Nuova risposta al motivo per cui alcuni pazienti continuano a risultare positivi dopo il recupero da COVID-19

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Nei primi mesi della pandemia COVID-19, gli operatori sanitari che analizzavano i risultati dei test iniziarono a notare qualcosa di strano: i pazienti che si erano già ripresi da COVID-19 a volte risultavano inspiegabilmente positivi a un test PCR settimane o addirittura mesi dopo.

Sebbene le persone possano contrarre COVID-19 per la seconda volta, questo non sembra essere il caso di questi pazienti; nessun virus vivo è stato isolato dai loro campioni e alcuni studi hanno trovato questi risultati falsi positivi anche mentre si tenevano i partecipanti in quarantena.

Inoltre, gli RNA hanno generalmente una vita breve – la maggior parte rimane solo per pochi minuti – quindi era improbabile che i test positivi fossero il risultato di RNA residui.

Ora, un nuovo documento del laboratorio del membro del Whitehead Institute e professore di biologia del MIT Rudolf Jaenisch potrebbe offrire una risposta al motivo per cui alcuni pazienti continuano a risultare positivi dopo il recupero da COVID-19. Nel documento, pubblicato online il 6 maggio negli Atti della National Academy of Sciences, Jaenisch e collaboratori mostrano che le sequenze genetiche del virus RNA SARS-CoV-2 possono integrarsi nel genoma della cellula ospite attraverso un processo chiamato trascrizione inversa.

Queste sezioni del genoma possono quindi essere “lette” negli RNA, che potrebbero essere potenzialmente rilevati da un test PCR.

SARS-CoV-2 non è l’unico virus che si integra nel genoma umano. Circa l’8% del nostro DNA è costituito da resti di virus antichi. Alcuni virus, chiamati retrovirus, si basano sull’integrazione nel DNA umano per replicarsi.

“SARS-CoV-2 non è un retrovirus, il che significa che non necessita di trascrizione inversa per la sua replicazione”, afferma Liguo Zhang, postdoc del Whitehead Institute e primo autore. “Tuttavia, sequenze di virus RNA non retrovirali sono state rilevate nei genomi di molte specie di vertebrati, inclusi gli esseri umani”.

Con questo in mente, Zhang e Jaenisch hanno iniziato a progettare esperimenti per verificare se questa integrazione virale potesse avvenire con il nuovo coronavirus. Con l’aiuto del postdoc Alexsia Richards del laboratorio Jaenisch, i ricercatori hanno infettato le cellule umane con il coronavirus in laboratorio e quindi hanno sequenziato il DNA dalle cellule infette due giorni dopo per vedere se conteneva tracce del materiale genetico del virus.

Per garantire che i loro risultati potessero essere confermati con una metodologia diversa, hanno utilizzato tre diverse tecniche di sequenziamento del DNA. In tutti i campioni, hanno trovato frammenti di materiale genetico virale (anche se i ricercatori sottolineano che nessuno dei frammenti inseriti era sufficiente per ricreare un virus vivo).

Zhang, Jaenisch e colleghi hanno quindi esaminato il DNA che fiancheggiava le piccole sequenze virali alla ricerca di indizi sul meccanismo con cui erano arrivati. In queste sequenze circostanti, i ricercatori hanno trovato il segno distintivo di una caratteristica genetica chiamata retrotrasposone.

A volte chiamati “geni che saltano”, i trasposoni sono sezioni di DNA che possono spostarsi da una regione del genoma a un’altra. Sono spesso attivati ​​per “saltare” in condizioni di forte stress o durante il cancro o l’invecchiamento e sono potenti agenti di cambiamento genetico.

Un trasposone comune nel genoma umano è chiamato retrotrasposone LINE1, che è costituito da una potente combinazione di macchinari per il taglio del DNA e trascrittasi inversa, un enzima che crea molecole di DNA da un modello di RNA (come l’RNA di SARS-CoV-2 ).

“C’è un’impronta molto chiara per l’integrazione LINE1”, afferma Jaenisch. “Alla giunzione della sequenza virale con il DNA cellulare, crea una duplicazione di 20 coppie di basi.”

Oltre alla duplicazione, un’altra caratteristica come prova dell’integrazione mediata da LINE1 è una sequenza di riconoscimento dell’endonucleasi LINE1. I ricercatori hanno identificato queste caratteristiche in quasi il 70% dei DNA che contenevano sequenze virali, ma non tutti, suggerendo che l’RNA virale potrebbe integrarsi nel DNA cellulare tramite meccanismi multipli.

Per eseguire lo screening per l’integrazione virale al di fuori del laboratorio, i ricercatori hanno analizzato set di dati pubblicati di trascritti di RNA da diversi tipi di campioni, inclusi campioni di pazienti COVID-19. Con questi set di dati, Zhang e Jaenisch sono stati in grado di calcolare la frazione di geni trascritti nelle cellule di questi pazienti che contenevano sequenze virali che potevano essere derivate da copie virali integrate.

La percentuale variava da campione a campione, ma per alcuni una frazione relativamente grande di trascritti virali sembra essere stata trascritta da materiale genetico virale integrato nel genoma.

Una precedente bozza del documento con questa scoperta è stata pubblicata online sul server di prestampa bioRxiv. Tuttavia, una recente ricerca ha rivelato che almeno alcune delle letture virale-cellulari potrebbero essere il prodotto di artefatti fuorvianti del metodo di sequenziamento dell’RNA. Nel presente documento, i ricercatori sono stati in grado di eliminare questi artefatti che avrebbero potuto oscurare i risultati.

Invece di semplicemente contare le trascrizioni che contenevano materiale virale, i ricercatori hanno esaminato in quale direzione erano state lette le trascrizioni. Se le letture virali fossero il risultato di virus vivi o di RNA virali esistenti nella cellula, i ricercatori si aspetterebbero che la maggior parte delle trascrizioni virali sarebbe stata letta con l’orientamento corretto per le sequenze in questione; nelle cellule acutamente infettate in coltura, oltre il 99% ha l’orientamento corretto.

Se le trascrizioni fossero il prodotto dell’integrazione virale casuale nel genoma, tuttavia, ci sarebbe una divisione di circa 50-50: metà delle trascrizioni sarebbe stata letta in avanti, l’altra metà all’indietro, rispetto ai geni ospiti.

“Questo è ciò che abbiamo visto in alcuni campioni di pazienti”, afferma Zhang. “Ciò suggerisce che gran parte dell’RNA virale in alcuni campioni potrebbe essere trascritto da sequenze integrate”.

Poiché il set di dati utilizzato era piuttosto piccolo, Jaenisch sottolinea che sono necessarie maggiori informazioni per stabilire esattamente quanto sia comune questo fenomeno nella vita reale e cosa potrebbe significare per la salute umana.

È possibile che solo pochissime cellule umane sperimentino un qualsiasi tipo di integrazione virale.

Nel caso di un altro virus a RNA che si integra nel genoma della cellula ospite, solo una frazione della percentuale di cellule infette (tra .001 e .01) conteneva DNA virale integrato.

Per SARS-CoV-2, la frequenza di integrazione nell’uomo è ancora sconosciuta. “La frazione di cellule che si integrano con potrebbe essere molto piccola”, afferma Jaenisch. “Ma anche se è raro, ci sono più di 140 milioni di persone che sono già state infettate, giusto?”

In futuro, Jaenisch e Zhang hanno in programma di indagare se i frammenti di materiale genetico SARS-CoV-2 potrebbero essere trasformati in proteine ​​dalla cellula. “Se lo fanno e innescano risposte immunitarie, potrebbe fornire una protezione continua contro il virus”, dice Zhang.

Sperano anche di indagare se queste sezioni integrate di DNA potrebbero essere in parte responsabili di alcune delle conseguenze autoimmuni a lungo termine che alcuni pazienti COVID-19 sperimentano. “A questo punto, possiamo solo speculare”, dice Jaenisch. “Ma una cosa che pensiamo di poter spiegare è perché alcuni pazienti sono positivi alla PCR a lungo termine”.


I coronavirus emergenti spesso si diffondono rapidamente da persona a persona e sembra esserci un aumento dell’epidemia globale di malattie correlate. MERS-CoV e SARS-CoV sono due rari ceppi di coronavirus identificati che causano non solo una grave infezione polmonare ma anche gravi complicazioni (Ksiazek et al., 2003; Rota et al., 2003; Zaki et al., 2012; Arabi et al. , 2017).

Più recentemente, la malattia del coronavirus denominata COVID-19 causata da un nuovo coronavirus SARS-CoV-2 si sta espandendo a livello globale e rapidamente, provocando problemi di salute emergenti (Chan et al., 2020; Guan et al., 2020; Huang et al., 2020; Zhou et al., 2020). Sebbene i recettori cellulari e le vie di infezione di questi coronavirus siano stati identificati (Li et al., 2003; Raj et al., 2013; Zhou et al., 2020; Wrapp et al., 2020), l’impatto complicato sulle cellule umane è tutt’altro che chiaro.

Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi mobili del DNA in quasi tutti gli eucarioti e comprendono oltre il 40% del genoma umano (Dewannieux et al., 2003). Possono auto-replicarsi e inserirsi in varie posizioni all’interno del genoma. La disregolazione della TE può portare a varie malattie come le malattie infiammatorie (Saleh et al., 2019).

L’unico membro attivo in TE è il retrotrasposone che può “copiare e incollare” se stesso attraverso l’RNA intermedio. Esempi di retrotrasposoni includono elementi nucleari interspersed lunghi (LINE), elementi nucleari interspersed brevi (SINE) e ripetizioni terminali lunghe (LTR).

L’espressione della maggior parte dei membri del retrotrasposone è soppressa nelle cellule somatiche e sono attivi solo nel cervello, nelle cellule germinali, negli embrioni precoci e in condizioni patologiche (Munoz-Lopez et al., 2016). Circa il 5% dei neonati mostra un nuovo evento di integrazione del retrotrasposone (Cordaux et al., 2006).

La sovraregolazione anomala dei retrotrasposoni causa inserzioni, delezioni e inversioni nel genoma (Gilbert et al., 2002; Symer et al., 2002), con conseguente stabilità genetica compromessa e persino morte cellulare (Malki et al., 2014; Newkirk et al. , 2017). Le prove accumulate negli ultimi anni hanno anche dimostrato la loro importanza nell’orchestrazione dell’espressione genica (Izsvak et al., 2016), nella regolazione della struttura della cromatina (Fadloun et al., 2013) e nella modulazione del programma di sviluppo (Percharde et al., 2018; Lu et al. al., 2020).

I LINE sono retrotrasposoni autonomi comuni e comprendono circa il 17% del genoma umano (Cordaux e Batzer, 2009). Alcuni elementi LINE-1 possono essere trascritti e tradotti nelle celle. Dopo la trascrizione inversa dell’RNA LINE-1, possono essere reintegrati nel genoma (Babushok et al., 2006). 

Naturalmente, l’espressione di LINE è repressa nella maggior parte dei tipi di cellule. Il suo RNA è ereditabile principalmente durante l’embriogenesi precoce a causa del suo arricchimento e dell’elevata attività di retrotrasposizione negli embrioni precoci (Grow et al., 2015).

Modello di topo transgenico che trasporta il reporter di retrotrasposizione LINE-1 di topo / umano ha dimostrato che questa attività crea un mosaicismo somatico durante lo sviluppo (Kano et al., 2009). Oltre alle LINE, anche le SINE e le LTR sono retrotrasposoni arricchiti nel genoma umano e la mobilizzazione dei SINE si basa sulle proteine ​​codificate in LINE-1 (Dewannieux et al., 2003).

Nel nostro studio, abbiamo analizzato i dati del trascrittoma disponibili pubblicamente di cellule umane infettate da coronavirus MERS-CoV, SARS-CoV e SARS-CoV-2 e abbiamo osservato una maggiore espressione di TE tra cui diversi retrotrasposoni, nonché infiammazione, immunità e apoptosi geni correlati. 

Abbiamo inoltre notato una potenziale fusione di SARS-CoV-2 RNA con trascritti di retrotrasposoni, in particolare LINE e SINE. Pertanto, ulteriori esami sul genoma e sul trascrittoma delle cellule dei pazienti e lo studio di modelli saranno preziosi per valutare il potenziale crosstalk tra coronavirus e retrotrasposoni.

link di riferimento: https: //www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2021.609160/full


Ulteriori informazioni: Liguo Zhang et al. L’RNA di SARS-CoV-2 trascritto inverso può integrarsi nel genoma di cellule umane coltivate e può essere espresso in tessuti derivati ​​dal paziente, Atti della National Academy of Sciences (2021). DOI: 10.1073 / pnas.2105968118

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