I vaccini COVID-19 provocano alterazioni fisiopatologiche simili a un’infezione reale

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La rivista peer review: Cell Discovery by Nature ha pubblicato uno studio i cui allarmanti risultati mostrano che gli attuali colpi di COVID-19 stanno causando alterazioni fisiopatologiche simili a un’effettiva infezione da SARS-CoV-2.

https://www.nature.com/articles/s41421-021-00329-3

A seguito di infezioni da SARS-CoV-2, molte persone hanno sviluppato vari gradi di sindromi respiratorie e alcune con condizioni gastrointestinali. È stato riportato che i disturbi della coagulazione del sangue, problemi vascolari, squilibri elettrolitici, disturbi renali, disturbi metabolici, ecc. Erano complicazioni cliniche importanti con COVID-19 16,17.

Il modo in cui la vaccinazione imiterebbe un’infezione non è stato completamente valutato. In questo studio, abbiamo arruolato volontari sani che dovevano essere vaccinati con un vaccino SARS-CoV-2 inattivato (Vero Cell)3, per partecipare a test di anticorpi e anticorpi neutralizzanti, nonché misurazioni cliniche dettagliate di laboratorio prima e in tempi diversi dopo vaccinazione (sono stati applicati regimi a due dosi con schemi leggermente diversi).

Sorprendentemente, le risposte dell’interferone di tipo I, che erano state collegate a danni ridotti dopo l’infezione da SARS-CoV-2 e sintomi più lievi, sembravano essere ridotte dopo la vaccinazione, almeno entro 28 giorni dopo la prima inoculazione.

Ciò potrebbe suggerire che a breve termine (1 mese) dopo la vaccinazione, il sistema immunitario di una persona si trovi in ​​uno stato non privilegiato e potrebbe richiedere maggiore protezione.

Alterazioni nelle misurazioni cliniche di laboratorio dopo la vaccinazione

Sono stati misurati i test clinici di routine di laboratorio, inclusi gli indici correlati alle infezioni, i parametri ematologici, la funzione della coagulazione, la glicemia, i lipidi sierici, gli enzimi correlati alla funzione cardiaca, gli elettroliti, i biomarcatori correlati alla funzionalità epatica e renale, per rivelare le caratteristiche di sicurezza del vaccino (Fig. 2a e Tabelle Supplementari S4 e S5). La conta dei globuli bianchi era significativamente, ma solo leggermente, aumentata dopo la vaccinazione il giorno 7.

Non sono state rilevate differenze nei seguenti punti temporali (Fig. 2b). Con nostra sorpresa, sono stati osservati aumenti abbastanza consistenti dei livelli di HbA1c in volontari sani, indipendentemente dal fatto che appartenessero alla coorte A o B. Entro il giorno 28 dopo la prima inoculazione, tre individui su 11 hanno raggiunto l’intervallo prediabetico (Fig. 2c). Entro i giorni 42 e 90, i livelli medi di HbA1c sembravano tornare, ma erano ancora significativamente più alti di quelli prima della vaccinazione.

Il lavoro precedente ha dimostrato che i pazienti diabetici con livelli di glucosio nel sangue non controllati sono più inclini a sviluppare forme gravi di COVID-1919. È stato dimostrato che livelli elevati di glucosio nel sangue/glicolisi promuovono la replicazione di SARS-CoV-2 nei monociti umani attraverso la produzione di specie reattive dell’ossigeno mitocondriale e l’attivazione di HIF1A20, presentando quindi una caratteristica svantaggiosa.

Fig. 2: Cambiamenti temporali delle misurazioni cliniche di laboratorio dopo la vaccinazione.

Fig. 2
a  I test clinici di routine di laboratorio includono parametri ematologici e della coagulazione, indici correlati alla glicemia e alle infezioni, profilo lipidico, enzimi cardiaci, elettroliti, biomarcatori correlati alla funzionalità epatica e renale. Maggiori informazioni possono essere trovate nelle Tabelle Supplementari S4 e S5. Valori dei test di laboratorio di conta leucocitaria ( b ), HbA1c ( c ), potassio ( d , pannello di sinistra), sodio ( d , pannello di destra), APTT ( e , pannello di sinistra), PT ( e , pannello di destra), totale colesterolo ( f ), acido biliare totale ( g ), eGFR ( h , pannello di sinistra), creatinina ( h, pannello di destra). I punti dati rappresentano i valori di ogni individuo. I box plot mostravano il 25°, 50° (mediana) e 75° percentile. Le linee tratteggiate orizzontali mostravano i limiti normali superiori (rossi) in  b ,  c ,  d  (riquadri di sinistra),  e  (riquadro di sinistra),  f ,  he  i limiti normali inferiori (blu) in  d  (riquadro di sinistra) e  h . I  valori P  sono stati calcolati dal test del rango dei segni di Wilcoxon confrontando le misurazioni di laboratorio in ogni momento con le misurazioni di base. * P  ≤ 0,05, ** P  ≤ 0,01, *** P  ≤ 0,001.

I livelli sierici di potassio sono diminuiti significativamente entro i giorni 28, 42 e 90 dopo la prima inoculazione, con un campione al di sotto del limite normale inferiore al giorno 42 (Fig. 2d, pannello di sinistra). Allo stesso modo, anche i livelli sierici di sodio sono diminuiti dopo la vaccinazione (Fig. 2d, pannello di destra), indicativi delle influenze del vaccino sull’equilibrio elettrolitico. Anche in questo caso, lo squilibrio elettrolitico è stato collegato al COVID-1921.

La coagulopatia è un’altra condizione clinica indotta da COVID-1922. Abbiamo scoperto che i profili di coagulazione cambiavano significativamente dopo la vaccinazione, a breve termine (7 giorni) dopo la prima inoculazione, i profili di coagulazione tendevano a un tempo di protrombina (PT) più breve, mentre l’effetto a lungo termine (28 e 42 giorni) era verso tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT) e prolungamento del PT (Fig. 2e).

Entro il giorno 90, i profili sono tornati a quelli prima della vaccinazione (Fig. 2e). Inoltre, abbiamo riscontrato livelli elevati di colesterolo nel sangue ai giorni 7, 28 dopo la prima inoculazione e livelli elevati di acidi biliari totali sono stati rilevati anche al giorno 7 (Fig. 2f, g). La disfunzione renale è un’altra condizione clinica legata al COVID-19 e, a 28, 42 e 90 giorni dopo la prima inoculazione, i livelli di creatinina sierica erano significativamente più alti di quelli prima della vaccinazione, con conseguente riduzione dell’eGFR (Fig. 2h).

La maggior parte di queste caratteristiche cliniche è stata segnalata per essere associata allo sviluppo di sintomi gravi nei pazienti con COVID-19 (Tabella Supplementare S6). Nel complesso, non ci sono state differenze statisticamente significative tra le coorti A e B, ad eccezione solo di alcuni indici (Tabella Supplementare S7), pertanto i dati di due coorti sono stati raggruppati per la presentazione dei dati clinici e le successive analisi.

scRNA-seq ha rivelato alterazioni drammatiche nell’espressione genica di quasi tutte le cellule immunitarie dopo la vaccinazione

Per esplorare le caratteristiche immunologiche di volontari sani dopo la vaccinazione, abbiamo eseguito scRNA-seq basato su goccioline (10 × Genomica) per studiare i profili trascrittomici delle PBMC da volontari appartenenti alla coorte A o B, prima e 28 giorni dopo la vaccinazione (Fig. 3a e la figura supplementare S1a).

Dopo la preelaborazione e l’eliminazione delle cellule di bassa qualità (vedi “Materiali e metodi”), abbiamo ottenuto 188.886 cellule da tutti i campioni PBMC, di cui 86.685 cellule provenivano dalla coorte A e 102.201 cellule dalla coorte B. Tutte le cellule qualificate sono state integrate nel set di dati unificato e sottoposto ad analisi a valle.

Fig. 3: Cambiamenti nel tipo di cellula immunitaria periferica e nella composizione del sottotipo, nonché nell’espressione genica prima e 28 giorni dopo la prima inoculazione.

figura 3
una  rappresentazione UMAP di tipo cellulare di tutti i campioni uniti. In totale, 22 tipi cellulari sono stati identificati da firme di espressione genica specifiche del tipo di cellula. In totale, sono state raffigurate 188.886 celle. b Grafico a  punti per geni signature specifici del tipo di cellula. La scala dei colori indicava i livelli di espressione e la dimensione in punti rappresentava la percentuale di cellule per cluster/sottotipo che esprimevano il gene corrispondente. c  Rappresentazione UMAP che rappresenta le cellule prima (blu) e dopo la vaccinazione (arancione). d  Heatmap di correlazione tra campioni pseudo-bulk. e Percentuali di sottotipi di cellule immunitarie specifiche nei PBMC totali di ciascun individuo prima e dopo la vaccinazione. Il box plot rappresentava la distribuzione del campione. Le caselle blu rappresentavano i campioni prima e l’arancione dopo la vaccinazione. I valori di P  erano basati sul test di Wilcoxon per il confronto tra i gruppi prima e dopo la vaccinazione. f  I box plot hanno mostrato cambiamenti prima e dopo la vaccinazione nel contenuto di monociti dai dati scRNA-seq (pannello a sinistra) e dalle misure cliniche di laboratorio (pannello a destra). g I  box plot hanno mostrato cambiamenti nel contenuto dei linfociti T CD4 + , CD8 +  così come nel contenuto dei linfociti (T + B + NK) prima e dopo la vaccinazione dai dati scRNA-seq (riquadri 3 a sinistra) e dai test di laboratorio (pannello a destra). h DEG identificati da campioni pseudo-bulk prima e dopo la vaccinazione. i  Analisi di sovrarappresentazione dei set di geni HALLMARK da MSigDB che dimostrano diverse caratteristiche immunologiche prima e dopo la vaccinazione.

Utilizzando il raggruppamento basato su grafici di approssimazione e proiezione del collettore uniforme (UMAP)23, algoritmo Single-cell Recognition of cell types (SingleR)24 e annotazione manuale basata su marcatori genici canonici, abbiamo identificato 22 tipi o sottotipi cellulari ed eseguito analisi di espressione differenziale tra tutti i tipi di cellule (Fig. 3b e Tabella Supplementare S8). Le cellule (trascrittomi cellulari) dei campioni prima (blu) e dopo (arancione) della vaccinazione erano nettamente separate nella rappresentazione UMAP per entrambe le coorti, il che significava che le caratteristiche immunologiche erano cambiate abbastanza drasticamente in quasi tutti i tipi di cellule immunitarie rilevate e in modo coerente in tutti i volontari ( Fig. 3c).

Tra le 11 coppie (prima e dopo) di campioni PBMC, 10 coppie sono state sequenziate insieme e una coppia è stata sequenziata separatamente in un lotto diverso. Le distribuzioni UMAP erano drasticamente simili indipendentemente dai diversi lotti, suggerendo effetti minimi del batch di sequenziamento (Figura complementare S1b).

Due lotti indipendenti di sequenziamento hanno rivelato cambiamenti simili prima e dopo la vaccinazione, suggerendo che i cambiamenti sono reali, mentre l’utilizzo del metodo di correzione dell’effetto batch (Harmony25) (Figura complementare S1c-e) comporterebbe un filtraggio eccessivo e l’eliminazione dei cambiamenti reali causati da vaccinazione.

Inoltre, il raggruppamento dei campioni basato sul coefficiente di correlazione di Pearson dei trascrittomi indicava che i campioni delle due coorti (A e B) si mescolavano bene tra loro sia prima che dopo la vaccinazione, mentre i cambiamenti indotti dalla vaccinazione potevano essere chiaramente osservati (Fig. 3d) . Pertanto, per aumentare la potenza statistica, abbiamo combinato le due coorti per le analisi successive.

Per rivelare le differenze nelle composizioni dei tipi cellulari prima e dopo la vaccinazione, abbiamo calcolato le percentuali relative di tutti i tipi cellulari nelle PBMC di ciascun individuo sulla base dei dati scRNA-seq (Fig. 3e). Abbiamo osservato una diminuzione del contenuto di cellule T regolatorie CD4+ (CD4.Treg), cellule T CD8+ (CD8.T) e cellule CD8+ proliferanti (CD8.Tprolif) dopo la vaccinazione (Fig. 3e).

Anche le diminuzioni del contenuto delle cellule γδ-T (gd.T.Vd2) erano significative (Fig. 3e). Al contrario, la vaccinazione ha aumentato il contenuto di monociti classici CD14+ (Mono.C) (Fig. 3e), coerentemente con le misurazioni cliniche di laboratorio (Fig. 3f). Il contenuto complessivo dei linfociti, che includeva tutte le cellule T CD4+, tutte le cellule T CD8+, le cellule B e le cellule NK, non è cambiato in modo significativo prima e dopo la vaccinazione, il che è stato confermato anche da misurazioni cliniche di laboratorio (Fig. 3g).

Abbiamo raccolto un set di dati pubblicato da 196 pazienti e controlli con infezione da COVID-197 e abbiamo analizzato i nostri dati insieme a quel set di dati. Il risultato ha indicato che anche i cambiamenti indotti dalla vaccinazione nel contenuto cellulare di tutti e cinque i diversi sottotipi di cellule immunitarie sono cambiati nelle stesse direzioni nei pazienti con COVID-19 rispetto ai controlli, ad eccezione delle cellule T CD8+ in proliferazione (Figura complementare S2).

Per studiare i cambiamenti dettagliati dell’espressione genica indotti dalla vaccinazione, abbiamo unito i singoli campioni in campioni pseudo-bulk e abbiamo utilizzato il test del campione accoppiato per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) (Fig. 3h e Tabella Supplementare S9). Geni significativamente sovraregolati sono stati coinvolti nella “segnalazione del TNFα tramite NF-κB”, “risposte infiammatorie” e “interazione del recettore delle citochine-citochine”, “segnalazione IL6-JAK STAT3”, “coagulazione”, “ipossia”, che erano stati segnalati per COVID-19, mentre i percorsi relativi al ciclo cellulare erano sottoregolati (Fig. 3i). Questi risultati hanno supportato l’idea che la vaccinazione imitasse un’infezione6,7,8,9,10,11,12.

I cambiamenti dell’espressione genica specifici del sottotipo di cellule immunitarie in primo piano rispecchiavano le alterazioni cliniche del laboratorio
Prima della delucidazione dell’eterogeneità funzionale e dei cambiamenti di espressione genica specifici del tipo di cellula tra i campioni prima e dopo la vaccinazione, abbiamo raggruppato le cellule in 11 tipi principali: (1) cellule T CD4+ allo stato ingenuo, (2) T CD8+ allo stato ingenuo cellule, (3) cellule T helper CD4+ (inclusi CD4.T, CD4.Treg e CD4.Tprolif), (4) cellule T citotossiche CD8+ (inclusi CD8.T, CD8B.T e CD8.Tprolif), (5 ) MAIT, (6) cellule γδ-T, (7) cellule NK (compresi NK, NK proliferativi), (8) cellule B/plasmablasti (compresi cellule B e plasmablasti), (9) monociti/cellule dendritiche (compresi monociti classici , mono intermedio, mono non classico, mieloide DC1, mieloide DC2 e plasmacitoide DC), (10) cellule T effettrici terminali CD4+ e (11) cellule T effettrici terminali CD8+.

Dopo undici principali categorizzazioni del tipo di cellula, abbiamo eseguito confronti a livello di campione aggregando l’espressione genica tra i principali tipi cellulari all’interno di ciascun donatore e quindi eseguito l’analisi dell’espressione differenziale utilizzando muscat26. Abbiamo identificato i geni espressi in modo differenziato (DEG) tra tutti i principali tipi di cellule (Fig. 4a e Tabella Supplementare S10) e condotto l’analisi funzionale del gene (Fig. 4b). Facendo eco ai risultati delle misurazioni cliniche, geni correlati a “omeostasi del colesterolo”, “coagulazione” e “risposta infiammatoria” (CXCL8, CD14, IL6 e TNFRSF1B), “Segnalazione del TNFa tramite NF-κB” (NFKB1, NFKB2, NFKBIE, TNFAIP3 , e TNFSF9) e “ipossia” (HIF1A) sono stati sovraregolati.

Inoltre, anche i geni correlati alla “segnalazione TGFβ”, alla “segnalazione IL2-STAT5” (IFNGR1, MAPKAPK2 e CASP3) e alla “segnalazione IL6-JAK-STAT3” sono stati sovraregolati (Fig. 4c). Per visualizzare quali tipi di cellule sono stati arricchiti per quelle firme, abbiamo eseguito il punteggio del modulo genico e visualizzato i punteggi sulle coordinate UMAP e sui box plot raggruppati (Fig. 4c e Tabella Supplementare S11).

È interessante notare che i geni della “risposta infiammatoria” erano altamente espressi nei monociti e dopo la vaccinazione aumentavano ulteriormente (Fig. 4c), suggerendo che i monociti erano uno dei principali tipi cellulari che partecipavano alle risposte infiammatorie dopo la vaccinazione. Al contrario, i geni correlati alla “glicolisi”, al “metabolismo degli acidi biliari” e alla “risposta dell’interferone di tipo I (IFN-α/β)” sono stati sottoregolati, coerentemente con i nostri dati clinici e la fisiopatologia di COVID-1913 (Fig. 4d) .

Fig. 4: Analisi dell’espressione genica differenziale specifica del sottotipo e dell’insieme di geni che illustrano i cambiamenti dell’espressione genica comuni tra i diversi tipi di cellule immunitarie dopo la vaccinazione.

figura 4
11 principali DEG specifici del tipo di  cellula immunitaria identificati da dati pseudo-bulk prodotti da combinazioni di campioni prima e dopo la vaccinazione. Sono stati inclusi geni con logFC > 0,5 e aggiustare  P  <0,05. b  L’analisi della sovrarappresentazione dei set di geni HALLMARK da MSigDB tra gli 11 principali tipi di cellule ha dimostrato cambiamenti comuni nei set di geni che rappresentano stati immunologici alterati prima e dopo la vaccinazione. c ,  d  Visualizzazione UMAP colorata da punteggi di espressione medi (livelli) basati sul percorso di arricchimento differenziale. Box plot raffigurante la distribuzione del punteggio di espressione prima e dopo la vaccinazione.

Risposte infiammatorie indotte dalla vaccinazione nei monociti

Rapporti recenti hanno descritto le firme della risposta immunitaria dell’ospite conservate alle infezioni virali respiratorie, vale a dire la Meta-Virus Signature (MVS), che è conservata anche nell’infezione da SARS-CoV-232,33. Punteggi MVS più elevati sono associati all’infezione32,33. In tutto, 380 (158 con contributo positivo e 222 con contributo negativo ai punteggi MVS) su 396 (161 con contributo positivo e 235 con contributo negativo) selezionati per la misurazione MVS sono stati rilevati nel nostro set di dati.

Per studiare le risposte immunitarie dell’ospite dopo la vaccinazione con SARS-CoV-2 inattivato, abbiamo separato i set di geni positivi e negativi e calcolato i punteggi MVS (Fig. 6a). I punteggi MVS erano sostanzialmente più alti dopo la vaccinazione (Fig. 6b, c), suggerendo che la vaccinazione imitava un’infezione. È interessante notare che il set genico MVS positivo era prevalentemente espresso nei monociti, mentre il set negativo nei linfociti, indicando che dopo la vaccinazione si sarebbero verificate diverse risposte immunitarie specifiche del tipo cellulare (Figura complementare S3a, b).

Fig. 6: I monociti hanno mostrato punteggi MVS elevati e percorsi correlati al punteggio MVS.

figura 6
una  visualizzazione UMAP colorata dai punteggi MVS. b  I punteggi MVS in campioni pseudo-bulk che combinano tutti i tipi cellulari hanno mostrato una sovraregolazione dopo la vaccinazione. c  Box plot raffiguranti la distribuzione del punteggio tra gli 11 principali tipi di cellule immunitarie prima e dopo la vaccinazione. d  Heatmap di correlazione tra punteggi MVS e percorsi arricchiti di geni differenzialmente espressi prima e dopo la vaccinazione.

Per studiare quali percorsi erano associati al set di geni MVS-positivo e al set di geni MVS-negativo, abbiamo calcolato la correlazione di Spearman tra i punteggi dei set di geni MVS e i percorsi differenzialmente arricchiti precedentemente identificati usando i nostri dati scRNA-seq (Fig. 6d). La via più altamente correlata con il punteggio MVS e il set MVS-positivo era la “Segnalazione della risposta infiammatoria”, che era sorprendentemente sovraregolata nei monociti dopo la vaccinazione, insieme a CD14, FPR1, C5AR1, NAMPT, NLRP3, CDKN1A e IFNGR2. Considerando che, il set MVS-negativo era ben correlato con la “firma di citotossicità”, rappresentata dall’espressione di NKG7, CCL4, CST7, PRF1, GZMA, GZMB, IFNG e CCL3, significativamente diminuita in molti sottotipi di cellule T ma non in cellule NK dopo la vaccinazione (supplementare Fig. S3c).

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