La mancanza di ossigeno porta a più metastasi

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Le metastasi sono formate da cellule tumorali che si staccano dal tumore primario. Un gruppo di ricerca dell’Università di Basilea ha ora identificato la mancanza di ossigeno come fattore scatenante di questo processo.

I risultati rivelano un’importante relazione tra l’ apporto di ossigeno ai tumori e la formazione di metastasi. Questa ricerca potrebbe aprire nuove strategie di trattamento per il cancro.

Le possibilità di guarigione peggiorano significativamente quando un tumore metastatizza . Ricerche precedenti hanno dimostrato che le metastasi sono formate da gruppi di cellule tumorali che si separano dal tumore primario e migrano verso nuovi tessuti attraverso il flusso sanguigno.

Tuttavia, finora si sa poco sul motivo per cui questi gruppi di cellule tumorali circolanti (CTC) lasciano il tumore in primo luogo.

La mancanza di ossigeno porta a più metastasi

Il gruppo di ricerca del professor Nicola Aceto presso il Dipartimento di Biomedicina dell’Università di Basilea ha ora dimostrato che la mancanza di ossigeno è responsabile della separazione dei cluster CTC dal tumore.

Questo è un importante punto di partenza per lo sviluppo di nuovi trattamenti contro il cancro.

Un modello murino per il cancro al seno ha costituito la base degli esperimenti: i ricercatori hanno analizzato l’apporto di ossigeno all’interno di questi tumori, che sono equivalenti al tessuto canceroso umano, il distacco delle CTC e le loro proprietà biologiche molecolari e cellulari.

Si è scoperto che diverse aree di un tumore sono fornite con diversi livelli di ossigeno: le cellule cancerose con una mancanza di ossigeno sono state trovate ovunque il tumore avesse un numero relativamente inferiore di vasi sanguigni – nel nucleo del tumore e in aree periferiche chiaramente definite.

Successivamente, il team di ricerca ha studiato i cluster CTC che si erano separati da questi tumori e ha scoperto che soffrivano allo stesso modo di una mancanza di ossigeno.

Ciò ha portato alla conclusione che le cellule lasciano il tumore se non ricevono abbastanza ossigeno.

“È come se troppe persone fossero ammassate insieme in un piccolo spazio. Alcuni usciranno per trovare un po ‘d’aria fresca ”, dice Aceto.

Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che questi cluster CTC con una mancanza di ossigeno sono particolarmente pericolosi: rispetto ai cluster con normale contenuto di ossigeno, hanno formato metastasi più velocemente e hanno ridotto il tempo di sopravvivenza dei topi.

“Se un tumore non ha abbastanza ossigeno, questi cluster CTC, che hanno un potenziale particolarmente elevato di sviluppare metastasi, si staccano”, afferma Aceto.

Stimolare la formazione dei vasi sanguigni come approccio terapeutico

Questa intuizione ha portato i ricercatori a esaminare più da vicino l’effetto di quello che viene chiamato trattamento proangiogenico: hanno stimolato la formazione dei vasi sanguigni, aumentando così l’apporto di ossigeno alle cellule tumorali.

Come previsto, il numero di cluster CTC di separazione è diminuito, i topi hanno formato meno metastasi e hanno vissuto più a lungo, ma allo stesso tempo il tumore primario è aumentato di dimensioni in modo significativo.

“Questo è un risultato provocatorio”, afferma Aceto. “Se diamo abbastanza ossigeno al tumore, le cellule tumorali non hanno motivo di lasciare il tumore e metastatizzare. D’altra parte, questo accelera la crescita del tumore primario “.

La prossima sfida è trasferire questi risultati in un ambiente clinico, in cui le caratteristiche dei tumori variano da paziente a paziente: “Ma ipotizziamo che le sostanze che migliorano l’apporto di ossigeno al tumore possano inibire la formazione di metastasi nel cancro al seno, da solo o in combinazione con altri agenti. “


Più della metà dei tumori solidi presenta aree localmente ipossiche o anossiche rispetto al tessuto normale circostante [1]. L’ipossia è stata associata a metastasi e prognosi infausta in molti tumori, compreso il seno [1,2].

L’ipossia tumorale deriva da uno squilibrio tra l’ossigeno fornito alla nicchia tumorale e il suo consumo da parte delle cellule tumorali e delle cellule associate al tumore. L’ipossia si sviluppa nei tumori solidi primari a causa di molteplici fattori, tra cui l’aumento della distanza dal flusso sanguigno, l’indebolimento dell’integrità dei vasi e la competizione per l’ossigeno e le sostanze nutritive dal tumore adiacente e dalle cellule associate al tumore [1].

Sia le cellule tumorali che quelle normali rispondono a un ambiente ipossico attivando percorsi di segnalazione specifici che portano a distinti cambiamenti di espressione genica, tra i centri comuni più immediati e salienti la stabilizzazione dei fattori inducibili dall’ipossia, HIF-1α e HIF-2α [3] .

Nel cancro, l’HIF-1α stabilizzato attiva programmi trascrizionali che sono stati riconosciuti per indurre la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e supportare le metastasi in vari tipi di cancro [4–7]. I fattori di trascrizione indotti dall’ipossia e le vie di segnalazione includono Twist, Snail, ZEB1, Notch, TGF-β e Hedgehog, tra gli altri [6,8-14].

Inoltre, è stato dimostrato che l’HIF1-α e l’ipossia aumentano il fenotipo metastatico in più tipi di cellule tumorali, inclusi gli esperimenti in vivo sul cancro al seno, e sono stati collegati ad un aumento del rischio di metastasi e mortalità nelle coorti di pazienti con cancro al seno [7,15– 22].

Lo studio di come il microambiente del tumore ipossico contribuisce ad aumentare l’aggressività del cancro e il potenziale metastatico può fornire nuove strade terapeutiche.

L’ipossia e la successiva stabilizzazione di HIF-1α inducono cambiamenti metabolici a valle nelle cellule tumorali. Questi includono una maggiore espressione dei trasportatori del glucosio e dei geni coinvolti nella glicolisi, un metabolismo degli acidi grassi e dei lipidi alterato e una maggiore attività della piruvato deidrogenasi chinasi, riducendo così la quantità di piruvato che entra nel ciclo TCA e diminuendo la fosforilazione ossidativa [23-31].

Un ulteriore cambiamento metabolico è l’accumulo di glicogeno, che è stato precedentemente descritto in cellule cancerose e non cancerose [32-35] in condizioni ipossiche rispetto al loro stato normale. Sono stati impiegati diversi metodi per sfruttare le potenziali vulnerabilità che derivano dagli adattamenti dei tumori all’ipossia e hanno dimostrato di contribuire al controllo del tumore [36].

In questo studio, ci concentriamo su una più profonda comprensione delle potenziali vulnerabilità esibite dalla modulazione ipossica dell’omeostasi del glicogeno, effettuata da un delicato equilibrio tra sintetizzatori e degradatori del glicogeno.

Il glicogeno è un polisaccaride ramificato del glucosio ad alto peso molecolare ed è la principale macromolecola di immagazzinamento del glucosio negli animali [37]. Viene immagazzinato principalmente nel fegato dove viene utilizzato per mantenere i livelli di glucosio nel sangue e nei muscoli dove può essere mobilitato rapidamente per la produzione di energia durante l’esercizio [37].

Il glicogeno viene sintetizzato attorno a un nucleo di glicogenina mediante l’aggiunta di UDP-glucosio su catene di glicogeno in crescita. Il glucosio-1-fosfato disponibile nella cellula dal glucosio trasportato nella cellula o dai substrati gluconeogenici è catalizzato a UDP-glucosio da UDP-glucosio pirofosforilasi-2 (UGP2). L’UDP-glucosio viene aggiunto al glicogeno tramite un legame α-1,4 dalla glicogeno sintasi, l’enzima limitante la velocità nella sintesi del glicogeno [37].

Esistono due isoforme della glicogeno sintasi: GYS1 che è espressa principalmente nel fegato e l’isoforma muscolare GYS2. Durante la degradazione, le molecole di glucosio-1-fosfato vengono rimosse dall’estremità non riducente della molecola di glicogeno dalla glicogeno fosforilasi 37, l’enzima limitante la velocità della degradazione del glicogeno.

PYG ha tre diverse isoforme nell’uomo che sono tipicamente espresse in diversi tessuti: fegato (PYGL), muscoli (PYGM) e isoforme cerebrali (PYGB). Le molecole libere di glucosio-1-fosfato vengono quindi catalizzate a glucosio-6-fosfato, il primo intermedio nella glicolisi, dalla fosfoglucomutasi-1 (PGM1).

Per mantenere l’equilibrio del glucosio privo di glicogeno, glicogeno sintasi e glicogeno fosforilasi sono strettamente regolati. L’attività del glicogeno sintasi è regolata allostericamente e tramite modifiche post-traduzionali, ad esempio la fosforilazione. La fosforilazione della glicogeno sintasi da parte della glicogeno sintasi chinasi 3α e 3β (GSK3α / β) a più residui di serina inibisce la sua attività [38].

La glicogeno fosforilasi è attivata dalla fosforilazione in Ser-14 dalla fosforilasi chinasi [37] e dallo stimolatore allosterico glucosio-6-fosfato (G6P). È importante sottolineare che sia la glicogeno sintasi che la glicogeno fosforilasi sono regolate in sincronia dalla proteina fosfatasi-1 (PP1).

La defosforilazione PP1 attiva la glicogeno sintasi, ma inibisce la glicogeno fosforilasi, portando alla regolazione reciproca della sintesi e degradazione del glicogeno [37].

Alti livelli di glicogeno sono stati trovati in diversi tipi di cellule cancerose, inclusi i tumori al seno [39]. Recentemente, si è scoperto che i livelli di glicogeno erano inversamente correlati al tasso di proliferazione, indicando che il glicogeno era utilizzato come fonte di energia per sostenere la proliferazione [39].

Livelli elevati di glicogeno sono stati trovati anche nei nuclei tumorali ipossici e nei tumori trattati con terapie anti-angiogeniche [40]. È stato dimostrato che l’ipossia e la stabilizzazione di HIF-1α aumentano i livelli di molti enzimi del glicogeno e proteine ​​regolatrici tra cui UGP2, GYS1, GBE e PPP1R3C, la subunità regolatrice 3C associata al glicogeno di PP1 [35,41–43].

Inoltre, nel lavoro condotto da Favaro et al., È stato dimostrato che l’atterramento siRNA dell’isoforma epatica della glicogeno fosforilasi inibisce la proliferazione delle cellule di glioblastoma in condizioni di ipossia e induce senescenza in modo reattivo all’ossigeno specie-dipendente [40]. Mentre gli studi precedenti si sono concentrati sull’accumulo di glicogeno come protezione dall’ambiente ipossico avverso nel sito del tumore primario, il nostro lavoro mira a determinare la relazione tra l’accumulo di glicogeno e le riserve energetiche utilizzate per le metastasi guidate dall’ipossia.

In questo studio, abbiamo cercato di comprendere il legame tra il carburante fornito dall’accumulo di glicogeno indotto dall’ipossia nei tumori al seno aggressivi e la promozione dell’invasione e della migrazione. Abbiamo scoperto che sei diverse linee cellulari di cancro al seno e una linea di cellule epiteliali mammarie di tipo normale aumentavano tutte le loro riserve di glicogeno sotto ipossia.

Sono stati valutati anche i cambiamenti di espressione genica del glicogeno in ipossia, non trovando alcun cambiamento di consenso nell’espressione che spiegherebbe questo aumento, indicando che sono in atto altri mezzi di regolazione delle riserve di glicogeno, come la modifica post-traduzionale o la regolazione allosterica degli enzimi limitanti la velocità. . Per indagare su come la proliferazione, la migrazione e l’invasione sono influenzate dall’immagazzinamento e dall’utilizzo del glicogeno, abbiamo creato gli abbattimenti della glicogeno fosforilasi per le isoforme del PYG sia del fegato che del cervello.

Nelle due linee cellulari di cancro al seno, MDA-MB-231 e MCF-7, la perdita dell’isoforma cerebrale PYGB ha inibito l’uso del glicogeno ipossico mentre la perdita di PYGL e PYGB nella linea cellulare MCF-10A di tipo normale ha mostrato questo effetto. Il divieto dell’utilizzo del glicogeno ha determinato una marcata diminuzione della proliferazione nelle cellule MCF-10A e una leggera diminuzione nelle cellule MCF-7.

La guarigione delle ferite è risultata notevolmente ridotta nelle cellule shPYGB MCF-7 sia in condizioni normossiche che ipossiche. Sebbene la perdita di PYGB non abbia influenzato la proliferazione o la guarigione delle ferite delle cellule MDA-MB-231 di cancro al seno triplo negativo (TNBC), ha ridotto significativamente l’invasività di queste cellule.

Questi risultati indicano che attaccare le vulnerabilità del cancro derivate dalla disregolazione del metabolismo del glicogeno potrebbe essere una strategia terapeutica, non solo per rallentare la crescita del tumore come è stato precedentemente suggerito da altri lavori, ma anche per inibire lo sviluppo di metastasi a distanza nei tumori al seno come il TNBC, per cui esistono attualmente poche terapie mirate.

Discussione
È noto che l’ipossia aumenta la migrazione, l’invasione e le metastasi in una varietà di tumori, compresi i tumori al seno. L’ipossia induce anche l’accumulo di glicogeno nelle cellule tumorali, promuovendone la proliferazione, proteggendo le cellule dalle specie reattive dell’ossigeno e prevenendo la senescenza [34,39,40].

Qui mostriamo che diversi tipi di cellule di cancro al seno mostrano l’accumulo di glicogeno ipossico e l’utilizzo di questi depositi di glicogeno contribuisce alla proliferazione, migrazione e invasione.

Tutte le cellule di cancro al seno hanno testato un aumento delle riserve di glicogeno in risposta all’ipossia. Tuttavia, i livelli basali di glicogeno normossico e la quantità di glicogeno aumentano in condizioni di ipossia variavano ampiamente tra le linee cellulari, senza pattern distinguibili in base allo stato del recettore o al sottotipo.

Le cellule di cancro al seno infiammatorio hanno aumentato le loro riserve di glicogeno in risposta all’ipossia di oltre 10 volte più alte rispetto ad altri tipi di cellule di cancro al seno, suggerendo che gli interventi basati sull’inibizione dell’utilizzo del glicogeno possono essere più dannosi per questo sottotipo aggressivo di cancro al seno.

Nel complesso, questi dati indicano che i fenotipi del metabolismo del glicogeno nel cancro al seno possono variare ampiamente a seconda di ogni singolo tumore. Anche se non esiste un modello per il metabolismo del glicogeno che sia distinto per i biomarcatori del cancro al seno comunemente usati, i livelli relativi di glicogeno nelle biopsie dei pazienti possono essere determinati da un test istologico semplice e affidabile (colorazione PAS), facilitando così potenzialmente la selezione del paziente per interventi basati su metabolismo del glicogeno in futuro.

Inoltre, non abbiamo trovato una singola firma di espressione genica del glicogeno di consenso che spiegherebbe l’accumulo di glicogeno ipossico osservato nelle nostre cellule di cancro al seno, indicando che ci sarà un alto grado di eterogeneità nella regolazione dell’evento comune che descriviamo di accumulo di glicogeno in ipossia.

Precedenti studi hanno proposto che l’accumulo di glicogeno nelle cellule di cancro al seno sia dovuto all’aumento mediato da HIF1α nell’espressione di GYS1 e / o PPP1R3C nell’ipossia [42,43]. In accordo con quei risultati precedenti, abbiamo trovato un aumento dell’espressione di GYS1 nelle cellule MCF-7 e una maggiore espressione di PPP1R3C nelle cellule SUM-149 e MCF-10A normali; Tuttavia, cosa importante, troviamo che non vi è consenso sull’espressione genica correlata al glicogeno tra tutte le cellule di cancro al seno che porta all’aumento ipossico osservato del glicogeno.

Questo risultato è importante perché suggerisce che la modulazione delle reazioni di limitazione della velocità della sintesi o degradazione del glicogeno, piuttosto che interventi su bersagli a monte, avrebbe un’utilità più generale nel cancro al seno. Questo accumulo di glicogeno potrebbe anche essere causato dalla regolazione allosterica o dalla fosforilazione / defosforilazione degli enzimi che limitano la velocità del metabolismo del glicogeno.

Studi futuri dovranno determinare l’esatto meccanismo dell’accumulo di glicogeno ipossico basato sulla regolazione della glicogeno sintasi e della glicogeno fosforilasi e la possibile relazione con la stabilizzazione di HIF1α sotto ipossia nel cancro al seno, in modo dipendente dal contesto.

Indipendentemente dal meccanismo di accumulo di glicogeno ipossico, abbiamo inibito con successo l’utilizzo del glicogeno nel cancro al seno utilizzando shRNA knockdown delle isoforme glicogeno fosforilasi PYGL e PYGB. Il lavoro precedente nel campo si è concentrato esclusivamente sull’isoforma epatica della glicogeno fosforilasi [40].

Tuttavia, abbiamo determinato che l’isoforma cerebrale della glicogeno fosforilasi è principalmente responsabile della degradazione del glicogeno nelle cellule di cancro al seno MDA-MB-231 e MCF-7 ed entrambe le isoforme contribuiscono nelle cellule MCF-10A normali. Questa nuova scoperta dovrebbe informare i futuri studi sul metabolismo del glicogeno nel cancro al seno e in altri tumori per includere tutte le isoforme della glicogeno fosforilasi oltre all’isoforma epatica ben studiata.

L’inibizione dell’utilizzo del glicogeno ha portato anche a drastici cambiamenti fenotipici nelle cellule di cancro al seno in condizioni sia ipossiche che normossiche. La proliferazione è stata ridotta nelle cellule MCF-7 shPYGB e nelle cellule MCF-10A di tipo normale shPYGL e shPYGB, che corrisponde all’inibizione dell’utilizzo del glicogeno osservata in queste cellule.

Nella linea cellulare di cancro al seno ER + MCF-7, la guarigione delle ferite è stata inibita anche nelle cellule shPYGB. I test di guarigione delle ferite misurano la capacità delle cellule di muoversi e crescere verso l’esterno da un’area di popolazione cellulare densa. Senza la capacità di utilizzare il glicogeno, le cellule MCF-7 non erano in grado di chiudere la ferita in modo efficiente come le cellule di controllo o shPYGL.

Questo effetto non è stato osservato nelle cellule MCF-10A epiteliali mammarie non cancerose e normali, indicando che l’uso del glicogeno per promuovere la migrazione è un fenotipo specifico del cancro e quindi una possibile vulnerabilità.

Inoltre, nelle cellule TNBC MDA-MB-231, l’inibizione dell’utilizzo del glicogeno da parte del knockdown del PYGB ha portato a una significativa diminuzione del potenziale invasivo, riaffermando l’importanza dell’isoforma cerebrale, PYGB, nel favorire le cellule tumorali rispetto a fenotipi più aggressivi basati sul glicogeno potenziato disponibilità.

Mentre tutte le cellule mammarie testate hanno aumentato lo stoccaggio di glicogeno in condizioni di ipossia, l’utilizzo del glicogeno, promosso dall’isoforma cerebrale della glicogeno fosforilasi, PYGB, influenza i fenotipi di migrazione e invasione solo nelle cellule tumorali e non nelle cellule epiteliali normali. Questi risultati suggeriscono che il PYGB sia un potenziale nuovo bersaglio per ridurre l’invasività e le metastasi dei tumori al seno.

Il lavoro futuro si concentrerà sulla ricapitolazione di questi risultati in vitro in studi in vivo su xenotrapianto di tumori e metastasi, nonché sullo studio degli effetti antimetastatici dei trattamenti con inibitori del glicogeno fosforilante, come ingliforib [46].

link di riferimento: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0220973


Ulteriori informazioni:  Cell Reports  (2020). DOI: 10.1016 / j.celrep.2020.108105

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