batterici MDR rapidamente senza incorrere in alcuna resistenza. … Questa modalità può essere un’alternativa per i pazienti, in particolare i pazienti diabetici con infezioni della ferita della pelle che non possono essere trattate efficacemente con antibiotici. ” Tali ferite sono difficili da trattare e causano un notevole disagio e infezioni secondarie.

Il carvacrolo è un composto fenolico a lungo utilizzato come conservante nella produzione alimentare; è derivato da oli essenziali di timo e origano, si trova naturalmente in molte piante commestibili ed è sicuro per uso topico e interno.

La terapia prevede il trattamento di una ferita superficiale con carvacrolo e quindi l’applicazione della luce blu per creare una reazione fototossica specifica per i batteri. Il trattamento “può essere usato comodamente a casa poiché il carvacrolo è commestibile e la luce blu è stata utilizzata in modo sicuro nelle cliniche per il trattamento dell’acne e dell’ittero neonatale”, spiega il dottor Wu.

Lo studio si è concentrato su Acinetobacter baumannii e Staphylococcus aureus resistente alla meticillina, due batteri patogeni prevalenti che sono notoriamente difficili da trattare con metodi attualmente approvati. Inoltre, i topi infettati dal letale Pseudomonas aeruginosa sono stati salvati utilizzando la nuova strategia.

Dalla ricerca: “Studi meccanicistici hanno rivelato che il carvacrolo è stato fotocataliticamente ossidato in una serie di substrati fotoreattivi che sono stati sottoposti a fotolisi o reazioni di fotosensibilizzazione aggiuntive in risposta alla stessa luce blu, formando due cicli di autoossidazione che hanno interagito tra loro determinando una robusta generazione di reattivi citotossici specie di ossigeno. “

Con una sola applicazione, i ricercatori hanno scoperto che l’eradicazione sostanziale o completa dei batteri del biofilm con poche o nessuna reazione avversa nel paziente. Dopo 20 applicazioni ripetute, i ricercatori non hanno riscontrato alcuna resistenza antibatterica. Né il carvacrolo né la luce blu da soli hanno prodotto risultati comparabili.

“È necessario uno studio con un animale di grandi dimensioni come i suini per verificare l’efficacia prima dello studio clinico”, spiega il dott. Wu, al fine di ottenere l’approvazione della FDA. Se il trattamento viene ritenuto efficace, sarà relativamente a basso costo e abbastanza facile da somministrarsi autonomamente a casa.


L’infezione della ferita della pelle è un problema diffuso nelle strutture sanitarie sia civili che militari. Le ferite della pelle sono particolarmente inclini alle infezioni batteriche perché le ferite forniscono un mezzo ideale per la proliferazione batterica e una porta di ingresso nel flusso sanguigno e sono l’esposizione diretta all’ambiente “sporco”.

Le infezioni possono essere prontamente trattate con una varietà di antibiotici se i batteri coinvolti sono sensibili. Tuttavia, ci sono solo opzioni di trattamento estremamente limitate o inesistenti quando i ceppi resistenti agli antibiotici sono coinvolti nelle infezioni della ferita, il che si verifica a una velocità preoccupante.

Se l’infezione della ferita non può essere eliminata tempestivamente, l’infezione altererebbe il metabolismo cellulare e indurrebbe un’infiammazione persistente sistemica che può predisporre i pazienti a varie complicazioni e sepsi potenzialmente letali (Fitzwater et al., 2003; Wang et al., 2018 ).

Ad esempio, focolai di infezioni da ustioni causate da organismi multiresistenti (MDR) sono emersi come un grave problema all’inizio delle operazioni militari in Iraq, nonostante l’esercito degli Stati Uniti abbia fornito cure rapide ed altamente efficaci ai soldati feriti (Scott et al. , 2007; Vento et al., 2013).

Le infezioni cutanee causate da batteri MDR sono infatti la causa più comune di morbilità e mortalità nei pazienti infettati da microbi MDR e rappresentano quasi il 61% dei decessi di questa popolazione infetta (Gomez et al., 2009).

Gli usi estesi di antibiotici ad ampio spettro sono il singolo fattore più importante nell’evoluzione della resistenza batterica (Hampton, 2013). Numerosi studi hanno dimostrato che i ceppi di batteri MDR più frequentemente identificati nelle infezioni nosocomiali e sul campo di battaglia sono i batteri Gram-negativi Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa e il batterio Gram-positivo Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA) (Scott et al ., 2007; Calhoun et al., 2008; Li et al., 2014; Levin-Reisman et al., 2017).

Inoltre, i biofilm batterici formati dai batteri MDR sono i principali ostacoli nel trattamento delle ferite da ustione (Bloemsma et al., 2008; Jiang et al., 2017). I batteri all’interno del biofilm possono essere fino a 1.000 volte più resistenti agli antibiotici e sono responsabili di infezioni ricorrenti resistenti agli antibiotici in altre parti del corpo dopo la diffusione dal sito del biofilm (Ceri et al., 1999; Caraher et al., 2007) .

Attualmente, gli unici trattamenti efficaci disponibili per combattere queste infezioni sono farmaci più vecchi come la colistina, che sono altamente tossici e dannosi per la salute generale dei pazienti (Crane et al., 2009). È urgente sviluppare approcci non antibiotici per combattere i microbi MDR.

Gli oli essenziali (EO) sono una miscela di costituenti volatili prodotti da piante aromatiche / erbe. Esistono circa 3.000 EO ben riconosciuti, di cui 300 sono generalmente riconosciuti come sicuri (GRAS) per l’uomo dalla Food and Drug Administration (FDA statunitense) degli Stati Uniti e hanno ampie applicazioni nella conservazione degli alimenti, additivi e favori, profumi, cosmetici. industrie, soluzioni orali antisettiche, dentifrici, detergenti e deodoranti per ambienti da secoli (Pandey et al., 2017; Sakkas e Papadopoulou, 2017).

Questi prodotti naturali sono di particolare interesse come agenti antimicrobici “verdi” a causa del loro basso costo, biocompatibilità, potenziali proprietà antibiofilm e amichevoli per le cellule eucariote e l’ambiente (Burt, 2004; Nostro et al., 2007; Kavanaugh e Ribbeck, 2012 ).

Tra questi EO sicuri, l’olio di origano ha dimostrato di avere una varietà di attività come antiossidante (Yan et al., 2016), anti-infiammatorio (Ocana-Fuentes et al., 2010; Shen et al., 2010), anti -fungino (Akgul e Kivanc, 1988; Soylu et al., 2007) e antiallergico (Benito et al., 1996). Il suo effetto antimicrobico è stato dimostrato in colture cellulari in vitro, studi sui sistemi alimentari (Lopez-Reyes et al., 2010; Soylu et al., 2010; Munhuweyi et al., 2017) e infezioni sistemiche in vivo (Manohar et al., 2001; Preuss et al., 2005).

Nel presente studio, indaghiamo l’efficacia dell’olio di origano nell’inattivazione dei batteri MDR isolati da vittime di combattimento in vitro e ceppi bioluminescenti di P. aeruginosa (PA01) e MRSA (USA300) nelle ferite da ustione di topo. Il nostro studio ha dimostrato che l’olio di origano ha inattivato efficacemente vari batteri patogeni e i loro biofilm indipendentemente dalla loro suscettibilità agli antibiotici. Lo studio è il primo tentativo in vivo sull’uso dell’olio di origano per il trattamento delle ferite da ustione infette da batteri MDR clinicamente importanti.

TEM e SEM hanno illustrato i danni ultrastrutturali dei batteri

La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato danni ultrastrutturali delle cellule A. baumannii AF0005 (Figura Figura2B2B) e P. aeruginosa IQ0042 (Figura Figura2D2D) dopo l’esposizione all’olio di origano per 1 ora a 0,16 mg / ml e 0,56 mg / ml, rispettivamente.

I danni alla parete cellulare e alla membrana erano evidenti nelle cellule di A. baumannii AF0005 e P. aeruginosa IQ0042 con una grave fuoriuscita di sostanze intracellulari con conseguente restringimento della membrana cellulare e separazione dalla parete cellulare (Figure 2B, D, frecce). Inoltre, sono stati osservati vacuoli citoplasmatici in A. baumannii AF0005 (Figura Figura2B2B, asterisco) e molte vescicole inossidabili in P. aeruginosa IQ0042 (Figura Figura2D2D, asterisco).

L’interruzione strutturale intracellulare come la dissociazione tra la parete cellulare e la membrana è stata osservata anche in A. baumannii AF0005 (Figura Figura 2B2B, ovale). In confronto, le cellule di A. baumannii AF0005 (Figura Figura2A2A) e P. aeruginosa IQ0042 (Figura2C2C) non trattate avevano una parete cellulare e una membrana intatte e chiare e un citoplasma denso e omogeneo.

Tuttavia, non abbiamo trovato differenze significative nell’ultrastruttura tra il controllo e l’MRSA USA300 trattato con olio di origano da TEM (dati non mostrati), il che probabilmente suggerisce diverse risposte di MRSA da A. baumannii o P. aeruginosa. Come per i biofilm, è stato osservato un biofilm batterico denso e spesso sulla superficie della dentina, composto da numerosi strati di cocchi densamente concentrati nei biofilm di P. aeruginosa IQ0042 (Figura Figura2E2E) e MRSA IQ0064 (Figura Figura2G2G) di 24 ore.

I biofilm di P. aeruginosa IQ0042 (Figura Figura2E2E) e MRSA IQ0064 (Figura Figura2G2G) sono stati trattati con olio di origano a 1 mg / ml e 0,4 mg / ml per 1 ora, rispettivamente. Le cellule si sono staccate nella matrice polimerica extracellulare, i batteri morti sono stati facilmente visti ovunque e i biofilm sono stati completamente distrutti nei campioni trattati con olio di origano (Figure 2F, H, frecce). C’erano solo pochi batteri che crescevano scarsamente sulla superficie della dentina a causa della morte cellulare intensiva (Figure 2F, H).

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FIGURA 2
Immagini TEM rappresentative di cellule planctoniche (A – D) e immagini SEM di biofilm batterici (E – H) con (B, D, E, F) o senza (A, C, E, G) trattamento con olio di origano per 1 h. L’olio di origano è stato utilizzato a 0,16 mg / ml per le cellule A. baumannii AF0005, 0,56 mg / ml per le cellule P. aeruginosa IQ0042, 1,0 mg / ml per i biofilm di P. aeruginosa IQ0042 e 0,4 mg / ml per il biofilm MRSA IQ0064. (A, B) cellule A. baumannii AF0005; (C, D) cellule di P. aeruginosa IQ0042; (E, F) biofilm di P. aeruginosa IQ0042; e (G, H) biofilm MRSA IQ0064. Vengono mostrati i danni alla parete cellulare e alla membrana (B, D; frecce); dissociazione tra parete cellulare e membrana (B; ovale), vacuoli citoplasmatici e bolle (B, D; asterisco) e collasso cellulare (F, H, frecce). Il numero di batteri è stato drasticamente ridotto dopo il trattamento con olio di origano in (F, H) rispetto ai controlli non trattati (E, G).

Discussione

Nella ricerca di microbicidi non antibiotici, abbiamo esaminato dozzine di EO da piante aromatiche / spezie indigene cinesi perché gli EO sono stati a lungo riconosciuti come uno dei prodotti naturali più promettenti per microbicidi sicuri nelle medicine popolari (Lu et al., 2013a, b, c). La selezione era inizialmente basata sulle loro applicazioni antisettiche nell’industria alimentare e in agricoltura dopo un’ampia ricerca nel database.

Tra le dozzine di EO testate, circa un terzo ha mostrato attività antibatteriche significative contro microbi importanti dal punto di vista clinico e agricolo (Lu et al., 2013a, b, c). L’olio di origano si è distinto come uno dei migliori in termini di sicurezza ed efficacia. Abbiamo quindi dettagliato l’attività battericida dell’olio di origano contro 11 isolati clinici MDR di P. aeruginosa, A. baumannii e MRSA, nonché due ceppi bioluminescenti di P. aeruginosa PA01 e MRSA USA300 nello studio corrente.

L’olio di origano ha effettivamente ucciso tutti i ceppi batterici testati, con MIC comprese tra 0,08 e 0,64 mg / ml e con un ordine di sensibilità di A. baumannii> MRSA> P. aeruginosa (Tabella Tabella 11). La scoperta è in accordo con studi precedenti che dimostrano che l’olio di origano e il suo componente principale carvacrolo avevano una MIC più alta contro P. aeruginosa rispetto ad altre specie, come S. spp. (Nostro et al., 2007), Chromobacterium violaceum, Salmonella typhimurium e S. aureus (Burt et al., 2014). Simile agli isolati clinici, l’olio di origano ha anche inattivato i ceppi standard di A. baumannii ATCC 19606 (Rosato et al., 2010), P. aeruginosa ATCC 27853 e S. aureus ATCC 29213 (Bouhdid et al., 2009), con le MIC 0,15 mg / ml, 1 mg / ml e 0,33 mg / ml, rispettivamente, che sono paragonabili alla nostra indagine.

Studi precedenti suggerivano che i batteri Gram-negativi sembravano essere più resistenti dei batteri Gram-positivi in ​​risposta all’EO (Tepe et al., 2005; Longaray Delamare et al., 2007; Gilles et al., 2010). Questa resistenza relativa dei batteri Gram-negativi rispetto a quelli Gram-positivi può essere attribuita alla loro struttura della parete cellulare e alla disposizione della membrana esterna. La membrana esterna dei batteri Gram-negativi è ricca di molecole lipopolisaccaridiche, relativamente impermeabili ai composti lipofili, presentando così una barriera alla penetrazione delle sostanze antimicrobiche EO (Gao et al., 2011).

Può anche essere associato agli enzimi nello spazio periplasmatico, che sono in grado di abbattere le sostanze antimicrobiche al loro ingresso nelle cellule (Nikaido, 1996). Tuttavia, i nostri studi non erano d’accordo con queste osservazioni e hanno scoperto che A. baumannii Gram-negativo era più sensibile all’olio di origano rispetto all’MRSA Gram-positivo.

Questo diverso risultato suggerisce che l’attività antibatterica dell’olio di origano potrebbe non dipendere dal tipo di reazione di Gram a differenza di altri EO, una possibilità supportata dagli studi di Gao et al. (2011). Nei loro studi, i batteri Gram-negativi Klebsiella pneumoniae erano i batteri più sensibili mentre i batteri Gram-positivi Listeria monocytogenes erano il ceppo più resistente al seme di Sphallerocarpus gracilis EO (Gao et al., 2011).

La possibilità che la parete cellulare e la membrana fossero obiettivi primari dell’olio di origano è stata supportata dall’imaging TEM dell’ultrastruttura dei batteri. Abbiamo trovato danni alla parete cellulare e alle membrane, che si verificano con vacuoli citoplasmatici, vescicole inossidabili e interruzione e interruzione delle strutture intracellulari in un gran numero di cellule batteriche dopo il trattamento con olio di origano (Figure 2B, E).

Questo risultato è coerente con un’associazione dell’attività antibatterica dell’olio di origano / carvacrolo con il disturbo delle proteine ​​incorporate nella membrana e la rottura dei lipidi, la sintesi dell’RNA, l’attività dell’ATPasi e la pompa di efflusso precedentemente dimostrata (Simoes et al., 2009; Tapia-Rodriguez et al. al., 2017). Inoltre, l’olio di origano può causare uno squilibrio nella pressione osmotica intracellulare a causa di una fuoriuscita di contenuto citoplasmatico a seguito di danni alla parete cellulare e alla membrana e alla formazione di vacuoli citoplasmatici, che alla fine inducono necrosi cellulare, sebbene siano necessarie ulteriori indagini per concludere il meccanismo in dettaglio.

I biofilm sono organizzazioni sessili di cellule batteriche con una forte aderenza alle superfici. Le cellule microbiche associate al biofilm sono ben protette da una matrice extracellulare che comprende esopolisaccaridi, proteine ​​e DNA ed è scarsamente permeabile (Donlan, 2002; Husain et al., 2015).

Gli antibiotici sistemici somministrati per trattare le infezioni batteriche spesso falliscono almeno in parte a causa della scarsa permeabilità dei biofilm. È interessante notare che l’olio di origano era in grado di uccidere il biofilm almeno in una fase iniziale (biofilm di 24 ore) con la stessa efficienza delle cellule planctoniche. I biofilm di A. baumannii, P. aeruginosa e MRSA sono stati eliminati dall’olio di origano a una concentrazione di 0,3, 1,0 o 0,4 mg / ml, rispettivamente, simile alle MIC corrispondenti ottenute nelle cellule planctoniche.

La somiglianza può essere estesa all’ordine di sensibilità con i biofilm di P. aeruginosa più resistenti dei biofilm di MRSA rispetto ai biofilm di A. baumannii (Figura Figura 11 e Tabella Tabella 11). Ciò può essere attribuito alla permeabilità e alla solubilità lipidica superiori dell’olio di origano alla membrana e alla parete delle cellule batteriche (Magi et al., 2015; Khan et al., 2017). Allo stesso modo, l’efficacia dell’olio di origano per inattivare i biofilm di S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa è stata trovata anche a MIC simili a quelle contro le cellule planctoniche (Nostro et al., 2007; dos Santos Rodrigues et al., 2017; Tapia-Rodriguez et al., 2017).

Le osservazioni SEM hanno confermato il danno fisico e la considerevole alterazione morfologica nei biofilm di P. aeruginosa IQ0042 (Figure 2E, F) e MRSA IQ0064 (Figure 2G, H) a seguito del trattamento con olio di origano. Queste osservazioni sollevano un’interessante possibilità che l’EO possa avere vantaggi rispetto agli antibiotici idrosolubili nel trattamento dei biofilm perché i batteri che vivono nei biofilm sono ben noti per essere più resistenti agli antibiotici (fino a 1.000 volte) rispetto alle loro controparti planctoniche, in parte a causa della scarsa permeabilità dei biofilm agli antibiotici (Ceri et al., 1999; Caraher et al., 2007).

Una preoccupazione dell’utilizzo dell’olio di origano come alternativa per il trattamento delle infezioni nelle cliniche sarà se i batteri MDR possono sviluppare resistenza all’olio di origano. Sebbene questo rimanga in gran parte non affrontato fino ad oggi, i nostri risultati suggeriscono che la resistenza potrebbe non essere sviluppata prontamente perché 20 passaggi in presenza di concentrazioni subletali di olio di origano non hanno alterato la loro suscettibilità all’olio (Figura Figura 3A3A).

Inoltre, l’olio di origano è stato utilizzato per secoli nella prevenzione alimentare e in altre applicazioni antisettiche e finora non è stata segnalata alcuna resistenza. Si ritiene comunemente che gli EO agiscano in più siti all’interno delle cellule batteriche (membrana cellulare, parete cellulare, proteine ​​strutturali, enzimi, acidi nucleici, lipidi insaturi, ecc.) E sarebbe meno probabile che inducano lo sviluppo di resistenza (Burt, 2004; Simoes et al., 2009; Tapia-Rodriguez et al., 2017). Al contrario, la MIC degli antibiotici convenzionali potrebbe aumentare gradualmente con una durata del trattamento a causa della loro singola azione di inattivare i batteri (Baym et al., 2016; Levin-Reisman et al., 2017).

L’attività battericida dell’olio di origano è stata confermata in modelli di ustione di topo utilizzando ceppi bioluminescenti modello di P. aeruginosa PA01 Gram-negativi e MRSA USA300 Gram-positivi. Quando applicato 24 ore dopo l’inoculazione batterica che forma biofilm in fase iniziale, l’olio di origano ha ridotto efficacemente la carica batterica di 25 volte per PA01 e 49 volte per USA300, rispettivamente, rispetto alle ferite non trattate. Pur disattivando efficacemente i batteri, l’olio di origano non ha mostrato citotossicità o genotossicità per la pelle, in buon accordo con la sua lunga storia di sicurezza. Inoltre, l’olio di origano non ha influenzato negativamente i cheratinociti umani (Babili et al., 2011) ed era sicuro se somministrato per via orale nei topi (Manohar et al., 2001; Preuss et al., 2005; Feng et al., 2017).

In sintesi, abbiamo riportato qui l’efficacia dell’olio di origano contro un pannello di batteri MDR isolati dalla lotta alle vittime e dimostrato per la prima volta l’efficacia dell’olio di origano per il trattamento delle infezioni da ustioni nei topi. Lo studio rappresenta uno sforzo iniziale nella ricerca di una nuova opzione terapeutica per le infezioni delle ferite, in particolare quelle causate dai batteri MDR.

link di riferimento: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6182053/


Ulteriori informazioni:  Min Lu et al. Reazioni fototossiche specifiche dei batteri innescate dalla luce blu e dal carvacrolo fitochimico,  Science Translational Medicine  (2021). DOI: 10.1126 / scitranslmed.aba3571

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